Descreve-se um método de perfusão ex vivo máquina de enxertos de fígado humano à temperatura subnormothermic (21 ° C).
There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.
O transplante de fígado é o único tratamento curativo para dezenas de milhares de pacientes que sofrem de estágio final da doença hepática. Para facilitar o transplante bem sucedido, preservação óptima do fígado a partir do momento em que é obtido a partir do dador, até o momento em que são implantadas no receptor é necessário para evitar a deterioração rápida do enxerto. A norma actual para preservação fígado é denominado «armazenamento frio estático ': o fígado é arrefecida numa solução de preservação gelada, reduzindo, assim, o metabolismo do fígado e abrandar os efeitos deletérios da isquemia. Embora esta técnica de armazenamento a frio tem permitido para transplante bem-sucedido, os órgãos de qualidade marginal, como órgãos DCD danificadas por isquemia quente ou esteatose mostra paciente inferior resultados 1. Há um corpo em rápida expansão de evidências de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado como uma modalidade alternativa de preservação pode, potencialmente, improvar os resultados para esses órgãos marginais 2,3.
O transplante de fígado tornou-se vítima do seu próprio sucesso. Far mais pacientes são encaminhados para transplante do que há fígados disponíveis, e milhares morrem na lista de espera nos Estados Unidos a cada ano. Dada a realidade da escassez de doadores de fígado e à crescente utilização de enxertos de fígado de qualidade abaixo do ideal para os destinatários carentes, é amplamente difundida de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado antes da implantação mantém a promessa de uma mudança de paradigma no transplante de fígado. Houve um aumento acentuado no interesse em pesquisas sobre este tema nos últimos anos 08/04. Em vários centros europeus e norte-americanos máquina de perfusão hipotérmica fez uma introdução 8 e normotérmica perfusão clínica máquina a temperaturas fisiológicas foi recentemente aplicada aos fígados humanos descartados e está sendo traduzido para o uso clínico, bem 9.Extenso desenvolvimento conduziu ao desenvolvimento de vários protocolos, enquanto a optimização contínua identifica a perfusão óptima parâmetros 10-12. O uso de enxertos marginal de qualidade aumentou mais de 10 vezes ao longo da última década 13. Quando comparado com o padrão atual para a preservação do fígado (armazenamento a frio estático), ex vivo máquina de perfusão proporciona inúmeros benefícios potenciais, os quais resultam em expansão muito necessária para a piscina do órgão e um potencial diminuição na incidência de complicações pós-transplante. Em particular, as complicações biliares que atualmente afligem enxertos hepáticos abaixo do ideal de qualidade após o transplante continuam a ser um problema substancial 14-18.
Máquina de perfusão em condições subnormothermic fornece uma janela de tempo para avaliar a função do enxerto objetivamente como a aptidão para o transplante de 19. Enquanto o fígado está a ser perfundido num circuito ex vivo, tanto a um perfusadond a bile produzida durante a perfusão podem ser degustados para medição de marcadores de função do órgão. Desta forma "gravemente comprometida" fígados que são descartados para transplante de acordo com os critérios atuais podem ser objetivamente avaliados quanto à sua adequação para transplante. Avaliação da viabilidade permite potencialmente que para muitos destes órgãos a serem utilizadas para o transplante. Um igualmente poderoso benefício da máquina de perfusão é o reparo e melhoria de fígados que foram danificados por isquemia quente / frio. ATP está esgotado muito rapidamente durante a isquemia fria quente e posterior e pode ser repleted durante um período de máquina de perfusão antes da implantação do fígado 20. O fígado, com suas reservas de energia e estado metabólico reabastecido, está pré-condicionado e melhor preparados para os efeitos prejudiciais de lesão de reperfusão após o implante no receptor.
Este trabalho descreve um método de máquina de perfusão ex vivo de fígado humano grafts em laboratório, o que será útil para pesquisadores que desejam estudar tanto a técnica e os efeitos benéficos do ex vivo máquina de perfusão. Nós fazemos uso de fígados de doadores humanos que tenham sido recusados para o transplante e depois são alocados para fins de investigação.
Norma técnica procurement fígado envolve em resplendor arterial situ do fígado após o pinçamento no cérebro doadores mortos (DBD) ou após a parada circulatória em doadores circulatórios morte (DCD), descritos em mais detalhes em outro lugar 20. Além disso, o fígado é resfriado durante a aquisição através do preenchimento da cavidade abdominal do doador com gelo. Lavar as preferências soluções variar entre regiões, com a maioria dos processos de aquisições utilizando a Universidade de solução de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK) ou Wisconsin. Uma descarga adicional back-mesa da veia portal melhora a lavagem de sangue residual. Os fígados são muitas vezes adquiridos no deixando um segmento de aorta surarredondamento do tronco celíaco. A vesícula biliar é entalhada, bile é aspirado, e do ducto biliar é liberado. Os fígados são embalados em sacos estéreis contendo solução de conservação gelada e transportados em caixas designadas ou refrigeradores. Para obter resultados representativos tempo de isquemia quente e frio deve ser limitado a 60 minutos e 12 horas, respectivamente. Apesar de triagem sorológica de rotina para patógenos transmissíveis, devem ser tomadas precauções padrão quando da entrega órgãos humanos, as amostras obtidas a partir de órgãos humanos, e quaisquer produtos residuais.
O protocolo aqui descreve máquina de perfusão subnormothermic utilizando um dispositivo de perfusão do fígado disponível comercialmente. O uso de tal dispositivo permite mais rápida tradução para o contexto clínico e validação cruzada de diferentes protocolos e configurações do dispositivo, entre grupos de pesquisa e centros de transplante.
Em uma tentativa de recuperar fígados feridos durante a isquemia, desenvolvemos um sistema SNMP que pode ser empregada após um período de armazenamento refrigerado. Máquina de perfusão Subnormothermic oferece uma alternativa viável para o armazenamento refrigerado convencional, assim como as modalidades de perfusão máquina hipotérmicos e normotérmicas. Existem vários sistemas diferentes; todos oferecem diferentes vantagens e desvantagens 3,9,20. SNMP permite a perfusão sem uma transportadora de oxigênio, como demanda de oxigênio metabólicas em 21 ° C são atendidas por oxigenação ativa do perfusato.
Embora reduzido em condições subnormothermic, o metabolismo é substancial e requer o apoio de uma solução de perfusão rico em nutrientes. Soluções para perfusão tradicionais, tais como a solução de perfusão máquina Belzer, são geralmente mínima na composição e são projetados para perfusão frio. Williams Meio E tem sido utilizado como um meio de cultura de hepatócitos por muitos anos, e contém componentes que são universais para suportar a função celular, em especial no âmbito ex vivo condições quentes.
As medições efectuadas durante a perfusão máquina são o reflexo da função do órgão. Parâmetros diretamente observáveis, como a produção de bílis e consumo de oxigênio são medições em tempo real que podem ser usados para avaliar a pré-transplante de fígado. Similarmente, os marcadores de isquemia e lesão celular (K +, libertação de lactato) pode ser medida directamente na solução de perfusão e pode ser indicativo de função do órgão 20. Como a tecnologia de máquina de perfusão desenvolve e atinge aplicação clínica mais ampla, as correlações precisas entre ex vivo função e evolução clínica pode ser feito e parâmetros de perfusão será útil em ajudar decisões para transplante ou rejeitam fígados marginal qualidade. Além disso, como ponto-de ferramentas analíticas cuidados de antecedência, a análise mais sofisticada ficará disponível diretamente durante máquina perfusion 21.
Neste trabalho, mostramos que os fígados podem ser suportados no sistema SNMP com lesão mínima para o fígado, refletida pela histologia e liberação de ALT. A recuperação funcional do fígado é melhor reflectida pela ATP, o que foi mostrado para correlacionar a viabilidade fígado e é fortemente sugestiva de sucesso do transplante em modelos animais 22. Ex vivo e recuperação de pré-transplante de enxertos de fígado iria permitir uma expansão significativa do dador piscina fígado, corrigir a disparidade entre a oferta e demanda de fígados de doadores no transplante.
The authors have nothing to disclose.
O financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (concede R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 e F32 DK103500), Projeto CIMIT No. 12-1732 e os Shriners Hospitals for Children é reconhecido agradecimento. Gostaríamos de agradecer também à New England Organ Banco para apoiar este trabalho.
Liver Assist perfusion device | Organ Assist B.V. | Liver Assist | |
Liver Assist disposable set | Organ Assist B.V. | Liver Assist disposable | |
Williams’ Medium E | Sigma | W1878–6x500ml | |
Insulin | Eli Lilly & Co | Humulin R U-100 | |
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml | Life Technologies | 15070-063 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-156 | |
Hydrocortisone | MGH pharmacy | 7750500 | |
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2 | Airgas | ZO2OX9522000043 | |
Specialty gas regulator | Airgas | Y11244D580 | |
Lactated Ringer’s solution | Baxter | 2B2324X | |
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | 316-155 | |
Toothed Adson forceps | Roboz | RS-5234 | |
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm | Roboz | RS-7562 | |
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten | Roboz | RS-6965SC | |
Castroviejo Needle holder 5.5–7” | Fine Science Tools | 12565-14 | |
0 blackbraided silk sutures | Ethicon | SA66G | |
4-0 nylon suture, Nurolon RB1 | Ethicon | C554D | |
Blood gas analysis machine | Siemens | RapidPoint 500 | |
Balance scale | Cole Parmer | EW-10000-12 | |
Pressure display box | Medtronic | 66000 | |
Disposable pressure display sets | Medtronic | 61000 | |
Handheld thermocouple thermometer and probe | Cole Parmer | EW-91500-04 and EW-08516-55 | |
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm | Medtronic | 30005 | |
Irrigation set flush tubing | Hospira | 06543-01 | |
Mixing bowl, 4L | Cole Parmer | EW-07300-40 |