Vi beskriver en fremgangsmåte for ex vivo maskin perfusjon av humane levertransplantater ved subnormothermic temperatur (21 ° C).
There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.
Levertransplantasjon er den eneste kurativ behandling for titusener av pasienter som lider av end-stage leversykdom. For å lette vellykket transplantasjonen, optimal konservering av leveren fra det tidspunkt den blir anskaffet fra donor før det tidspunkt den blir implantert i mottakeren er nødvendig for å hindre rask forverring av transplantatet. Den nåværende standard for leveren konservering er betegnet "statisk kjølelager ': leveren ble avkjølt på et is-kald bevaring løsning, for derved å redusere metabolismen av leveren og bremse ned de skadelige virkninger av iskemi. Selv om denne kjølelager teknikk har gjort det mulig for vellykket transplantasjon, organer av marginal kvalitet som DCD organer skadet av varm iskemi eller steatosis showet dårligere pasient utfall en. Det er en raskt voksende mengde bevis som ex vivo maskin perfusjon av lever grafts som et alternativ bevaring modalitet kan potensielt imbevise utfall for disse marginale organer 2,3.
Levertransplantasjon har blitt et offer for sin egen suksess. Langt flere pasienter blir henvist for transplantasjon enn det er lever tilgjengelige, og tusenvis dø på ventelisten i USA hvert år. Gitt realiteten av donor lever mangel og den økende utnyttelse av lever grafts av suboptimal kvalitet for trengende mottakere, er det en utbredt oppfatning at ex vivo maskin perfusjon av lever grafts før implantasjon holder løftet om et paradigmeskifte i levertransplantasjon. Det har vært en markant økning i forskningsinteresse i dette emnet de siste årene 4-8. I ulike europeiske og nordamerikanske sentre hypotermisk maskin perfusjon har gjort en klinisk innføring 8 og normotermisk maskin perfusjon ved fysiologiske temperaturer har nylig blitt brukt til kasserte menneskelige lever og blir oversatt til klinisk bruk samt ni.Omfattende utvikling har ført til utvikling av ulike protokoller, mens kontinuerlig optimalisering identifiserer den optimale perfusjon parametere 10-12. Bruk av marginal kvalitet grafts har økt mer enn 10 ganger i løpet av det siste tiåret 13. Sammenlignet med dagens standard for leveren bevaring (statisk kald lagring), gir ex vivo maskin perfusjon mange potensielle fordeler, som alle fører til sårt tiltrengt utvidelse av orgelet basseng og potensielt nedgang i forekomsten av post-transplantasjons komplikasjoner. Spesielt galle komplikasjoner som for tiden plager suboptimal kvalitet levertransplantater etter transplantasjon forblir et betydelig problem 14-18.
Maskin perfusjon ved subnormothermic forhold gir et tidsvindu for å vurdere organfunksjon objektivt om det er passende for transplantasjon 19. Mens leveren blir perfusert i en ex vivo-krets, både perfusatet ennd galle som produseres i løpet av perfusjon kan prøves for måling av markører for organfunksjon. På denne måten «alvorlig kompromittert 'lever som er forkastet for transplantasjon under de gjeldende kriterier objektivt kan vurderes i forhold til deres egnethet for transplantasjon. Levedyktighet vurdering tillater potensielt mange av disse organer til å bli utnyttet for transplantasjon. En like kraftig fordel av maskin perfusjon er reparasjon og forbedring av lever som har blitt skadet av varm / kald iskemi. ATP er oppbrukt meget hurtig under varme og påfølgende kald ischemi og kan repleted i løpet av en periode på maskin perfusjon før implantering av leveren 20. Leveren, med sine energi butikker og metabolske tilstand etterfylles, er preconditioned og bedre forberedt for de skadelige effektene av reperfusjonsskade etter implantasjon i resipienten.
Dette arbeid beskriver en fremgangsmåte for ex vivo maskin perfusjon av human lever grafts i laboratoriet, som vil være nyttig for forskere som ønsker å studere både teknikk og gunstige effektene av ex vivo maskin perfusjon. Vi gjør bruk av menneskelige donor lever som har blitt avvist for transplantasjon og deretter avsatt til forskningsformål.
Standard leveren anskaffelse teknikk involverer in situ arteriell innfelt i leveren etter aorta kryssklem i hjernedød donorer (DBD) eller etter sirkulasjons arrest i sirkulasjonsdøds donorer (DCD), beskrevet i mer detalj et annet sted 20. I tillegg er leveren avkjølt under anskaffelses ved å fylle donor bukhulen med is. Flush løsning preferanser varierer mellom regioner, med de fleste av anskaffelser ved hjelp av University of Wisconsin eller Histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) løsning. En ekstra back-tabellen flush av portalen blodåre forbedrer utvasking av blodrester. Lever ofte anskaffet forlater en aortic segment suravrunding cøliaki stammen. Galleblæren er radert, galle er aspirert, og galle duct spyles. Leveren er pakket i sterile poser som inneholder iskald bevaring løsning og transporteres i utpekte bokser eller kjølere. For representative resultater varm og kald ischemi tiden bør være begrenset til 60 minutter og 12 timer, henholdsvis. Til tross for rutine serologisk screening for smittsomme patogener, må vanlige forholdsregler tas når levere menneskelige organer, eksempler hentet fra menneskelige organer, og eventuelle avfallsprodukter.
Protokollen her beskriver subnormothermic maskin perfusjon med en kommersielt tilgjengelig leverperfusjon enhet. Bruk av en slik enhet sørger for raskere oversettelse til klinisk setting og kryss-validering av ulike protokoller og enhetsinnstillinger blant forskningsmiljøer og transplantasjonssentre.
I et forsøk på å gjenopprette lever skadet under iskemi utviklet vi et SNMP system som kan brukes etter en periode med kald lagring. Subnormothermic maskin perfusjon tilbyr et levedyktig alternativ til konvensjonell kjølelager, samt hypotermiske og normotermisk maskin perfusjon modaliteter. Ulike systemer eksisterer; alle har ulike fordeler og ulemper 3,9,20. SNMP tillater perfusjon uten oksygenbærer, som metabolske oksygen krav på 21 ° C er oppfylt ved aktiv oksygenering av perfusatet.
Selv om redusert under subnormothermic forhold, er stoffskiftet betydelig og krever støtte fra et næringsrikt perfusjon løsning. Tradisjonelle perfusjon oppløsninger, slik som Belzer maskinen perfusjon oppløsning, er generelt minimal i sammensetning og er utformet for kald perfusjon. Williams Medium E har vært brukt som en hepatocytt kulturmedium i mange år, og inneholder components som er universelle for å støtte cellular funksjon, særlig i henhold varme ex vivo forhold.
Målinger ble gjort under maskinens perfusjon er representativ for den funksjon av organet. Direkte observerbare parametre som galle produksjon og oksygenopptak er virkelige tidsmålinger som kan brukes for å vurdere lever pre-transplantasjon. På samme måte kan markører for cellulær skade og iskemi (K +, laktat release) måles direkte i perfusjon løsning og kan være en indikasjon på organfunksjon 20. Som maskin perfusjon teknologien utvikler videre og oppnår mer utbredt klinisk anvendelse, kan nøyaktige korrelasjoner mellom ex vivo funksjon og klinisk resultat gjøres og perfusjon parametere vil være nyttig i å hjelpe beslutninger til transplantasjon eller avvise marginal kvalitet lever. Videre, som point-of omsorg analyseverktøy forhånd, vil mer sofistikert analyse bli tilgjengelig direkte under maskin perfusjon 21.
I dette arbeidet viser vi at lever kan støttes i SNMP-system med minimal skade på leveren, reflekteres av histologi og frigjøring av ALT. Funksjonell gjenvinning av leveren er best reflektert fra ATP, som har blitt vist å korrelere til leveren levedyktighet og er sterkt tyder på transplantasjon suksess i dyremodeller 22. Ex vivo og pre-transplantasjon utvinning av levertransplantater ville tillate en betydelig utvidelse av donor leveren basseng, korrigere misforhold mellom tilbud og etterspørsel av donor lever i transplantasjon.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra det amerikanske National Institutes of Health (bevilger R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 og F32 DK103500), CIMIT prosjekt nr 12-1732 og Shriners Hospitals for Children er takknemlig erkjent. Vi vil gjerne takke for den New England Organ Bank for å støtte dette arbeidet.
Liver Assist perfusion device | Organ Assist B.V. | Liver Assist | |
Liver Assist disposable set | Organ Assist B.V. | Liver Assist disposable | |
Williams’ Medium E | Sigma | W1878–6x500ml | |
Insulin | Eli Lilly & Co | Humulin R U-100 | |
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml | Life Technologies | 15070-063 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-156 | |
Hydrocortisone | MGH pharmacy | 7750500 | |
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2 | Airgas | ZO2OX9522000043 | |
Specialty gas regulator | Airgas | Y11244D580 | |
Lactated Ringer’s solution | Baxter | 2B2324X | |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | 316-155 | |
Toothed Adson forceps | Roboz | RS-5234 | |
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm | Roboz | RS-7562 | |
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten | Roboz | RS-6965SC | |
Castroviejo Needle holder 5.5–7” | Fine Science Tools | 12565-14 | |
0 blackbraided silk sutures | Ethicon | SA66G | |
4-0 nylon suture, Nurolon RB1 | Ethicon | C554D | |
Blood gas analysis machine | Siemens | RapidPoint 500 | |
Balance scale | Cole Parmer | EW-10000-12 | |
Pressure display box | Medtronic | 66000 | |
Disposable pressure display sets | Medtronic | 61000 | |
Handheld thermocouple thermometer and probe | Cole Parmer | EW-91500-04 and EW-08516-55 | |
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm | Medtronic | 30005 | |
Irrigation set flush tubing | Hospira | 06543-01 | |
Mixing bowl, 4L | Cole Parmer | EW-07300-40 |