אנו מתארים שיטה של זלוף המכונה vivo לשעבר של שתלי כבד אנושיים בטמפרטורת subnormothermic (21 מעלות צלזיוס).
There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.
השתלה כבד היא הטיפול המרפא רק לעשרות אלפי חולים הסובלים ממחלת כבד סופנית. כדי להקל על השתלה מוצלחת, שימור אופטימלי של הכבד מרגע שהוא רכש מן התורם עד למועד זה הוא מושתל במקבל הוא הכרחי על מנת למנוע הידרדרות מהירה של השתל. הסטנדרטי לשימור כבד הנוכחי נקרא "קירור סטטי ': הכבד הוא מקורר בפתרון שימור קר כקרח, ובכך להפחית את חילוף החומרים של הכבד ולהאט את ההשפעות המזיקות של איסכמיה. למרות שטכניקת אחסון קרה זו אפשרה להשתלה מוצלחת, איברים של איכות שולית כגון איברי DCD נפגעו איסכמיה החמה או חולה נחות תכנית steatosis תוצאות 1. ישנו גוף המתרחב במהירות של ראיות שזלוף המכונה vivo לשעבר של שתלי כבד כשיטת שימור חלופית עלולים imלהוכיח תוצאות עבור איברים השוליים אלה 2,3.
השתלה כבד הפכה לקורבן של ההצלחה שלה. הרבה יותר חולים מופנים להשתלה ממה שיש כבדים זמינים, ואלפים מתו ברשימת ההמתנה בארצות הברית בכל שנה. בהתחשב במציאות של המחסור הכבד תורם וניצול הגובר של שתלי כבד של איכות לא טובה למקבלי נזקקים, הוא מוחזק באופן נרחב שזלוף המכונה vivo לשעבר של שתלי כבד לפני ההשתלה מקיים את ההבטחה של שינוי פרדיגמה בהשתלת כבד. חל עלייה ניכרה בעניין מחקרי בנושא זה בשנים האחרונות 4-8. במרכזים באירופה ובצפון אמריקה שונים זלוף מכונה היפותרמיה הפך לאחרונה זלוף מכונה קליני הקדמת 8 וnormothermic בטמפרטורות פיסיולוגיות הוחל כבדים אנושיים שהושלכו והוא מתורגם לשימוש קליני, כמו גם 9.פיתוח נרחב שהוביל לפיתוח של פרוטוקולים שונים, תוך אופטימיזציה מתמדת מזהה את זלוף האופטימלי פרמטרי 10-12. שימוש בשתלים שולית באיכות גדל יותר פי 10 בעשור האחרון 13. בהשוואה לתקן הנוכחי לשימור כבד (אחסון קר סטטית), זלוף המכונה vivo לשעבר מספק יתרונות פוטנציאליים רבים, אשר כולם לגרום לנחוצה הרחבת בריכת האיברים ועלולים להיות ירידה בשכיחות של סיבוכים לאחר ההשתלה. בפרט, סיבוכי המרה שסובלים כיום שתלי כבד הכי מוצלחת באיכות לאחר ההשתלה יישארו בעיה משמעותית 14-18.
זלוף מכונת בתנאי subnormothermic מספק חלון זמן כדי להעריך את תפקוד שתל באופן אובייקטיבי לעניין התאמה להשתלה 19. שני perfusate בעוד הכבד הוא להיות perfused במעגל vivo לשעבר,nd ניתן לדגום המרה המיוצרת במהלך זלוף למדידת סמנים של תפקוד איבר. בדרך זו "קשה התפשר" כבדים שמושלכים להשתלה תחת הקריטריונים הנוכחיים ניתן להעריך באופן אובייקטיבי כלהתאמתם להשתלה. הערכת כדאיות פוטנציאלית מאפשרת לרבים מאיברים אלה כדי להיות מנוצלים לצורך ההשתלה. יתרון חזק באותה מידה של זלוף מכונה הוא תיקון ושיפור של כבדים שניזוקו על ידי איסכמיה החמה / קרה. ATP מתרוקן בקצב מהיר מאוד באיסכמיה הקרה חמה ולאחר מכן וניתן repleted בתקופה של זלוף מכונה לפני ההשתלה של הכבד 20. הכבד, עם מאגרי האנרגיה שלה ומצב מטבולים מתחדש, הוא preconditioned ומוכן יותר להשפעות המזיקות של פגיעת reperfusion לאחר ההשתלה בנמען.
