Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Komplet Workflow for Analyse af Histon post-translationelle modifikationer Brug Bottom-up-massespektrometri: Fra Histon Extraction til dataanalyse

doi: 10.3791/54112 Published: May 17, 2016

Summary

Denne protokol beskriver en fuldt integreret arbejdsgang til karakterisering histon posttranslationelle modifikationer ved hjælp af massespektrometri (MS). Arbejdsgangen omfatter histon rensning fra cellekulturer eller væv, histon derivatisering og fordøjelse, MS analyse ved hjælp af nano-flow væskekromatografi og instruktioner til dataanalyse. Protokollen er designet til færdiggørelse i 2 - 3 dage.

Abstract

Nukleosomer er de mindste strukturelle enhed af kromatin, sammensat af 147 basepar af DNA snoet omkring en octamer af histon-proteiner. Histon funktion medieres af omfattende posttranslationel modifikation af et utal af kerneproteiner. Disse ændringer er kritiske for nuklear integritet som de regulerer kromatinstrukturen og rekruttere enzymer involveret i genregulering, DNA-reparation og kromosom kondens. Selvom en stor del af det videnskabelige samfund vedtager antistof-baserede teknikker til at karakterisere histon PTM overflod, disse tilgange er lave gennemløb og forudindtaget mod hypermodified proteiner, som epitopen kunne spærres af nærliggende modifikationer. Denne protokol beskriver anvendelsen af ​​nano væskekromatografi (nLC) og massespektrometri (MS) til nøjagtig kvantificering af histon modifikationer. Denne metode er konstrueret til at specificere en lang række histon PTMS og den relative forekomst af flere histon varianter inden sIngle analyser. I denne protokol, er histoner derivatiseret med propionsyreanhydrid efterfulgt af fordøjelse med trypsin at generere peptider af 5 - 20 i TA i længden. Efter fordøjelsen, er den nyligt eksponerede N-termini af histon peptider derivatiseres at forbedre kromatografisk retention under nLC-MS. Denne metode giver mulighed for den relative kvantificering af histon PTMS spænder fire størrelsesordener.

Introduction

Epigenetik defineres som studiet af arvelige ændringer i genekspression, der opstår af andre end at ændre den underliggende DNA sekvens 1 mekanismer. Epigenetisk regulering er kritisk under udvikling som organismen undergår dramatiske fænotypiske ændringer selv om dens DNA-indhold ikke ændres. Der er flere kritiske komponenter, der kræves for korrekt epigenetisk vedligeholdelse, herunder histon post-translationelle modifikationer (PTMS), histon varianter, ikke-kodende RNA'er, DNA-methylering og DNA-bindende faktorer, som hver især påvirker genekspression gennem forskellige mekanismer 2. For eksempel, mens DNA-methylering er en meget stabil modifikation, der undertrykker gentranslation 3, histon varianter og histon PTMS er langt mere dynamisk og kan påvirke chromatin i en række forskellige måder 4.

Histon PTMS oftest lokaliseret på den N-terminale haler, da de er de mest udsatte og fleksible områdeaf proteinet. Men den nukleosom kerne også stærkt modificeret i forhold til gennemsnittet proteiner 5. Selvom histon-mærker er blevet grundigt karakteriseret i det sidste årti, mange forbindelser mellem kendte histon mærker og deres funktion er stadig uklart. Dette skyldes i høj grad, at de fleste histon PTMS ikke arbejde alene, men snarere fungerer sammen med andre PTMS ( "cross-talk") til at ændre en bestemt proces, såsom transskription 6,7. For eksempel den kombinatoriske mark H3S10K14ac af genet p21 aktiverer dens transkription, som ikke ville forekomme med kun én af de to PTMS 8. De protein HP1 kompakte kromatin ved at anerkende H3K9me2 / ME3 og sprede ændring nærliggende nukleosomer. Dog kan HP1 ikke binde H3K9me2 / 3, når det tilstødende S10 phosphoryleres 9. Acetylering af H3K4 inhiberer binding af proteinet spChp1 til H3K9me2 / me3 i Schizosaccharomyces pombe 10. Endvidere histon lysin demethylase PHF8 har den højeste nukleosom bindende effektivitet, når tre PTMS H3K4me3, K9ac, og K14ac er til stede 11. Disse eksempler fremhæver betydningen af ​​at opnå et samlet overblik over histon PTM ændringer snarere end at fokusere på enkelte ændringer.

Tilstedeværelsen af ​​sekvensvarianter også øger kompleksiteten af ​​histon-analyse, som histon isotyper har generelt yderst lignende sekvenser, men ofte har forskellige roller i kromatin. For eksempel H2A.x har en C-terminal sekvens, som lettere phosphoryleret ved DNA skade i forhold til kanonisk H2A 12, og det er nødvendigt for at inaktivere kønskromosomer i hanmus meiose 13; Tilsvarende CENP-A erstatter kanoniske histon H3 i centromerer 14. Trods deres forskellige funktioner, disse varianter deler en stor del af deres aminosyresekvens med den respektive kanoniske histon, hvilket gør det vanskeligt at identificere og kvantificere dem separat. Antistof-baserede teknikker, såsom western blotting er blevet grundigt vedtaget at karakterisere histoner. Men antistofbaserede tilgange er begrænset af følgende årsager: (i) de kan kun bekræfte tilstedeværelsen af ​​en ændring, og kan ikke identificere ukendte PTMS; (Ii) de er forspændt på grund af tilstedeværelsen af ​​sameksisterende varemærker, som kan påvirke bindingsaffinitet; (iii) de kan ikke identificere kombinatoriske mærker, som kun meget få antistoffer er til rådighed til dette formål og (iv) de krydsreagere mellem højt lignende histon varianter eller lignende PTMS (f.eks di- og trimethylation af lysin rester). Egelhofer et al. beskrevet, at mere end 25% af kommercielle antistoffer mislykkes specificitetstests ved dot blot eller western blot, og blandt specifikke antistoffer over 20% mislykkes i kromatin immunopræcipitationsforsøg 15. Massespektrometri (MS) er i øjeblikket den mest passende analytisk værktøj til at studere nye og / eller kombinatoriske PTMS,og det er blevet grundigt implementeret for histonproteiner (gennemgået i 16). Dette er for det meste på grund af høj følsomhed og masse nøjagtighed MS, og muligheden for at udføre storstilet analyser.

Bottom-up strategi er den mest almindeligt anvendte MS-baserede proteomics strategi for histon karakterisering og deres PTMS, hvori det intakte protein fordøjes enzymatisk i korte peptider (5 - 20 i TA). Denne fordøjelse fremmer såvel LC separation og MS-detektion. Masser i området fra 600 - 2.000 Da almindeligvis lettere ioniseret og identificeres med højere masse nøjagtighed og opløsning end større masser. MS / MS fragmentering er også forbedret, så korte peptider er generelt velegnede til kollision induceret dissociation (CID). Imidlertid histoner udgør en udfordring for bottom-up MS, da de er stærkt beriget med basiske aminosyrerester, nemlig lysin og arginin. Derfor trypsinfordøjelse fører til dannelsen af ​​peptider, der er for smalle for LC fastholdelse og entydig lokalisering af PTMS. For at omgå dette problem ved vores protokol omfatter lysin og peptid N-terminalt kemisk derivatisering 17. Det anbefales at bruge af propionsyreanhydrid til effektiv kemisk derivatisering i sammenligning med andre reagenser 18. Sådanne derivatisering blokerer ɛ-aminogrupperne i umodificerede og monomethylsteroler lysinrester, hvilket tillader trypsin at udføre proteolyse kun ved C-terminalen af ​​argininrester. Derivatiserede aminer kan ikke udveksle protoner med løsningen og dermed peptiderne er generelt kun dobbelt eller tredobbelt opladet, letter MS og MS / MS detektion. Endvidere N-terminal derivatisering forøger peptid hydrofobicitet og dermed omvendt fase kromatografisk fastholdelse. Her beskriver vi arbejdsgangen at rense histoner og forberede dem til PTM-analyse via bottom-up proteomics (figur 1). Denne strategi opnår kvantificering af enkelte histon mærker og kombinatoriske mærker feller histon-PTMS der er relativt tæt på aminosyresekvensen.

Protocol

1. Indsamling af Celler fra Kultur

  1. Hvis cellerne blev dyrket i suspension, indsamle cellerne ved centrifugering ved 300 rcf for 5 min. Hvis vedhængende, aspireres og kassere celle medium. Skyl de vedhæftede celler med PBS uden Ca2 + og Mg2 + (benævnt PBS fremadrettet). Inkubér cellerne i enten trypsin eller trypsin-EDTA (0,025% - 0,5% afhængigt af cellelinjen) med tilstrækkelig volumen til at dække overfladen af ​​pladerne ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes (varierer for forskellige cellelinier).
  2. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 300 rcf for 5 min. Vask cellerne to flere gange i PBS og indsamle ved centrifugering.
  3. Vurdere pakkede cellevolumen ca. fra gradueringer markeret på de 1,8 ml rør eller 15 ml koniske rør.
    Bemærk: Celler fra kultur kan snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C på ubestemt tid på dette stadium.

