This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.
Parring eksperimenter ved hjelp Drosophila har bidratt sterkt til forståelsen av seksuell seleksjon og atferd. Eksperimenter krever ofte enkle, enkle og billige metoder for å skille mellom individer i en rettssak. En standard teknikk for dette er CO 2 anestesi og deretter merking eller vinge klipping hvert fly. Men dette er invasiv og har blitt vist å påvirke virkemåten. Andre teknikker er brukt for å identifisere fargen fluer. Denne artikkelen presenterer en enkel og ikke-invasiv metode for merking Drosophila som tillater dem å være individuelt identifisert innen eksperimenter, ved hjelp av konditorfarge. Denne metoden brukes i forsøk hvor to hanner konkurrerer om å parre seg med en kvinne. Farging lov rask og enkel identifisering. Det var imidlertid en viss forskjell i styrken av fargen på de tre undersøkte arter. Dataene presenteres viser fargestoff har en lavere innvirkning på parring atferd enn CO 2 i Drosophila MelanoGaster. Virkningen av CO 2 anestesi er vist å være avhengig av arten av Drosophila, med D. pseudoobscura og D. subobscura viser ingen effekt, mens D. melanogaster menn hadde redusert parring suksess. Fargestoffet metoden presentert er anvendbar på et vidt spekter av eksperimentelle design.
I løpet av de siste tiårene har det vært økende interesse for hvordan seksuell seleksjon og konkurranse mellom hannene innvirkning på utviklingen 1,2. Eksperimenter på paringsatferd har spilt en viktig rolle i å utvikle og teste teorier om seksuell seleksjon 3,4. Spesielt forskning ved hjelp av arter i slekten Drosophila, har bidratt sterkt til forståelsen av seksuell seleksjon og atferd. Imidlertid er det viktig å undersøke hvorvidt vanlig brukte teknikker kan kunstig påvirke resultatene av standard passende eksperimenter 5,6.
Anestesi er ofte brukt for håndtering og identifikasjon i eksperimenter 7. For eksempel er fluer ofte samles før parring, eller sorteres i genotyper eller eksperimentelle behandlinger med karbondioksid (CO 2) bedøvelse. I forsøk hvor to eller flere personer må skilles, er det vanlig praksis å bedøve flkaper og klippet en del av vingen av for å identifisere hver enkelt eller behandlingsgruppe 5,8. Det er avgjørende, men for å forstå hvordan CO 2 behandling vil påvirke virkemåten. Effekten av CO 2 anestesi har blitt undersøkt i Drosophila melanogaster der hanner utsatt til CO 2 tok betydelig lengre tid å pare seg og hadde samlet lavere parring suksess enn ikke-bedøvet menn eller menn bedøvet ved hjelp eksponering for kulde 5. Denne effekten ble observert både når anestesi ble påført på dagen for eksperimentet, og når fluer ble gitt en dag å komme seg. Men denne studien var begrenset i bare undersøke studier der en enkelt mann ble presentert for hver kvinnelig 5. Et mer realistisk scenario er for en kvinne å møte flere hanner 9,10, slik at konkurransen mellom hanner, som kan tillate påvisning av mer subtile tap av mannlige fitness på grunn av anestesi. Bruken av CO 2 anestesi har ogsåno funnet å redusere fruktbarhet og lang levetid av voksen D. melanogaster når de blir utsatt kort tid etter eklosjonshormon, som er vanlig når du samler jomfru flyr 11.
Et alternativ til CO 2 anestesi er å markere fluer ved å mate dem mat farget med fargestoff 4,6,10,12,13. Dette fargestoff trer tarmen på flua og er synlig gjennom magen, slik at fargede fluer skal skilles fra ufargede fluer, eller mot fluer merket med en annen farge. Metoder skiller i hvordan dette kan brukes: blir lagt direkte til mat 12, via farget supplerende gjær pasta 6, eller via eksponering til en roman farget mat underlaget 13. Disse merke teknikker synes å vise noen effekt på paring ytelse 4,6. Imidlertid, et papir direkte å undersøke effekten av den samme konditorfarge på voksen D. melanogaster funnet en sterk reduksjon i levetid 14. Tidligere arbeid har også fokusert almost helt på D. melanogaster, både med hensyn til effekten av CO 2 anestesi 5,11 og konditorfarge 14 metoder. Foreløpig er det lite informasjon om hvordan CO 2 anestesi eller bruk av intestinal farge påvirker parring oppførselen til andre Drosophila.
Den følgende studien evaluerer effekten av CO 2 anestesi på parring oppførselen til tre arter av Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura og D. subobscura). Effekten av å samle fluer på CO 2 ble undersøkt i både single og to mannlige parringsforsøk. Virkningen av CO 2 har også blitt funnet å variere i D. melanogaster 5 og så forskjellige latensperioder mellom eksponering for CO 2 og parring ble testet. Et alternativ merking metode til anestesi og vinge klipping: bruk av mat fargestoffer å farge fluene er også vurdert.
Disse dataene viser at effekten av CO 2 anestesi er inkonsekvent mellom arter, med to av tre arter som viser liten effekt. Våre resultater tyder på merking med mat fargestoff hadde en lavere innvirkning på mannlig parring suksess enn CO 2 anestesi for D. melanogaster. Disse eksperimentene demonstrerer at matvarefargestoffer kan enkelt og billig kan brukes til å merke fluer for sammenpassende analyser som involverer flere menn.
Av de tre modell Drosophila arter undersøkt, bare D. melanogaster viste en effekt av CO 2 anestesi på parring ytelse i en konkurransesituasjon. I motsetning til dette ble ingen av de arter viste en effekt av samlingen av gass i enkelt parring forsøk i form av sammenpassende ventetid, i motsetning til tidligere resultater for D. melanogaster 5. Effekten av konkurranse kan derfor fremheve mer subtile fitness virkningene av CO 2 anestesi, som er bare påviseshenhold til situasjoner der det er manns mannlig konkurranse. Eksponering ved tidlig samling og en dag før rettssaken ha en negativ effekt på evnen til hanner av D. melanogaster å få en parring. Eksponering to dager før rettssaken imidlertid ikke vise noen effekt. Både D. pseudoobscura og D. subobscura viste ingen virkning av eksponering for gass i noen av forsøkene. En forklaring er at D. melanogaster var sårbare for tidlig eksponering for CO 2 fordi det må samles tidligere i livet (0 – 6 timer gammel) enn de andre artene for å sikre menn er jomfru. Derfor mannlig D. melanogaster i denne alderen kan være mer følsomme som skjellaget på flua er fortsatt herding, sammenlignet med de andre artene som har hatt lenger for deres hårstråene å stivne. Generelt, støtter denne ideen om at effekten av CO 2 anestesi er artsspesifikke og undersøkere bør hensiktsmessig teste effekten i sine målartene. Currently, mesteparten av arbeidet på effekten av CO 2 anestesi har blitt utført på Drosophila melanogaster 5,11,22 og kan derfor ikke være riktig å legge til andre beslektede arter.
Den alternative ikke-invasiv metode presentert for å differensiere fluer er mat fargestoff. Resultatene tyder på denne behandlingen hadde ingen effekt på tvers undersøkt alle artene. Imidlertid, mens bruken lyktes i å gi en billig og lett synlig markør for å skille mellom individer det bør bemerkes at fargestoffet var lettere å skille i D. pseudoobscura og D. subobscura enn i D. melanogaster. Forrige forfattere har brukt flere farger (rød, grønn og blå) 4,6. Vi fant blå farge for å være den enkleste å skille i alle arter, spesielt D. pseudoobscura og D. subobscura. Bruk av flere farger ville potensielt tillate mer komplekse eksperimenter med mange individuelt merket flies. Men foreløpige tester av ulike fargestoffer er viktig, som noen mat fargestoffer ikke klarer å farge fluene, muligens blir fordøyd når det forbrukes. Andre fargestoffer som kan ha en toksisk virkning og redusere overlevelse av fluer, og bør unngås 14). Alternative konditorfarge metoder ved hjelp av dyrere flekker har også blitt brukt for å undersøke tarm integritet for D. melanogaster 23. Disse kan gi et alternativ, selv om dyrere, farging metode 23.
Fargestoffet metoden er like rask som CO 2 vinge klipping som fluer kan lagres på farget mat fra samlingen. Opptak av maten var hurtig (~ 3 timer), slik at lagrings O / N på farget mat vil også være tilstrekkelig til å markere fluer, som anvendt i andre studier 6. Imidlertid er varigheten av farge relativt kort (~ 4-5 timer) sammenlignet med vinge klipping (permanent) eller fluorescerende støv markering (10 – 12 dager) 24. Som Drosophila artervariere i utseende, vil forskjellige fargestoffer være mer eller mindre effektiv for forskjellige arter, og som noen stammer (f.eks knockout-mutanter) kan være utsatt for endringer i dietten, en hvilken som helst bruk av fargestoff krever en preliminær test av dens effektivitet spesielt hvis lengre tids eksponering for fargestoffer kan være giftig 14. I motsetning til studiet av Kalaw et al. 14, fant vi ingen signifikant mortalitet etter lagring i flere dager på fargede matvarer for D. melanogaster (3 dager), D. pseudoobscura (5 dager), eller D. subobscura (7 dager), sannsynligvis på grunn av forskjellen i fargestoff som brukes.
Det kritiske trinnet for vellykket bruk av fargestoffet teknikk er trinn 1.5, validering at den valgte fargestoff fungerer godt med arten og stamme som benyttes. En alternativ teknikk er å anvende farget støv til utsiden av flue før bruk i feltforsøk 24. Denne fremgangsmåten har blitt brukt for å spore individer i felten på grunn av to varigheten av merking og enkel massemerking flyr 24. Selv om vi ikke er eksplisitt testet denne metoden i sammenpassende forsøk, ville det være viktig å undersøke eventuelle virkninger som støv kan ha på sansene viktige i parring, særlig i Drosophila 25, 26. I arter, men hvor intestinal farging ikke er mulig, Disse metoder kan være egnet.
I konklusjon fant vi at i to av de tre artene som ble testet (D. pseudoobscura og D. subobscura) var det ingen effekt funnet av enten CO 2 anestesi eller konditorfarge på parring evne hanner. For D. melanogaster en negativ effekt av CO 2 anestesi ble oppdaget, men konditorfarge påvirket ikke parring suksess i denne arten. Samlet gir fargestoffmetoden en enkel og billig, ikke-invasiv metode for å identifisere individuelle Drosophila som er tilsvarende eller bedre enn de fremgangsmåter som krever CO 2 anestesi. Deter sannsynlig denne metoden vil fungere på tvers av en rekke arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Alex Hitchen og Meg Booth for deres hjelp med paring prøvelser. Dette arbeidet ble støttet av NERC stipend NE / H015604 / 1 til TP.
Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
Fine mesh | Any haberdashery | – | Fine curtain mesh is suitable |
1ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | – | Other dye colours and brands can have variable results. |
CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |