这个协议概述了表征使用质谱(MS)组蛋白的翻译后修饰的完全集成的工作流程。该工作流包括使用纳米流液相色谱法和用于数据分析的指令的细胞培养物或组织中,组蛋白衍生和消化,MS分析组蛋白纯化。该协议被设计为内完成2 – 3天。
核小体是染色质的最小结构单元,围绕组蛋白八聚体包裹的DNA的147个碱基对组成。组蛋白功能是由广泛的翻译后修饰通过核蛋白无数介导的。因为它们调节涉及基因调控,DNA修复和染色体凝集染色质结构和招募的酶,这些修改是对核完整性至关重要。尽管科学界的一个大的部分采用的基于抗体的技术来表征组蛋白PTM丰度,这些方法是低通量和针对hypermodified蛋白质偏置,如该表位可能被附近的变形受到阻碍。这个协议描述了使用纳米液相色谱(NLC)和质谱(MS),用于组蛋白修饰的准确定量的。 S内此方法被设计成表征了大量的各种组蛋白翻译后修饰的和几组蛋白的相对丰度变英格尔分析。在这个协议中,组蛋白衍生与丙酸酐接着消化胰蛋白酶,以产生5的肽 – 长度为20个氨基酸。消化后,将组蛋白肽的新暴露N-末端衍生化NLC-MS期间改善色谱保留。该方法允许为组蛋白翻译后修饰跨越四个数量级的相对定量。
表观遗传学定义为在基因表达,通过比改变底层的DNA序列1的其它机制发生遗传改变的研究。表观遗传调控是开发过程中至关重要,因为生物体经受剧烈的表型变化,即使它的DNA含量不发生变化。有适当后生维护所需的几个关键部件,包括组蛋白的翻译后后修饰,组蛋白变体,非编码RNA,DNA甲基化和DNA结合因子,其每一个通过不同的机制2影响基因的表达。例如,虽然DNA甲基化是抑制基因的翻译3,组蛋白变体和组蛋白翻译后修饰是更加动态并且可以以各种方式4影响染色质高度稳定的修饰。
组蛋白翻译后修饰大多局限在N末端尾部,因为它们是最暴露的和灵活的区域的蛋白质。然而,核小体的核心是比较平均的蛋白质5还大量修改。即使组蛋白标记已经被广泛表征在过去十年中,已知组蛋白标记和它们的功能之间的许多环节还不清楚。这主要是由于这样的事实,大部分组蛋白翻译后修饰不与其它翻译后修饰(“串音”)串联单独工作,而是功能变更具体过程,如转录6,7。例如,在基因的p21的组合标记H3S10K14ac激活其转录,它不会与仅在两个翻译后修饰8之一发生。蛋白质HP1契约承认H3K9me2 / ME3和传播修改到附近的核染色质。然而,HP1不能绑定H3K9me2 / 3当相邻S10被磷酸化9。 H3K4的乙酰化抑制结合蛋白spChp1到H3K9me2 / ME3在裂殖酵母 10。此外,该组蛋白赖氨酸ðemethylase PHF8有当3 H3K4me3的翻译后修饰,K9ac和K14ac存在11最高的核小体结合效率。这些例子强调实现组蛋白PTM改变全球概览,而不是集中在单个的修改的重要性。
序列的存在变体也增加了组蛋白分析的复杂性,如组蛋白同种型通常具有高度相似的序列,但往往在染色质不同的角色。例如,H2A.X具有被更容易地在DNA损伤磷酸相比典型H2A 12的C-末端序列,并且需要在雄性小鼠减数分裂13的性染色体的失活;同样,CENP-A则替换着丝粒14规范的组蛋白H3。尽管他们的不同的功能,这些变体共享与各个规范组蛋白的氨基酸序列的一个大的部分,使得它难以识别和分开量化。 </p>
基于抗体的技术,诸如免疫印迹已经被广泛地采用以表征组蛋白。然而,基于抗体的方法是有限的,原因如下:(i)它们只能确认的变形的存在,并且不能识别未知翻译后修饰; (ⅱ)它们被偏压由于共存的标记的存在,其可影响结合亲和力; (ⅲ)它们不能识别组合的标记,因为只有非常少的抗体可用于该目的和(iv)它们高度相似组蛋白变体或类似翻译后修饰( 例如 ,二-和赖氨酸残基的三甲基化)之间交叉反应。 Egelhofer 等 。描述了商业抗体的超过25%的失败通过斑点印迹或免疫印迹进行的特异性试验,以及特定抗体中的20%以上在染色质免疫沉淀实验15失败。质谱(MS)是目前最合适的分析工具,研究新的和/或组合翻译后修饰,它已经为组蛋白(16审查)被广泛实施。这主要是由于高灵敏度和MS的质量精度,并执行大规模分析的可能性。
自下而上的策略是对组蛋白表征及其翻译后修饰,其中所述完整的蛋白质是酶消化成短肽最常用的基于MS的蛋白质组学策略(5 – 20 AA)。这有利于消化既液相色谱分离和质谱检测。在600的范围群众 – 2000达通常更容易离子化,并具有较高的质量精度和分辨率大于群众识别。 MS / MS碎片也得到了改善,因为短肽通常非常适合碰撞诱导解离(CID)。然而,组蛋白呈现为自下而上的MS是一个挑战,因为它们是在碱性氨基酸残基,即赖氨酸和精氨酸高度富集。因此,胰蛋白酶消化导致过于SM肽的生成所有LC保留和翻译后修饰的明确定位。为了规避这个问题,我们的协议包括赖氨酸和肽N端化学衍生17。建议使用丙酸酐为有效的化学衍生,相对于其他的试剂18。这样衍生块未修饰的和单甲基赖氨酸残基的ɛ氨基团,使胰蛋白酶仅在精氨酸残基的C末端执行蛋白水解。衍生的胺不能与溶液交换质子并因此将肽一般只有双或三电荷,便利MS和MS / MS检测。此外,N-末端衍生增加肽的疏水性,因此反相色谱保留。这里,我们描述了工作流程,纯化组蛋白和通过自下而上蛋白质组学( 图1),用于PTM分析做好准备。这一策略实现了单组蛋白标记和组合商标的F量化或组蛋白翻译后修饰是在氨基酸序列比较接近。
这里所描述的协议被优化考虑成本,时间和性能。其他制剂也是可能的,但它们有限制,特别是在与MS分析耦合的情况下。例如,高盐提取协议可用于纯化的组蛋白26代替TCA沉淀(第3节)。高盐协议在本质上是温和的,因为它不使用强酸。这保留酸不稳定翻译后修饰,并增加萃取组蛋白的产率,如TCA沉淀共沉淀许多其他染色质结合蛋白。然而,高盐的提取导致含有HPLC-MS / MS过于集中盐样品。通过降低胰蛋白酶温育时间和酶/底物比例27或使用的argc作为消化酶28-30,例如-在另一种制备方法,组蛋白消化可以不丙酰化(8部分6)进行的。但是,建议用衍生丙酸酐,我吨导致更多的疏水性肽,其液相色谱中更好保留的产生。
对于化学衍生,各种有机酸酐进行了评估,其优点全面讨论18。尽管如此,丙酸酐证明效率,最小化的副产物和改进的肽疏水性之间的最佳折衷。潜在地,丙酸酐可以在同位素标记的形式购买;这允许用于复分析由于混合多种样品和在基于来自重标签赋予的不同的质量在MS水平识别它们的可能性。然而,该分析导致的LC-MS色谱的增加的复杂性并减少了可被注入每个单条件的样品量。
在这方面,该协议的一些关键方面应该强调。以下应被用作沟道ecklist找到在执行的情况下,获得阴性结果的程序的错误。首先,核沉淀后沉淀应认真用笔尖不使用NP-40的替代(第2.10),直到(混合过程中明显受到缺乏气泡)完全去除洗涤剂。如果不这样做会损害与酸蛋白提取。二,组蛋白沉淀与TCA(第3.9节)用丙酮沉淀的洗涤之后,是至关重要的。浓酸的存在会损害以下一步,如果直接进行丙酰化和消化(第6.1节)。这将是进行(第5)的情况下,组蛋白分离不成问题。第三,至关重要的是,丙酰化反应迅速进行(第6.3 – 6.7)。要做到这一点,应避免使用相同的丙酰化混合(丙酸酐+乙腈)超过3 – 4次连续采样。此外,pH值是胰酶消化(第7节)的最重要的方面。如果不8.0左右(7.5 – 8.5)消化将是无效的。这可能发生,因为样品将丰富的在这一步丙酸。 NH 4 OH可以加入到必要的。同时,对于熟悉流程的蛋白质组学研究人员就会觉得正常酸化样品终止胰酶消化。这不应该做的,因为它会危及下面的反应, 即肽N末端 (第8.1条)丙酰化。最后,在同样的问题,是要记住用于数据分析该未修饰的肽实际上不是未修饰是很重要的;全部免费赖氨酸残基和N-末端由丙酰化(56.026达)被占用。从而,执行对应唯一的肽序列的质量的提取离子色谱法将导致没有结果。
该方法的局限性是大多与无法检测组合翻译后修饰,由于短肽序列,并在实现真正abun偏见一个变形例的舞蹈,由于这样的事实:在不同的修饰形式的肽可能具有不同的效率电离。第一个问题可以通过这种技术有中间向下或自顶向下的方法(在16中综述)组合来解决。这种类型的分析,即使在技术上更具挑战性,是理想的研究修改共存的频率。此外,它允许组蛋白变体,这是不能总是与自下而上因为一些肽具有在不同组蛋白变体相同的序列实现的更好的歧视。第二个问题,涉及到的离子化效率,可以使用合成肽31的文库来解决。这种方法可以确保翻译后修饰组蛋白的相对丰度的更准确的估计。然而,在大多数实验中,所需的结果是分析条件之间给定修改的相对变化。在这种情况下,这种校正是不必要的,由于这一事实,所有样品都具有相同的岜秒。
总之,这个协议允许组蛋白翻译后修饰的分析,可以在使用NLC耦合到串联MS 3天完成。比MS其他技术,比较即使用如简介讨论了基于抗体的策略,是不适合的,因为它们无法达到甚至接近这个水平的吞吐量。此外,基于抗体的技术不允许新颖改进的发现,但它们仅基于确认和量化预测标记。因此,我们推测组蛋白肽自下而上的蛋白质组学将在明知组蛋白标记,这是在调整的基因表达主角的调控取得蛋白质组学实验室普及,由于直观的优势,从而影响蛋白质的调节。此外,该协议描述的内容包括在样品制备和软件进行数据分析的最新改进,使组蛋白的分析也比较平凡的labora从来没有经历过这种类型的hypermodified肽表征保守党。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国立卫生研究院从赠款(DP2OD007447,R01GM110174和R01AI118891)的资金支持。
Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 25200056 | For harvesting cells |
PBS | Invitrogen | 14200075 | |
Tris | Roche | 77-86-1 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Calcium Chloride, anhydrous | Sigma | C1016 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
AEBSF | EMD Millipore Corp | 101500 | |
Microcystin | Sigma | M4194 | |
Sodium Butyrate | Sigma | B5887 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) | Fisher Scientific | 78445 | |
NP-40 Alternative | CALBIOCHEM | 492016 | |
Sulfuric Acid, ACS grade | Fisher Chemical | 7664-93-9 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
Acetone | Sigma | 179124 | |
HCl | Fisher Chemical | A144-500 | |
Bradford reagent | Biorad | 500-0006 | |
30% acrylamide/bis 29:1 — 500ml | Biorad | 1610156 | |
Coomassie | Fisher Scientific | 20278 | |
C18 Column (5um) 2.1mm x 250mm | Grace | 218TP52 | |
C18 Column (5um) 4.6mm x 250mm | Grace | 218TP54 | |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 338818 | |
propionic anhydride | Sigma | 240311 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | PRV5113 | For digesting histones for MS |
Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
C18 extraction disk | Empore | 2215 | |
Formic Acid | Sigma | F0507 |