2. Isolering af kerner fra intakte celler

  • Optø celler på is.
  • Tø nuklear isolation puffer (NIB, tabel 1).
  • Forbered ca. 5 ml NIB buffer (tabel 1) for hver 100 pi hæmatokritværdi. For hver 1 ml NIB buffer, tilsæt proteasehæmmere og stabiliserende midler som følger: 1 pi 1 M DTT, 2,5 pi 200 mM AEBSF, 2 pi 2,5 uM microcystin og 2 pi af 5 M natriumbutyrat. NIB med inhibitorer vil blive omtalt som NIB fra dette punkt frem.
    Bemærk: Hvis histon phosphorylering studeres, indbefatter frie EDTA protease og phosphatase inhibitor cocktail.
  • Fjern en femte volumen NIB buffer således fremstillede og tilføje NP-40 Alternativ (tabel 1) til en slutkoncentration på 0,2%. De resterende fire femtedel volumen vil blive anvendt til vask.
  • Vask cellepelleten i 01:10 cellepellet til NIB uden NP-40 Alternativ ratio (v / v). Fjern supernatanten ved centrifugering ved 700 rcf for 5 min.
  • Lyse den cell pellet ved at placere den på is og tilsætning 01:10 cellepellet til NIB med 0,2% NP-40 Alternativ (v / v).
  • Hvis udvinding fra vævsprøver, homogenisere bruge morter og støder eller Dounce homogenisatorer. Dyrkede celler kan homogeniseres ved forsigtig pipettering.
  • Inkuber homogeniserede celler på is i 5 - 10 min. Cellerne vil lysere og frigive kernerne.
  • Der centrifugeres ved 1.000 rcf i 5 - 10 min ved 4 ° C. Pelleten indeholder hovedsagelig cellekerner, mens supernatanten indeholder hovedsagelig cytoplasmatiske komponenter. Gem den cytoplasmatiske fraktion, hvis det ønskes.
  • Vask kerner pellet ved forsigtigt at resuspendere det i 1:10 (v / v) NIB uden NP-40 Alternativ.
    Bemærk: Dette vasketrin er udelukkende at fjerne spor af detergenter før ekstraktion histoner fra kerner.
  • Der centrifugeres ved 1.000 rcf i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten.
  • Gentag trin 2.10 - 2.11 mindst to gange til fuldstændig fjernelse NP-40 Alternativ. Fjernelse af NP-40 Alternativ er tydelig ens forsigtig pipettering under vasketrinet ikke længere danner bobler.
  • For histon ekstraktion fra væv:
    1. Skyl friske eller optøet frossen væv i iskold NIB.
    2. Overfør væv til en petriskål anbragt på is med NIB, lige nok til at holde vævet vådt.
    3. Terninger til mindste stykker (<1 mm) med barberblad at forøge overfladekontakt for kerner isolation.
    4. Overfør hakket væv til en forud kølet homogenisator og vask i NIB ved pipettering op og ned.
    5. Fjern puffer ved centrifugering ved 300 rcf for 5 min.
    6. Tilføj NIB indeholdende NP-40 Alternativ til cellerne i et celler: buffer forhold på 1:10 (v / v) og homogeniseres med 5 - 10 slag.
    7. Check for cellelysering og gentag homogenisering efter behov. En god indikator for, at cellerne er blevet lyseret er reduktionen af ​​pelleten volumen. Pelleten bør kun indeholde kerner.
    8. Centrifuger ved 700 rcf i 5 min, og gem pellet. Denne pellet kan udtrækkes 1 - 2 ud mere tidsi 01:10 (v / v) af NIB indeholdende NP-40 Alternativ; på dette tidspunkt, er histonerne udvundet af kromatin og pillen har indskrumpet betydeligt.
    9. Vask to gange med 2 - 3 ml NIB uden NP40 Alternativ til fjernelse af spor af detergentet.
      Bemærk: Midlertidig standsning punkt: Prøve kan resuspenderes i minimum volumen af ​​NIB + 5% glycerol, og opbevaret ved -80 ° C.
  • 3. Ekstraktion og oprensning af Histoner fra Nuclei

    Bemærk: Histoner er meget rig på basiske aminosyrerester, så de kan stramt interagere med phosphorsyre rygraden i DNA. Histoner er blandt de mest basiske proteiner i kernen, hvilket således tillader dem at blive ekstraheret i iskold svovlsyre (0,2 MH 2 SO 4) med minimal forurening fra ikke-histon-proteiner, der udfældes i stærk syre. Stærkt koncentreret TCA (til en slutkoncentration på 33%) kan derefter anvendes til at udfælde histoner fra svovlsyresyre. TCA lagres som 100% i brun flaske ved 4 ° C.

    1. Resuspender cellekerner i 1: 5 (v / v) kølet 0,2 MH 2 SO 4 (tabel 1) ved forsigtig pipettering.
    2. Prøven inkuberes under konstant rotation eller forsigtig rystning i 2 - 4 timer ved 4 ° C. Typisk for prøver med mere end 500 pi cellepellet, en 2 timers ekstraktion er tilstrækkeligt til at ekstrahere histoner; længere inkubation kan resultere i udvinding af andre basiske proteiner. For mindre nukleare pellets (<200 pi), 4 timer ekstraktion giver et bedre udbytte.
    3. Der centrifugeres ved 3.400 rcf ved 4 ° C i 5 min.
    4. Supernatanten overføres til et nyt rør.
    5. Gentag trin 3,3-3,4 for at fjerne enhver uopløseligt materiale.
    6. Til udfældning af histoner tilføje kølet 100% TCA (tabel 1) til den opsamlede supernatant (der nu indeholder histoner) i forholdet 1: 3 (v / v), for at opnå en endelig TCA-koncentration på 33%. Bland ved at vende røret et par tIME'er.
      Bemærk: Prøverne vil blive uklar ved tilsætning af TCA, indikerer tilstedeværelsen af ​​histoner.
    7. Inkuber blandingen på is i mindst 1 time. For mindre udgangspunkter pillestørrelser anbefales natten nedbør.
    8. Centrifuger ved 3.400 rcf i 5 min. Den histoner overtrække siderne af rørene og også deponere nederst. En hvid uopløselig pellet danner også i bunden af ​​røret, som for det meste indeholder ikke-histon proteiner og andre biomolekyler. Fjern supernatanten ved aspiration, forsigtigt, uden at skrabe siderne eller pelleten.
    9. Ved anvendelse af en glas Pasteur-pipette, skylles røret med iskold acetone + 0,1% HCI (Tabel 1) for således at dække de udfældede proteiner belægning sider og bund.
    10. Centrifugeres ved 3400 rcf i 2 min og aspirere supernatanten, forsigtigt, uden at skrabe siderne eller pillen.
    11. Gentag trin 3,9-3,10 hjælp af 100% iskold acetone.
    12. Tør pellet med luftstrøm eller med et Vacuum centrifugeres, eller blot ved at forlade røret åben. Acetone fordamper hurtigt.
    13. Opløs histonerne med Hedeselskabet 2 O (dobbelt destilleret vand) i minimum volumen muligt at opløse det hvide lag fuldstændigt. Histoner er letopløselige i vand. For pellets i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, 100 pi Hedeselskabet 2 O er normalt nok til at indsamle histoner.
    14. Centrifuger ved 3.400 rcf i 2 minutter og overføre supernatanten til et nyt rør.