עבודה זו מתארת שיטה של זלוף המכונה vivo לשעבר של גרף כבד אנושיts במעבדה, אשר תהיה שימושי לחוקרים המבקשים ללמוד גם את הטכניקה והשפעות מיטיבות של vivo לשעבר זלוף מכונה. אנו עושים שימוש בכבדי תורם אנושיים שנדחו להשתלה ולאחר מכן הוקצו למטרות מחקר.
טכניקת רכש כבד סטנדרטית כרוכה בסומק עורקים באתרו של הכבד הבא הידוק צולב אב העורקים בתורמי המוח מתים (DBD) או לאחר מעצר דם בתורמי דם מוות (DCD), תיארו בפירוט רב יותר במקום אחר 20. בנוסף, הכבד הוא מקורר במהלך הרכש על ידי מילוי חלל הבטן של התורם עם קרח. העדפות פתרון סומק להשתנות בין האזורים, עם רוב הרכישות באמצעות אוניברסיטת ויסקונסין או פתרון היסטידין טריפטופן-ketoglutarate (HTK). שטיפה-שולחן נוספת של וריד השער משפרת את שטיפת דם שייר. כבד לעתים קרובות נרכשים עוזב sur קטע של אב העורקיםעיגול תא מטען צליאק. כיס המרה היא חרות, מרה היא aspirated, ואת צינור המרה הוא הסמיק. הכבדים ארוזים בשקיות סטרילית המכילות פתרון שימור קר כקרח ומועברים בקופסות או קירור ייעודיים. לקבלת תוצאות נציג זמן איסכמיה החמה וקר צריך להיות מוגבל ל 60 דקות ושעה 12, בהתאמה. למרות הקרנה סרולוגיות שגרתית לפתוגנים transmissible, יש לנקוט באמצעי זהירות סטנדרטי בעת מסירת איברים אנושיים, דגימות שהתקבלו מאיברים אנושיים, וכל חומרי פסולת.
הפרוטוקול כאן מתאר זלוף המכונה subnormothermic באמצעות מכשיר זלוף הכבד זמין מסחרי. שימוש במכשיר כזה מאפשר לתרגום מהיר יותר להגדרה הקלינית ואימות צולבת של פרוטוקולים שונים והגדרות מכשיר בין קבוצות מחקר ומרכזי השתלות.
בניסיון לשחזר את הכבדים נפצעו במהלך איסכמיה פיתחנו מערכת SNMP שיכול להיות מועסק לאחר תקופה של אחסון קר. זלוף המכונה Subnormothermic מציע חלופה לאחסון קונבנציונלי קר, וכן דרכי זלוף המכונה היפותרמיה וnormothermic. מערכות שונות קיימות; כולם מציעים יתרונות וחסרונות שונים 3,9,20. SNMP מאפשר לזלוף ללא ספק חמצן, כדרישות חמצן מטבולים בגיל 21 מעלות צלזיוס הם נפגשו על ידי חמצון פעיל של perfusate.
למרות מופחת בתנאי subnormothermic, חילוף חומרים הוא משמעותי ודורש התמיכה של פתרון זלוף עשיר בחומרים מזינים. פתרונות זלוף מסורתיים, כגון פתרון זלוף המכונה בלזר, הם בדרך כלל מינימאליים בהרכב ומיועדים לזלוף הקר. 'וויליאמס בינוני E שמשה כמדיום תרבות hepatocyte במשך שנים רבות, והוא מכיל גomponents שהם אוניברסליים לתמיכה בפונקציה סלולרית, בפרט בתנאים חמים vivo לשעבר.
מדידות שנעשו במהלך זלוף מכונה הם שיקוף של הפונקציה של האיבר. פרמטרים ישירות נצפים כגון ייצור מיצי מרה וספיגת חמצן הם מדידות בזמן אמת, שניתן להשתמש כדי להעריך את הכבד לפני ההשתלה. באופן דומה, סמנים של פגיעה ואיסכמיה (K +, שחרור חומצת החלב) סלולריות ניתן למדוד באופן ישיר בפתרון זלוף ועשויה להצביע על תפקוד איבר 20. ככל שטכנולוגיה מתפתחת זלוף מכונה נוספת ומשיגה יישום קליני נרחב יותר, מתאמים מדויקים בין פונקצית vivo לשעבר ותוצאה קלינית יכולים להתבצע ופרמטרי זלוף יהיו שימושיים בסיוע להחלטות להשתלת כבד או לדחות שולית באיכות. יתר על כן, כנקודה-התקדמות כלים אנליטיים טיפול, ניתוח מתוחכם יותר יהיה זמין ישירות במכונת perfuשיאון 21.
בעבודה זו אנו מראים כי יכולים להיות נתמכים על כבדים במערכת SNMP עם פגיעה מינימאלית בכבד, המשתקפים בהיסטולוגיה ושחרורו של ALT. התאוששות תפקודית של הכבד מתבטאת הטובה ביותר על ידי ATP, אשר נמצאה במיתאם לכדאיות כבד והוא מאוד מרמז על הצלחת השתלה במודלים של בעלי חיים 22. Ex vivo והתאוששות לפני השתלה של שתלי כבד יאפשר הרחבה משמעותית של התורם בריכה כבד, תיקון הפער בין ההיצע והביקוש של כבדי תורם בהשתלה.
The authors have nothing to disclose.
מימון מהמכון הלאומי האמריקאי לבריאות (מעניק R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 וDK103500 F32), CIMIT פרויקט מס '12-1732 ובתי החולים Shriners לילדים הוא הודה בהכרת תודה. ברצוננו להודות בהכרת תודה בנק האיברים ניו אינגלנד לתמיכה בעבודה זו.
Liver Assist perfusion device | Organ Assist B.V. | Liver Assist | |
Liver Assist disposable set | Organ Assist B.V. | Liver Assist disposable | |
Williams’ Medium E | Sigma | W1878–6x500ml | |
Insulin | Eli Lilly & Co | Humulin R U-100 | |
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml | Life Technologies | 15070-063 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-156 | |
Hydrocortisone | MGH pharmacy | 7750500 | |
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2 | Airgas | ZO2OX9522000043 | |
Specialty gas regulator | Airgas | Y11244D580 | |
Lactated Ringer’s solution | Baxter | 2B2324X | |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | 316-155 | |
Toothed Adson forceps | Roboz | RS-5234 | |
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm | Roboz | RS-7562 | |
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten | Roboz | RS-6965SC | |
Castroviejo Needle holder 5.5–7” | Fine Science Tools | 12565-14 | |
0 blackbraided silk sutures | Ethicon | SA66G | |
4-0 nylon suture, Nurolon RB1 | Ethicon | C554D | |
Blood gas analysis machine | Siemens | RapidPoint 500 | |
Balance scale | Cole Parmer | EW-10000-12 | |
Pressure display box | Medtronic | 66000 | |
Disposable pressure display sets | Medtronic | 61000 | |
Handheld thermocouple thermometer and probe | Cole Parmer | EW-91500-04 and EW-08516-55 | |
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm | Medtronic | 30005 | |
Irrigation set flush tubing | Hospira | 06543-01 | |
Mixing bowl, 4L | Cole Parmer | EW-07300-40 |