Vi beskriver en fremgangsmåde til ex vivo maskine perfusion af humane lever transplantater ved subnormothermic temperatur (21 ° C).
There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.
Lever transplantation er den eneste helbredende behandling for titusinder af patienter, der lider af slutstadiet leversygdom. For at lette en vellykket transplantation, optimal bevarelse af leveren fra den tid, det er indkøbt fra donoren og til den er implanteret i modtageren er nødvendigt for at forhindre hurtig forværring af transplantatet. Den nuværende standard for leveren konservering kaldes "statisk fryselager«: leveren afkøles i en iskold konservering løsning, og derved reducere stofskiftet i leveren og bremse de skadelige virkninger af iskæmi. Selv om denne køle- teknik har gjort det muligt for en vellykket transplantation, organer marginal kvalitet som DCD organer beskadiget af varme iskæmi eller steatose show ringere patient resultater 1. Der er en hastigt voksende mængde af beviser, som ex vivo maskine perfusion af leveren transplantater som alternativ konservering modalitet kan potentielt imbevise resultater for disse marginale organer 2,3.
Lever transplantation er blevet et offer for sin egen succes. Langt flere patienter henvises til transplantation, end der er lever rådighed, og tusinder dør på ventelisten i USA hvert år. I betragtning af den virkelighed af donor leveren mangel og den stigende udnyttelse af leveren transplantater af suboptimal kvalitet til trængende modtagere, er det en udbredt opfattelse, at ex vivo maskine perfusion af leveren transplantater før implantation giver løfte om et paradigmeskift i levertransplantation. Der har været en markant stigning i forskning interesse i dette emne i de seneste år 4-8. I forskellige europæiske og nordamerikanske centre hypotermisk maskine perfusion har foretaget en klinisk introduktion 8 og normotermisk maskine perfusion ved fysiologiske temperaturer er for nylig blevet anvendt på kasserede menneskelige lever og bliver oversat til klinisk brug samt 9.Omfattende udvikling har ført til udviklingen af forskellige protokoller, mens kontinuerlig optimering identificerer den optimale perfusion parametre 10-12. Anvendelse af marginal kvalitet podninger er steget mere end 10 gange i det seneste årti 13. Sammenlignet med den nuværende standard for leveren konservering (statisk kølerum), ex vivo maskine perfusion giver mange potentielle fordele, som alle resulterer i tiltrængt udvidelse af orglet pool og et potentielt fald i forekomsten af post-transplantations komplikationer. Især galde komplikationer, der i øjeblikket plager suboptimal kvalitet lever transplantater efter transplantation forblive en væsentlig faktor 14-18.
Machine perfusion ved subnormothermic betingelser giver et tidsvindue til at vurdere transplantatfunktion objektivt som til egnethed til transplantation 19. Mens leveren bliver perfunderet i en ex vivo kredsløb, både perfusatet ennd kan tages prøver af galde produceret under perfusion til måling af markører for organfunktion. På denne måde "alvorligt kompromitteret" lever, der er kasseret til transplantation under de nuværende kriterier kan vurderes objektivt om deres egnethed til transplantation. Levedygtighed vurdering potentielt giver mulighed for mange af disse organer, som skal anvendes til transplantation. En lige så kraftfuld fordel af maskinens perfusion er reparation og forbedring af lever, der er blevet beskadiget af varm / kold iskæmi. ATP er tømt meget hurtigt under varmt og efterfølgende kold iskæmi og kan repleted i en periode på maskine perfusion før implantation af leveren 20. Leveren, med sin energi butikker og metabolisk tilstand genopfyldes er forkonditioneres og bedre forberedt på de skadelige virkninger af reperfusionsskade efter implantation i modtageren.
Dette arbejde beskriver en fremgangsmåde til ex vivo maskine perfusion af human lever grafts i laboratoriet, som vil være nyttige for forskere, der ønsker at studere både teknikken og gavnlige virkninger af ex vivo maskine perfusion. Vi gør brug af menneskelige donorer lever, der er faldet til transplantation og derefter afsat til forskningsformål.
Standard lever indkøb teknik indebærer in situ arteriel flush af leveren efter aorta cross-fastspænding i hjernen døde donorer (DBD) eller efter kredsløbssygdomme anholdelse i kredsløbssygdomme død donorer (DCD), som er beskrevet mere detaljeret andetsteds 20. Derudover er leveren afkøles under isoleringen ved at fylde donorens bughulen med is. Skyl løsning præferencer varierer mellem regioner, med de fleste indkøb ved hjælp af University of Wisconsin eller histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK) løsning. En yderligere back-tabel flush af portvenen forbedrer udvaskning af overskydende blod. Lever ofte indkøbes forlader en aorta segment surafrunding af cøliaki stammen. Galdeblæren indsnit, galde aspireres, og galdegangen skylles. De lever er pakket i sterile poser med iskold bevarelse løsning og transporteres i udpegede kasser eller kølere. For repræsentative resultater varm og kold iskæmi tid bør begrænses til 60 min og 12 hr hhv. Trods rutinemæssige serologiske screening for overførbare patogener, skal standard forholdsregler skal træffes, når uddele menneskelige organer, prøver fra menneskelige organer og eventuelle affaldsstoffer.
Protokollen her beskriver subnormothermic maskine perfusion ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt lever perfusion enhed. Anvendelse af en sådan anordning muliggør hurtigere oversættelse til det kliniske miljø og krydsvalidering af forskellige protokoller og enhedsindstillinger blandt forskningsgrupper og transplantationscentre.
I et forsøg på at genvinde lever såret under iskæmi udviklede vi en SNMP system, der kan anvendes efter en periode med kold opbevaring. Subnormothermic maskine perfusion tilbyder et levedygtigt alternativ til konventionel fryselager, samt hypotermiske og normotermiske maskine perfusion modaliteter. Der findes forskellige systemer; alle tilbyder forskellige fordele og ulemper 3,9,20. SNMP tillader perfusion uden ilt bærer, som metaboliske oxygenbehov ved 21 ° C opfyldes ved aktiv iltning af perfusatet.
Selvom reduceret under subnormothermic betingelser, stofskifte er væsentlig og kræver støtte fra en næringsrig perfusionsopløsning. Traditionelle perfusionsopløsninger såsom Belzer maskine perfusion opløsning, er generelt minimal i sammensætning og er beregnet til koldt perfusion. Williams 'Medium E er blevet brugt som en hepatocyt dyrkningsmedium i mange år, og indeholder Components der er universelle for at støtte cellefunktion, især under varme ex vivo forhold.
Målinger foretaget i maskine perfusion er reflekterende af funktionen af orglet. Direkte observerbare parametre såsom galde produktion og iltoptagelse er realtidsmålinger, der kan anvendes til at vurdere leveren før transplantation. Ligeledes kan måles markører for cellulær skade og iskæmi (K +, lactat frigivelse) direkte i perfusionsopløsningen og kan være tegn på organfunktion 20. Som maskine perfusion teknologi udvikler sig yderligere og opnår mere udbredt klinisk anvendelse, kan præcise sammenhænge mellem ex vivo funktion og kliniske resultater skal foretages, og perfusion parametre vil være nyttige i medvirken beslutninger at omplante eller afvise marginal kvalitet lever. Som punkt-pleje analyseredskaber forvejen, vil mere avanceret analyse bliver tilgængelige direkte under maskinen perfuning 21.
I dette arbejde viser vi, at lever kan støttes i SNMP-system med minimal skade på leveren, hvilket afspejles ved histologi og frigivelse af ALT. Funktionel genopretning af leveren er bedst til udtryk i ATP, som har vist sig at korrelere til leveren levedygtighed og er stærkt tyder på transplantation succes i dyremodeller 22. Ex vivo og præ-transplantation inddrivelse af leveren transplantater ville tillade en betydelig udvidelse af donoren liver pool, korrigere forskellen mellem udbud og efterspørgsel af donor lever i transplantation.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra det amerikanske National Institutes of Health (tilskud R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 og F32 DK103500), CIMIT projekt nr 12-1732 og Shriners Hospitals for Children er taknemmeligt anerkendt. Vi vil gerne takker New England Organ Bank for at understøtte dette arbejde.
Liver Assist perfusion device | Organ Assist B.V. | Liver Assist | |
Liver Assist disposable set | Organ Assist B.V. | Liver Assist disposable | |
Williams’ Medium E | Sigma | W1878–6x500ml | |
Insulin | Eli Lilly & Co | Humulin R U-100 | |
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml | Life Technologies | 15070-063 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-156 | |
Hydrocortisone | MGH pharmacy | 7750500 | |
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2 | Airgas | ZO2OX9522000043 | |
Specialty gas regulator | Airgas | Y11244D580 | |
Lactated Ringer’s solution | Baxter | 2B2324X | |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | 316-155 | |
Toothed Adson forceps | Roboz | RS-5234 | |
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm | Roboz | RS-7562 | |
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten | Roboz | RS-6965SC | |
Castroviejo Needle holder 5.5–7” | Fine Science Tools | 12565-14 | |
0 blackbraided silk sutures | Ethicon | SA66G | |
4-0 nylon suture, Nurolon RB1 | Ethicon | C554D | |
Blood gas analysis machine | Siemens | RapidPoint 500 | |
Balance scale | Cole Parmer | EW-10000-12 | |
Pressure display box | Medtronic | 66000 | |
Disposable pressure display sets | Medtronic | 61000 | |
Handheld thermocouple thermometer and probe | Cole Parmer | EW-91500-04 and EW-08516-55 | |
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm | Medtronic | 30005 | |
Irrigation set flush tubing | Hospira | 06543-01 | |
Mixing bowl, 4L | Cole Parmer | EW-07300-40 |