    4. Estimering af Protein Koncentration og Renhed

    1. Til måling protein koncentrationen anvendes BCA, Bradford-proteinassay eller aminosyreanalyse (AAA). Brug ikke teknikker, der udsteder absorbans ved 280 nm, som histoner er fattige i aromatiske aminosyrerester.
    2. Kontroller renheden af ​​udtrukne histoner ved SDS-PAGE-analyse med en 15% acrylamid gel og Coomassie-farvning (valgfrit).
    3. Hvis der ønskes høj renhed enkelt histon varianter, fortsat HPLC-UV fraktionering afhiston varianter (afsnit 5). Hvis ikke, springe direkte til prøve forberedelse til bottom-up histon PTM analyse (afsnit 6).

    5. Adskillelse af histon varianter ved omvendt fase HPLC (valgfri)

    Bemærk: High Purity histon-varianter kan opnås ved fraktionering af rå histon blandingen under anvendelse af omvendt fase HPLC koblet til en UV-detektor. Disse rensede histoner er nyttige til undersøgelser, der kræver højere følsomhed og renhed. Men for standard histon PTM karakterisering, kan dette trin springes over, fordi analysen er tilstrækkelig følsom og udtømmende. Fraktionering af intakt histon varianter ideelt kræver på mindst 100 - 300 mikrog af udgangsmateriale.

    1. Tilslutte en passende C18 5 um kolonne til en HPLC afhængigt af udgangsforbindelsen histon koncentration: med ca. 100 ug histoner, bruge 2,1 mm x 250 mm søjle med en strømningshastighed på 0,2 ml / min; med omkring 300 ug histoner, bruge 4,6 x 250 mm søjle meden strømningshastighed på 0,8 ml / min. Forbered Buffer A og B ved hjælp af dedikeret glasvarer som følger:
      1. Forbered Buffer A: 5% HPLC-kvalitet acetonitril, 0,1% TFA i HPLC-renhed vand.
      2. Forbered Buffer B: 95% HPLC-kvalitet acetonitril, 0,1% TFA i HPLC-renhed vand.
    2. Slut kolonne til en UV-detektor, og indstille absorbansen til 210 - 220 nm.
    3. Forsure histon prøven opløst i vand med 100% TFA til opnåelse af en slutkoncentration på 0,1-1% TFA.
    4. Ækvilibrering af søjlen med 100% puffer A i mindst 15 minutter ved den anbefalede strømningshastighed, hvilket omtrent svarer til tre søjlevolumener. Brug denne signal til at indstille nul-absorbans niveau af UV-detektor.
    5. Forbered passende størrelse rør til at indsamle fraktioner enten manuelt eller i et automatisk prøve samler.
    6. Injicer prøve ved en koncentration på ca. 1 pg / pl eller højere. Prøver opløst i større mængder kan ændre ligevægt af søjlen during lastning og føre til lavere fastholdelse.
    7. Kør gradienten programmeret som følger: fra 0 til 30% B i 1 min, 30 til 60% B i 90 min, og 60 til 90% B i 1 min.
    8. Opsaml fraktioner (eksempel kromatogram er vist i figur 2) i 1 min intervaller under anvendelse af en automatisk fraktionsopsamler. Saml fraktioner i passende størrelse rør til at indeholde hele mængden.
    9. Tør ned fraktionerede prøver i et vakuum koncentrator.
      Bemærk: Midlertidig standsning punkt: Tørrede histon fraktioner kan opbevares ved stuetemperatur i korte perioder (1 - 2 dage) eller i -80 ° C fryser for langsigtet perioder.

    6. Kemisk Derivatisering af Histoner Brug propionsyreanhydrid for Bottom-up Analyse

    1. Opløs histon prøver i 40 pi 50 mM NH4 HCO 3, pH 8,0 (anbefalet mængde: 50 - 100 ug). Hvis prøverne var i ren Hedeselskabet 2 O, tilsæt koncentreret NH4 HCO 3 at gøre op 50 mM, pH 8.0.
    2. Våd en P10 pipettespids i prøven til at kontrollere pH ved brug af pH indikatorstrips uden tab prøve. NH4OH og myresyre kan anvendes til at justere pH til 8,0.
      Bemærk: Følgende del af protokollen (trin 6,3-6,7) bør ske i partier af maksimalt tre til fire prøver, for at holde propionsyreanhydrid reaktive.
    3. Brug stinkskab for de efterfølgende trin, hvor der anvendes propionsyreanhydrid. Forbered frisk propionylation reagens ved at blande propionsyreanhydrid med acetonitril i forholdet 1: 3 (v / v). Tilføj propionylation reagens til prøve i 1: 4 (v / v). For 40 pi histoner, tilsættes 10 ul propionylation reagens.
      Bemærk: Det er muligt at observere hvid vragrester på dette trin. dette oftest indeholder imidlertid salte og propionsyre, og dermed skal tages nogen bestemt handling.
    4. Hurtigt tilføje NH4OH at genetablere pH 8,0 til opløsningen. Bemærk: Propionsyreanhydrid reagere med frie aminer af peptiderne frembringer propionisk syre, som sænker pH. Normalt, tilføjer NH4OH til prøven med et forhold på 1: 5 (v / v) er egnet til at genetablere pH 8,0; fx 8 pi NH4OH til 40 pi prøve.
    5. Bland straks ved hvirvelblanding.
    6. Check pH med den samme fremgangsmåde som trin 6.2.
      Forsigtig: Når pH er større end 10,0, mærkning af andre aminosyrerester med højere pKa er mulig.
    7. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 15 minutter.
    8. Gentag trin 6,3-6,7 strengt udfører reaktionen for ikke mere end 3 eller 4 prøver pr parti propionylation reagens.
    9. Tørre prøver ned til 10 - 20 pi i en vakuumkoncentrator. Dette fordamper uomsat propionsyreanhydrid, acetonitril, eddikesyre og ammoniakgas frigivet fra NH4OH. Hvis prøverne tørre helt ud, ikke opstår væsentlige tab prøve.
      Bemærk: Isopropanol kan anvendes i stedet for acetonitril. Imidlertid acetonitril har lavere overfladespænding og dermed merehurtig fordampning.
    10. Resuspender eller fortyndede prøver med Hedeselskabet 2 O indtil 40 pi slutvolumen er opnået.
    11. Gentag trin 6,2-6,9. En dobbelt runde af histon propionylation sikrer> 95% af reaktionsfuldførelse.
    12. Fyld propionsyreanhydrid flaske med argongas for at forhindre dannelse af eddikesyre i kontakt med fugt i flasken.
      Bemærk: Midlertidig standsning punkt: Prøve kan opbevares ved -80 ° C rekonstitueret i Hedeselskabet 2 O eller tørret.

    7. proteolytisk fordøjelse med trypsin

    1. Resuspender histoner i 50 mM NH4 HCO 3 at opnå en optimal koncentration på 1 pg / pl eller højere. Mere fortyndede prøver føre til lavere trypsin effektivitet.
      Bemærk: De histoner på dette trin skal være ved pH 8,0 Hvis den stadig sur, derefter tilføje NH4 HCO 3 salt til prøven ved anvendelse pipettespids.
    2. Tilføj trypsin til histon prøver ved en 1:10 forhold (vægt / vægt).
    3. Incubate ved 37 ° C i 6 - 8 timer.
    4. Stop fordøjelse ved frysning i -80 ° C.
    5. Tør ned prøven til 10 - 20 pi i en vakuumkoncentrator.
      Bemærk: Foreløbig stoppunkt: Prøve kan opbevares ved -80 ° C.

    8. Propionylation af histon peptider ved N-termini

    Bemærk: Dette afsnit beskriver derivatisering af peptidet N-termini genereret fra trypsin fordøjelse. Sådan procedure forbedrer HPLC retentionstid af de korteste peptider (f.eks amino-3 - 8 af histon H3), som propionylgruppen forøger peptid hydrofobicitet.

    1. Resuspender prøver i 30 pi 100 mM NH4 HCO 3.
    2. Gentag trin 6,1-6,9.
      Bemærk: Det er normalt, at tørring af prøver i vakuum tager længere tid på dette trin.
    3. Resuspender eller fortynde prøver med 50-100 pi Hedeselskabet 2 O + enten 0,1% TFA eller 0,5% eddikesyre. Bemærk: Eddikesyre anbefales til lange lagre, som TFA facilitates methioninoxidering på lang sigt. På den anden side, anbefales TFA hvis scenen-deponering (afsnit 9) udføres samme dag, som TFA bistår en bedre kromatografisk fastholdelse.
      Bemærk: Foreløbig stoppunkt: Prøve kan opbevares ved -80 ° C.

    9. Prøve Afsaltning med Stage-tips

    Bemærk: På dette tidspunkt, der er salt til stede i prøven. Salte hindre HPLC-MS-analyse, fordi de ioniseres under elektrospray, undertrykke signalet fra peptider. Salte kan også danne ioniske addukter på peptider, reducere signalintensiteten for den ikke-adducerede peptid. Som den adduceret peptid vil have en forskellig masse, peptid vil ikke blive korrekt identificeret eller kvantificeret.

    1. Ved anvendelse af en P1000 pipettespids, punch en skive af C18-materiale fra en fastfaseekstraktion disk. Skub minidisk ud af P1000 spids ved anvendelse af en smeltet silica kapillær og deponere minidisk til bunden af ​​en P100 / 200 pipettespids. Sørg for, at dISK er sikkert fastkilet i bunden af spidsen (figur 3).
      Bemærk: P1000 spids har en temmelig lille hul til punch C 18 disk. Det er hensigtsmæssigt at skære den sidste centimeter af spidsen for at have et hul med større diameter.
    2. Brug to C 18 slag i samme P100 / P200 tip hvis afsaltning over 25 ug prøve.
    3. Brug en centrifuge adapter til at holde stage-tips på plads i 1,5 ml eller 2 ml mikrocentrifugerør. Brug langsom (300-400 rcf) rotation; opløsningsmidlerne passerer normalt gennem harpiksen på mindre end et minut.
    4. Skyl harpiksen ved spinding med 50 pi 100% acetonitril at aktivere C18 materiale og fjerne potentielle forureninger.
    5. Ækvilibrere disk ved at skylle 80 pi 0,1% TFA ved langsom centrifugering.
    6. Forsure prøven til pH 4,0 eller lavere med eddikesyre. PH kontrolleres med pH-strips til at minimere prøve tab. Load prøve på disken ved langsom centrifugering.
    7. Vaskprøve ved at skylle 70 - 80 pi 0,1% TFA ved langsom centrifugering.
    8. Eluere prøven ved at skylle 70 pi 75% acetonitril og 0,5% eddikesyre ved langsom centrifugering. Prøven opsamles i et 1,5 ml rør.
    9. Tør prøve i et vakuum koncentrator.
      Bemærk: Foreløbig stoppunkt: Prøve kan opbevares ved -80 ° C.

    10. Analyse af histon peptider

    Bemærk: NLC-MS-platformen bør oprettes som udført i traditionel peptid analyse. Anbefales 300 nl flow-søjle (75 um ID analytisk kolonne, C 18 partikler), da de er et fremragende kompromis mellem følsomhed og stabilitet - anvendelsen af 200. MS overtagelsesmetoden kan enten være en kombination af data-afhængig erhvervelse (DDA) med målrettede scanninger 19 eller en data-uafhængig erhvervelse (DIA) 20,21, begge beskrevet i Repræsentative resultater og figur 4.

    1. Forbered HPLC buffere - A: 0,1% myresyre iHPLC-kvalitet vand; B: 0,1% myresyre i HPLC-kvalitet acetonitril.
    2. Programmere HPLC-metoden som følger: fra 0 til 30% puffer B i 30 minutter fra 30 til 100% B for den næste 5 min og ved isokratisk 100% B i 8 minutter. Hvis HPLC ikke er programmeret til automatisk kolonne ækvilibrering før prøvepåfyldning, så omfatter følgende: gradient fra 100 til 0%, B i 1 min og isokratisk strømning ved 0% B i 10 min. Indstil strømningshastigheden af ​​analysen til 250 - 300 nl / min.
    3. Program MS erhvervelse metode til at udføre enten DDA kombineret med målrettede scanninger 19 eller DIA 20,21 (Figur 4). Sørg for, at MS duty cycle tillader en fuld MS scanning hver ~ 2 sek, for at have nok datapunkter til hele kromatografiske top, som gør det muligt mere nøjagtig kvantificering. Bemærk: Med C18 kromatografi det gennemsnitlige peak baseline bredde er omkring 30 sek for gradienten beskrevet ovenfor.
    4. Læg ca. 1 ug prøve på HPLC column.
    5. Kør HPLC-MS / MS-metode som programmeret.
      Bemærk: I protokollen anbefaler vi ikke detaljerne i kolonner, MS instrumenter eller MS parameter detaljer, som enhver optimale setup, at en person proteomics lab udviklet vil være egnet til metoden. Proteomics laboratorier bør bruge deres optimerede opsætning, da histon peptider adskilt som traditionelle peptider.

    11. Dataanalyse

    1. Importer MS raw-filer i software til at udføre integrationen peak område. Bemærk: EpiProfile 22 anbefales, da det er optimeret til histon peptider; ved hjælp retentionstiden viden om kromatografiske eluering den udfører pålidelige topareal ekstraktion af kendte histon peptider. Alternativt Skyline 23 er en anden ideelle software til formålet.
      1. Beregn den relative forekomst af et givet peptid ved dividere område med det samlede areal af at peptid i alle dets modificerede former. Bemærk: I tilfælde af opdagelse anasis Mascot anbefales at identificere spektre af modificerede histon peptider. Udførelsen af dette værktøj er blevet beskrevet for nylig 24. Alle andre database søgemaskiner for proteomics er også anvendelige, men på vore tests de gav lavere ydelse.

    Representative Results

    Som et eksempel, vi analyserede histoner udvundet af menneskelige embryonale stamceller (hESCs) med og uden retinsyre (RA) stimulering, begyndende med 200 pi cellepellets. Tilstedeværelse af RA i cellekultur fører til ESC differentiering. Fra cellepelleten, omkring 50 - 100 ug af histoner blev ekstraheret, hvilket er mere end tilstrækkeligt til at udføre flere LC-MS injektioner af histon peptider. Efter derivatisering, fordøjelse, og afsaltning blev prøverne påsat en 75 um x 15 cm C18-søjle (partikeldiameter 3 um, porestørrelse 300 Å) i seriel tilstand med en højtydende flydende nano kromatografi-system med mikrofluide chips koblet til en hybrid lineær fælde kvadrupol - orbitrap massespektrometer. MS købet blev udført ved hjælp af DIA. Parallelt blev prøver også analyseret med en DDA-metoden under anvendelse af et nano-flow UHPLC koblet til en hybrid ion trap-orbitrap massespektrometer (data ikke vist). Ihver cyklus blev en fuld MS orbitrap detektion udføres med scanningen området fra 290 til 1400 m / z, en opløsning på 60.000 (ved 200 m / z) og AGC 10 6. Derefter blev data afhængig dataopsamling påføres med en dynamisk udelukkelse af 30 sek. MS / MS-scanninger blev fulgt på forældre ioner fra de mest intense dem. Ioner med en afgift tilstand af én blev udelukket fra MS / MS. En isolation vindue på 2 m / z blev anvendt. Ioner blev fragmenteret ved hjælp af kollision induceret dissociation (CID) med kollisionsenergi på 35%. Ion fælde detektion blev anvendt med normal scanning rækkevidde mode og normal scanningshastighed med AGC på 10 4.

    Rå MS-data blev analyseret vedtagelse software til udvinding af prækursor og fragment ionchromatogrammer, nemlig Skyline 23 og EpiProfile 22. EpiProfile er blevet optimeret til histon-peptider, da den integrerer intelligent topareal ekstraktion grund forudgående kendskab til peptidevand retentionstid. På den anden side er Skyline optimeret til DIA analyser, og dermed DIA tal vises (figur 4 og 5A) er skærmbilleder fra denne software. Fra den ekstraherede ionkromatogram, er området under kurven udtaget, og dette anvendes til at estimere den overflod af hvert peptid. Arealet af den kromatografiske top blev beregnet for [M + H] +, [M + 2H] 2+, og [M + 3H] 3 + ioner af det samme peptid, selv om i de fleste tilfælde [M + 2H] 2+ var den udbredte form. Dette giver den rå overflod af en given modificeret form af et peptid. For at opnå den relative forekomst af PTMS blev summen af ​​alle forskellige modificerede former af en histonpeptid betragtes som 100%, og arealet af det særlige peptid blev delt med det samlede areal for at histonpeptid i alle dets modificerede former .

    Histon peptider er til stede i en vaker af isobare former (figur 5). Isobarisk peptider, f.eks K18ac og K23ac, kun kan kvantificeres ved MS / MS-niveau, hvor deres unikke fragment-ioner bruges til at bestemme forholdet mellem isobare arter (figur 5A og 5B). Dette forhold bruges til at dele området i den kromatografiske top mellem de to arter. Ved brug DDA blev disse isobare former indgår i en række målrettede masserne, fordi disse peptider behøver at blive udvalgt til fragmentering gennem hele deres eluering, som ikke ville forekomme i en standard DDA eksperiment. Diskriminering af den relative forekomst af de isobare arter udføres dernæst ved at overvåge elueringsprofilen af ​​fragmentionerne. På den anden side, er DIA type overtagelse ikke kræver nogen liste integration. Men denne type overtagelse fremgangsmåde er ikke kompatibel med traditionel databasesøgning, og dermed kan forhindre opdagelsen af ​​ukendte modificerede peptider.

    hESCs viste en klar reduktion af acetylerede peptider når stimuleres til differentiering (figur 6A og 6B). Det var ikke overraskende, da tidligere resultater rapporteret højere acetylering i økonomiske og sociale råd i forhold til differentiere dem 25,afspejler generelt eftergivende natur af pluripotente kromatin. Ved at fokusere på histon H3 blev 35 forskellige modificerede former kvantificeret (figur 6C). Men alle histon proteoforms der kan undersøges med denne fremgangsmåde er mere end 200, herunder alle histon varianter og lav hyppighed modifikationer (data ikke vist). Desuden viste vores analyse, at der kan opnås høj reproducerbarhed mellem tekniske gentagelser, som det fremgår af den lille størrelse af fejlen barer (der repræsenterer ± standardafvigelse). Tilsammen har dette afsnit beskriver, hvordan at udtrække den relative forekomst af histon modificerede peptider ved hjælp nLC-MS-data.

    figur 1
    Figur 1:. Workflow for Bottom-up MS / MS histon analyse er vist De ti trin til histon analyse, herunder en vurdering af den tid, der kræves for hvert trin. Afsnittet er angivet i parentes som til stede i manuskriptet. Afsnit 5, der beskriver prøve fraktionering at isolere de forskellige histon varianter, kan udelades, medmindre der er behov for meget følsom analyse af en given variant. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2: omvendt fase Flow LC for Histon Variant Fraktionering og Coomassie Gel (A) LC-UV chromatogram repræsenterer intakt histon separation.. Histon H3 varianter kan skelnes fra hinanden efter deres elueringstid. Fraktioner kan opsamles enten manuelt eller ved hjælp af en automatiseret fraktionsopsamler. (B) Coomassie gel af tre gentagelser af histon oprensning.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3:. Making of Stage-deponering Plug Med P1000 pipettespids, punch en skive lavet af C 18 materiale fra en fast fase ekstraktion disk (andet panel). Den minidisk vil holde i spidsen (midterste panel), således at den kan skubbes ud i en mindre P100 / 200 pipettespids ved hjælp af enhver form for små kapillarrør. I dette eksempel anvendte vi en 700 um udvendig diameter kvartsglas rør. Den minidisk skal skubbes til bunden af ​​P100 / 200 pipettespids, indtil den ikke kan komme længere (sidste panel). Scenen tip er klar til histon afsaltning, da det har tilstrækkelig kapacitet til at tilbageholde nok prøvemateriale for mange gentagelser. Konkret ene minidisk er nok til 15-20 ug sample. Hvis der er mere prøve er påkrævet, kan flere diske pakkes på hinanden. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4:. Skematisk repræsentation DDA og DIA Metoder Ved brug DDA, er cyklus MS scanning karakteriseret ved sekventiel udvælgelse af prækursor-ioner for MS / MS fragmentering i henhold til deres intensitet og opladningstilstand. Når en forløber ion er blevet fragmenteret den er placeret i en liste udelukkelse for at undgå gentagne valg af den samme peptid, således at MS kan "grave" i mindre rigelige signaler. Dette opkøb metode er en teknik, valg i proteomics for opdagelse mode. Kvantificering opnås ved at integrere den fulde scanning signal om en given ion siden de identificerede MS /MS-spektrum. I DIA er hele m / z interval fragmenteret ved hver scanningscyklus. Denne fremgangsmåde er mindre egnet til registreringstilstand, men den producerer en kromatografisk profil af alle ioner, prækursorer og produkter. Dette fører til mere sikker kvantificering og diskrimination af isobare former. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 5
    Figur 5: Kvantificering af isobare peptider (A) Eksempel på to isobare peptider almindeligvis rigelige i histon-analyse.. Den udvundne ion kromatogram (XIC) af deres forløber masse og relative isotoper (ovenfor) er identisk. Imidlertid XIC af produktets ioner (nedenfor) tillader diskrimination af de to isobare former. Navnlig bør kun unikke fragmentioner være osed at estimere den relative forekomst af de to arter. (B) Repræsentation af de unikke fragmentioner for de to beskrevne peptider (markeret med rødt). (C) Liste over de almindeligt analyserede peptider i Homo sapiens med mindst en isobar ækvivalent. Sekvens varianter mellem de anførte histon peptider er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6: Repræsentative resultater af humane embryonale stamceller med og uden retinoidsyre behandling (A) Relativ kvantificering af histon H3 peptid KQLATKAAR (aa 18-26) i alle sine modificerede proteoforms.. Den relative forekomst blev estimeret ved hjælp af alle proteoforms som 100% (reltiv procentdel af det umodificerede peptid ikke vist) (B) Relativ kvantificering af histon H3 peptid KSTGGKAPR (aa 9 -.. 17) (C) Relativ overflod af detekterede peptider til kanonisk histon H3 med og uden celle behandling med retinsyre. Figuren angiver i hvilket af de to behandlinger de givne modifikationer er mere rigelige (> 50%). Samlet set viser vi, at histon H3 acetylering falder i de fleste af lysinresterne upon induktion af celledifferentiering. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Løsning # Sammensætning
    1 Nuklear Isolation Buffer (NIB) stamopløsning fremstilles som følger og opbevares frosset som 100 ml alikvoter ved -20 ° C; optøetNIB kan opbevares ved 4 ° C i få uger: 15 mM Tris, 60 mM KCI, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 og 250 mM sucrose. PH i bufferen justeres til 7,5 med HCI.
    2 Proteasehæmmere (tilføjer frisk til buffere før brug): 1 M dithiothreitol (DTT) i Hedeselskabet 2 O (1.000 x); 200 mM AEBSF i Hedeselskabet 2 O (400x)
    3 phosphataseinhibitor (tilføje frisk til buffere før brug): 2,5 pM Microcystin i 100% ethanol (500x)
    4 HDAC-hæmmer (tilføje frisk til buffere før brug): 5 M Natriumbutyrat, lavet af titrering af 5 M smørsyre hjælp NaOH til pH 7,0 (500x)
    5 NP-40 Alternativ: 10% v / v i Hedeselskabet 2 O
    6 0,2 MH 2 SO 4 i Hedeselskabet 2 O
    7 Trichloreddikesyre (TCA): 100% vægt / vol i Hedeselskabet 2 O
    8 Acetone + 0,1% saltsyre (HCI): 0,1% vol / vol HCI i acetone

    Tabel 1. Solutions.

    Discussion

    Den her beskrevne protokol er optimeret overvejer omkostninger, tid og ydelse. Andre præparater er mulige, men de har begrænsninger, især i tilfælde af kobling med MS-analyse. For eksempel kan den høje salt ekstraktionsprotokol anvendes til at oprense histoner 26 i stedet for TCA-præcipitation (afsnit 3). High-salt protokollen er uløseligt mildere, da den ikke anvender stærk syre. Dette bevarer syrelabile PTMS og forøger udbyttet af ekstraherede histoner, som TCA-præcipitation co-udfældes mange andre kromatin bindende proteiner. Men høj salt-ekstraktion fører til prøver indeholdende for koncentreret salt til HPLC-MS / MS. I en alternativ fremstilling kan histon fordøjelse udføres uden propionylation (sektion 6 - 8), for eksempel ved at reducere trypsin inkubationstid og enzymet / substrat-forhold 27 eller ved hjælp ArgC som fordøjelse enzym 28-30. Imidlertid er derivatisering med propionsyreanhydrid anbefales, da jegt fører til dannelsen af ​​flere hydrofobe peptider, som er bedre bevaret under væskekromatografi.

    For kemisk derivatisering, har en bred vifte af organiske syreanhydrider blevet evalueret, og deres fortjenester omfattende diskuteret 18. Ikke desto mindre, propionsyreanhydrid viste sig at det bedste kompromis mellem effektivitet, minimerede sideprodukter og forbedret peptid hydrofobicitet. Potentielt kan propionsyreanhydrid købes i isotopisk mærket form; dette giver mulighed for multiplexing analyse på grund af muligheden for at blande flere prøver og diskriminere dem på MS niveau på basis af forskellige masser bibringes fra den tunge etiket. Men denne analyse fører til en forøget kompleksitet i LC-MS kromatogram og reducerer mængden af ​​prøve, der kan injiceres til hver enkelt tilstand.

    I denne henseende bør nogle kritiske aspekter ved protokollen blive fremhævet. