Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.
Bananflue Drosophila melanogaster er en av de fremste modellorganismer for å studere funksjonen og utviklingen av immunforsvaret. Mange aspekter av medfødt immunitet er bevart mellom insekter og pattedyr, og siden Drosophila kan lett være genetisk og eksperimentelt manipulert, de er kraftig for å studere immunsystemets funksjon og de fysiologiske konsekvensene av sykdommen. Prosedyren demonstrert her kan smitte av fluer ved innføring av bakterier direkte inn i kroppens hulrom, utenom epitelceller barrierer og mer passive former for forsvar og la fokus på systemisk infeksjon. Prosedyren omfatter protokoller for måling ratene vert dødelighet, systemisk patogen belastning, og graden av stimulering av vertens immunsystem. Denne infeksjonen fremgangsmåten er billig, robust og kvantitativt repeterbar, og kan bli brukt i studier av funksjonelle gener, evolusjons liv historie, og fysiologi.
Frukten fly Drosophila melanogaster er en av de fremste modellorganismer for å studere funksjonen og utviklingen av immunforsvaret. Drosophila er billig og lett å bak, er svært mottagelig for eksperimentell manipulasjon, og er støttet av et omfattende vitenskapelige samfunn som har utviklet en bred rekke forskningsverktøy. Mange aspekter av medfødt immunitet er bevart mellom insekter og pattedyr, inkludert signaltransduksjon mediert av Toll-lignende reseptorer og NF-kB familie transkripsjonsfaktorer, JAK / STAT signale og JNK pathway svar. 1,2 Funksjonen til disse genene og trasé kan spørres i D. melanogaster bruker mutasjoner eller RNAi nedslaging som øker eller reduserer pathway aktiviteter. 3 – 6 tillegg Drosophila kan brukes til å studere fysiologiske konsekvensene av smitte og sykdom, blant annet i forbindelse med evolusjonslivshistorieteori 7.– 9 Alle slike studier har imidlertid avhenge av evnen til pålitelig infisere eksperimentelle fluer under definerte behandlingsforhold. Prosedyren er beskrevet her presenterer et metodisk rammeverk for å levere robuste og repeterbare bakterielle infeksjoner i Drosophila melanogaster og deretter måle infeksjon alvorlighetsgrad og kvantifisere vertens immunrespons.
Drosophila kan være naturlig og eksperimentelt infisert med et bredt spekter av parasitter og patogener, inkludert bakterier, sopp, virus, nematoder og parasitoid veps. Den nåværende protokoll er fokusert på å levere systemisk bakterieinfeksjon. Mange forskjellige bakterier kan brukes til å infisere fluer, og eksperimentators valget bør være basert på presise vitenskapelige spørsmålene som stilles. For eksempel kan kliniske isolater være ansatt for å studere bakterie virulensmekanismer 10, eller økologisk relevante isolater kan være preferred for evolusjonære studier. 11 Noen bakterier er kompetente patogener av D. melanogaster, prolifererende på infeksjon og forårsaker vert sykdom eller død. Andre bakterier er effektivt håndtert av vertsimmunsystemet og fjernet i løpet av få dager. I denne demonstrasjonen blir Providencia rettgeri bli brukt som en proliferativ patogen som kan føre til verten dødelighet og vedvarer i overlevende verter. Escherichia coli brukes som en ikke-patogen som er klarert av vertens immunsystem.
Infeksjon vil bli etablert ved innføring av bakterier direkte inn i kroppshulrom av fly. Denne tilnærmingen forbigår epitel-barrierer og beskyttende atferd, slik at undersøkelse av systemisk infeksjon uavhengig av den naturlige modus for overføring. Det er to primære metoder for eksperimentelt å etablere systemisk infeksjon. I den første, en nanoinjector og trukket glass kapillære nåler brukes for å injisere et nøyaktig antallbakterier i fly. Denne metode har den fordel at de muliggjør et stort dynamisk område av infeksjonsdoser og for å være kvantitativt høyt repeterbare. Den andre metoden er å levere infeksjon med et septisk nålestikk. Denne tilnærmingen har den fordelen av å være hurtig og krever ikke noe spesielt utstyr. Når infeksjoner er etablert, blir det mulig å måle systemisk patogen belastning, vert dødelighet, og induserbar immunsystemaktivitet. Selvfølgelig kan en hvilken som helst rekke ekstra fenotyper tenkes å bli målt i infisert D. melanogaster, inkludert post-infeksjon fruktbarhet 12, læringsevne 13, metabolske status 14, eller nesten alle andre trekk som kan tenkes.
Fremgangsmåten som er beskrevet her gir streng og høy kvalitet infeksjon av Drosophila melanogaster. De illustrerte eksempler primært fokusert på infeksjon med Providencia rettgeri og E. coli, men protokollen er svært fleksibel og kan påføres på infeksjoner med ulike bakterier over et område av verts oppdrett og vedlikeholdsforhold.
Detaljene i en optimal eksperimentell tilnærming vil avhenge av bakterien anvendt for infeksjon, genotypen til verten, og den samlede forsøksbetingelser. Det anbefales sterkt å pilottest noen nye eksperimentelle forhold før oppstart av mer ambisiøse prosjekter. Et godt utgangspunkt er å teste tre infeksjons doser over en 100-fold range. Sterkt virulente patogener blir ofte best innføres ved meget lave infeksiøse doser i størrelsesorden 10 til 100 bakterieceller pr flue. Mer moderate patogener kan injiseres ved høyere doser av rundt 1.000 bakterier per fly, og som ikke er patogener kan injiseres i doser så høye som 10 000 bakterier pr flue. Det er ofte instruktivt å definere kinetikken av nye infeksjoner ved å spore patogen belastning, vert dødelighet, og immunsystemet aktivitet over en langsgående tidsserie. På grunn måling av patogen belastning og vert genekspresjon er destruktive analyser, er det nødvendig å infisere forskjellige fluer ved begynnelsen av eksperimentet for hvert tidspunkt som skal måles.
Ved avgjørelsen av om å bruke stikk eller microcapillary basert injeksjon, er det viktig å være oppmerksom på det er fordeler og begrensninger til hver tilnærming. Kapillær injeksjons introduserer et volum av væske i fly, noe som både øker turgor beskjedent trykk og innfører salter eller andre molekyler som er suspendert eller oppløst i bæreren. Kapillær injeksjon krever også tilgang til en injeksjonsanlegget eller kjøp av nødvendig utstyr. Septic stikk krever ingen spesiell utstyr og introdusererubetydelig media inn i fly, og er vanligvis mer effektivt for å infisere et stort antall fluer. Imidlertid ikke pinprick infeksjoner ikke tillate nøyaktig kontroll over infeksjon dose som kan oppnås med kapillær injeksjon. Denne protokoll fokusert på et injeksjonsapparat som mekanisk regulerer injeksjonsvolum, men det er også innsprøytingssystemer basert på diskrete pulser av trykkluft. 20,21 Disse er vanligvis dyrere enn anordningen omtalt her, og krever kalibrering av luftpuls til hvert nål for å sikre konsistente injeksjonsvolumer.
Det er stor debatt, men svært lite data om hvordan fluene blir systemisk infisert med bakterier i naturen. Noen forskere posit at flertallet av naturlige infeksjoner oppstår når Drosophila svelges patogene bakterier og bakterier er deretter i stand til å unnslippe tarmen for å etablere en systemisk infeksjon. Men det er veldig few bakterier som er kjent for å være i stand til å krysse tarm av D. melanogaster, og de som har denne evnen er svært dødelig for fluer 22,23. En alternativ teori er at flyr regelmessig oppholder cuticular skader gjennom flukt fra mislykkede predasjon forsøk eller angrep av ektoparasittiske midd. Denne hypotesen er understøttet av den hyppige samlingen av vill D. melanogaster peiling melanization flekker som er en indikasjon på leget sårene (upubliserte observasjoner). Midd har vist seg å overføre bakterieinfeksjoner i Drosophila 24 og sårene etter midd kan sekundært infisert av bakterier i honning bier 25. Imidlertid frekvensen i naturen av midd-drevet eller på annen måte opportunistisk infeksjon av D. melanogaster gjennom skjel brudd er ikke kjent. Protokollen er beskrevet her tillater innføring av bakterier direkte inn i hemolymph gjennom kvantitative injeksjon som omgår noen epitelceller barrierer eller atferds immunofluorescensNITY. Metoder for fôring patogene bakterier til D. melanogaster er blitt beskrevet i Vodovar et al. 22 og Nehme et al., 23.
Mange entomopathogenic bakterier utgjør liten eller ingen menneskelig helserisiko, slik at forskere til å jobbe med dem komfortabelt. Videre er det svært få bakterier har evnen til å infisere Drosophila på kontakt uten eksperimentell inngrep, slik at risikoen for "epidemisk" spredning av bakteriell infeksjon ved et laboratorium via kontaminerte overflater eller rømt fluer er vanligvis meget lav. Likevel, er det tilrådelig å sikre at tilstrekkelige inneslutningstiltakene er på plass for å hindre at smittede fluer slipper unna og for å gjenerobre noen rømte fluer. Laboratoriet skal være utstyrt med en biologisk sikkerhetsnivå i samsvar med det av patogener som brukes, og standard beste praksis i mikrobiologi bør benyttes.
Den eksperimentelle infectipå metoden beskrevet her gir infeksjoner i Drosophila melanogaster med enhver dose av vilkårlig bakterien. Når infeksjon har blitt etablert, er det enkelt å måle kinetikken av bakteriell spredning eller klaring, for å spore vert dødelighet, og å analysere induksjon av vertens immunsystem. Infiserte fluer kan lett bli utsatt for andre fenotypisk analyser, inkludert tester av fysiologiske funksjoner som kan form eller være formet av infeksjonen. Prosedyrene som beskrives er billig, krever relativt lite spesialutstyr, og er lett lært, noe som gjør dem mottagelig for bruk i ulike prosjekter over en bredde av forsknings- og undervisningslaboratorier.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.
Reagent | Company | Part Number |
Incubator | Powers Scientific, Inc | DROS52SD |
Paintbrush | ||
CO2 Flypads | FlyStuff | 59-114 |
CO2 | Airgas | CD FG50 |
Drosophila rearing mix | ||
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 |
Nosterile Extra Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-882 |
Microscope | Olympus Corporation | SZ51 |
Drosophila Vials polystyrene | VWR international | 89092-720 |
Nosterile Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-883 |
2L flask | VWR international | 89000-370 |
Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm; | VWR international | 25384-302 |
LB Agar, Miller | Difco | 244520 |
Innoculing Loop | VWR international | 80094-488 |
Rainin Clasic Pipettes in various sizes 0.1 µl to 2 µl, 2 µl to 20 µl, 20 µl to 200 µl, 100 µl to 1000 |
Rainin | PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000 |
Micropipette tips (assorted sizes) | VWR international | 30128-376 53503-810 16466-008 |
Luria Broth Base, Miller | Difco | 241420 |
Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass | VWR international | 47729-576 |
S-500 Orbital Shaker | VWR international | 14005-830 |
centrifuge | VWR international | 37001-300 |
PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 |
SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 |
Semimicrovolume Cuvettes | Bio-Rad | 223-9955 |
Vertical Capillary Puller | Kopf Needle Pipette Puller | |
3.5'' Replacement glass Capillaries for Nanojet II | Drummond Sientific Company | 3-000-203-G/X |
Nanoject II | Drummond Sientific Company | 3-000-204 |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
10mL Syringe | BD | 309604 |
Mineral Oil, White, light | Macron Fine Chemicals | 6358-10 |
minutein pins | Fine Science Tools | 26002-10 |
1.5mL Microcentrifuge tubes; Seal Rite | USA Scientific Inc. | 1615-5500 |
Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer | Troemner | 103 |
Talboys High Throughput Homogenizer | OPS Diagnostics | 930145 |
5/32'' Grinding Balls | OPS Diagnostics | GBSS 156-5000-01 |
Vortex Genie | Scientific indurstries inc. | G560 |
Multichannel Pipettor (10uL-300uL) | Sartorius | 730360 |
WASP2 Whitley Automated Spiral Plater | Microbiology International | |
ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader | Microbiology International | |
TRIzol | Life Technologies | 15596-026 |
qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips | Bio-Rad | TLS0801 |
qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips | Bio-Rad | TCS0803 |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | m610a |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | m170b |
dNTPs | Promega | U1240 |
Oligo-dT | IDT | |
SsoAdvanced SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5260 |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5200 |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2115 |