This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.
Parnings experiment med Drosophila har i hög grad bidragit till förståelsen av sexuell selektion och beteende. Experiment kräver ofta enkla, enkla och billiga metoder för att skilja mellan individer i en rättegång. En standardteknik för detta är CO 2 anestesi och sedan märka eller Vingklippning varje fluga. Detta är dock invasiv och har visats påverka beteendet. Andra tekniker har använt färgning för att identifiera flugor. I denna artikel presenteras en enkel och icke-invasiv metod för märkning Drosophila som gör att de kan identifieras individuellt inom experiment, med hjälp av karamellfärg. Denna metod används i prövningar där två hanar konkurrerar att para sig med en hona. Färgning tillät snabb och enkel identifiering. Det fanns emellertid en viss skillnad i styrkan av färgn över de tre testade arterna. Data presenteras som visar färgen har en lägre påverkan på parningsbeteende än CO2 i Drosophila MelanoGaster. Effekterna av CO2 anestesi visar sig bero på arter av Drosophila, med D. pseudo och D. subobscura visar ingen påverkan, medan D. melanogaster hanar hade minskat parning framgång. Metoden färgämne som presenteras är tillämplig på ett brett spektrum av experimentell design.
Under de senaste decennierna har det ökat intresse för hur sexuell selektion och konkurrens mellan manlig påverkan på evolutionen 1,2. Experiment på parningsbeteende har spelat en viktig roll i att utveckla och testa teorier om sexuell selektion 3,4. I synnerhet forskning med hjälp arter av släktet Drosophila, har starkt bidragit till förståelsen av sexuell selektion och beteende. Det är emellertid viktigt att undersöka om vanligen använda tekniker kan artificiellt förspänna resultaten av standardparningsexperiment 5,6.
Anestesi används ofta för hantering och identifiering i experiment 7. Exempelvis flugor vanligen samlas före parning, eller sorteras i genotyper eller experimentella behandlingar med koldioxid (CO 2) bedövningsmedel. I experiment där två eller flera personer måste särskiljas, är det vanligt att söva den fltalet och klipp en del av vingen av för att identifiera varje individ eller behandlingsgrupp 5,8. Det är viktigt dock att förstå hur CO 2 behandling påverkar beteendet. Effekten av CO 2 anestesi har undersökts i Drosophila melanogaster där hannar utsatt för CO2 tog betydligt längre tid att para sig och totalt hade lägre parning framgång än icke-nedsövd män eller män bedövades med hjälp exponering för kyla 5. Denna effekt observerades både när anestesi applicerades på dagen för experimentet och när flugor gavs en dag för att återhämta sig. Dock var denna studie begränsad endast undersöker prövningar där en enda hane presenterades för varje hona 5. Ett mer realistiskt scenario är att en kvinnlig att stöta flera hanar 9,10, vilket gör konkurrensen mellan hanar, vilket kan göra det möjligt att upptäcka mer subtila förluster av manliga kondition på grund av anestesi. Användningen av CO2 anestesi har ocksåsv visat sig minska fruktsamhet och livslängd vuxna D. melanogaster när de utsätts strax efter eclosion, vilket är vanligt vid insamling oskuld flyger 11.
Ett alternativ till CO 2 anestesi är att markera flugor genom att mata dem mat färgad med färgämnet 4,6,10,12,13. Detta färgämne in tarmarna i farten och är synlig genom buken, vilket gör färgade flugor ska skiljas från ofärgade flugor, eller från flugor märkta med en annan färg. Metoder skiljer sig i hur detta kan tillämpas: läggs direkt till livsmedelsindustrin 12, via färgat kompletterande jäst pasta 6, eller via exponering för en roman färgade livsmedel substrat 13. Dessa tekniker märkning tycks visa någon effekt på parning prestanda 4,6. Men ett papper direkt undersöker effekterna av samma karamellfärg på vuxna D. melanogaster hittat en stark minskning av livslängden 14. Tidigare arbete har också fokuserat almOST helt på D. melanogaster, både när det gäller effekterna av CO 2 anestesi 5,11 och karamellfärg 14 metoder. För närvarande finns det inte mycket information om hur CO2 anestesi eller användning av tarm färg påverkar parningsbeteende andra Drosophila.
Följande studien utvärderar effekten av CO 2 anestesi på parningsbeteende tre arter av Drosophila (D. melanogaster, D. pseudo, och D. subobscura). Effekten av att samla flugor på CO2 undersöktes i både singel och två manliga parning prövningar. Effekten av CO 2 har också visat sig variera i D. melanogaster 5 och så olika latens perioder mellan exponering för CO2 och parning testades. En alternativ märkningsmetod för anestesi och vingklippning: användningen av livsmedelsfärger att färga flugorna utvärderas också.
Dessa data visar att effekten av CO2 anestesi är inkonsekvent mellan arter, med två av tre arter som visar liten påverkan. Våra resultat tyder på märkning med livsmedelsfärg hade en lägre påverkan på manlig parning framgång än CO 2 anestesi för D. melanogaster. Dessa experiment visar att livsmedelsfärger kan lätt och billigt kan användas för att märka flugor för parning analyser involverande multipla hanar.
Av de tre modell Drosophila arter undersökas, bara D. melanogaster visade en effekt av CO 2 anestesi på parning prestanda i en konkurrenssituation. Däremot ingen av arterna visade en effekt av samlingen på gas i enstaka parning prövningar i form av parnings latens, i motsats till tidigare resultat för D. melanogaster 5. Effekten av konkurrens kan därför lyfta mer subtila fitness effekter av CO 2 anestesi, som endast detekterbaraenligt situationer där det finns hane-hane konkurrens. Exponering vid tidig samling och en dag före rättegången ha en negativ effekt på förmågan hos hanar av D. melanogaster att få en parning. Exponering två dagar före rättegången men inte visade någon effekt. Både D. pseudo och D. subobscura visade inte någon effekt av exponering för gas i någon av försöken. En förklaring är att D. melanogaster var sårbart för tidig exponering för CO2 eftersom det måste samlas tidigare i livet (0-6 tim gammalt) än de andra arterna att säkerställa hanar är nyproducerade. Följaktligen manliga D. melanogaster i denna ålder kan vara mer känsliga som nagelbanden av flugan fortfarande härdning, jämfört med de andra arter som har haft längre för deras nagelband att hårdna. I allmänhet stöder denna idén att effekterna av CO 2 anestesi är artspecifika och utredare bör lämpligt testa effekten i sina djurslag. Currently, majoriteten av arbetet på effekten av CO 2 anestesi har genomförts på Drosophila melanogaster 5,11,22 och kan därför inte vara lämpligt att gälla andra besläktade arter.
Den alternativa icke-invasiv metod presenteras för differentiera flugor är livsmedelsfärg. Resultaten tyder på denna behandling hade ingen effekt på över alla arter undersökas. Men medan dess användning var framgångsrik i att tillhandahålla en billig och väl synlig markör för att skilja mellan individer bör det noteras att färgämnet var lättare att urskilja i D. pseudo och D. subobscura än i D. melanogaster. Föregående författare har använt flera färger (röd, grön och blå) 4,6. Vi hittade blå färg för att vara det enklaste att skilja på alla arter, särskilt D. pseudo och D. subobscura. Använda flera färger skulle potentiellt tillåta mer komplexa experiment med många individuellt märkta flies. Men preliminära tester av olika färgämnen är viktigt, eftersom vissa livsmedelsfärger misslyckas att färga flugorna, möjligen som rötas när konsumeras. Andra färgämnen kan ha toxiska effekter och minska överlevnaden av flugorna, och bör undvikas 14). Alternativa mat färgmetoder som använder dyrare fläckar har också använts för att pröva tarm integriteten för D. melanogaster 23. Dessa kan utgöra ett alternativ, även om dyrare, färgning metod 23.
Färgämnet Metoden är lika snabb som CO2 vingklippning som flugor kan lagras på färgade mat från samlingen. Upptag av maten var snabb (~ 3 h), så förvaring O / N på färgad mat skulle också vara tillräckligt för att markera flugor, som används i andra studier 6. Dock är längden på färg relativt korta (~ 4-5 timmar) jämfört med vingklippning (permanent) eller fluorescerande damm-märkning (10-12 dagar) 24. Som Drosophila artervarierar i utseende, kommer olika färgämnen vara mer eller mindre effektiva för olika arter, och som vissa stammar (t.ex. knock-out mutanter) kan vara sårbara för förändringar i kost, all användning av färgämne kräver ett preliminärt test av dess effektivitet särskilt om längre långvarig exponering för färgämnen kan vara giftiga 14. I motsats till studien av Kalaw et al. 14, fann vi ingen signifikant dödlighet efter lagring i flera dagar på färgade livsmedel för D. melanogaster (3 dagar), D. pseudo (5 dagar), eller D. subobscura (7 dagar), förmodligen på grund av skillnaden i färg som används.
Det kritiska steget för framgångsrik användning av färgämnet tekniken är steg 1,5, validera att den valda färgen fungerar bra med art och stam som används. En alternativ teknik innebär att tillämpa färgade damm på utsidan av flugan före användning i fältförsök 24. Denna metod har använts för att spåra individer i fält på grund to varaktighet märkning och hur lätt massmärkning flyger 24. Även om vi inte har uttryckligen testat denna metod i parningsförsök, skulle det vara viktigt att undersöka eventuella effekter som damm kan ha på sinnena viktiga i parning, särskilt i Drosophila 25, 26. I arter, men där tarm färgning inte är möjligt, dessa metoder kan vara lämpliga.
Sammanfattningsvis fann vi att i två av de tre testade arterna (D. pseudo och D. subobscura) sågs ingen effekt hittas av antingen CO 2 anestesi eller karamellfärg på parningsförmåga hanar. För D. melanogaster en negativ effekt på CO2 anestesi upptäcktes, men karamellfärg påverkade inte parning framgång i denna art. Sammantaget ger färgämnet metoden en enkel och billig icke-invasiv metod för att identifiera individuella Drosophila som är likvärdig eller bättre än metoder som kräver CO 2 anestesi. Detär sannolikt denna metod skulle fungera i en rad arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Alex Hitchen och Meg Booth för deras hjälp med parningsförsök. Detta arbete stöddes av NERC bidrag NE / H015604 / 1 till TP.
Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
Fine mesh | Any haberdashery | – | Fine curtain mesh is suitable |
1ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | – | Other dye colours and brands can have variable results. |
CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |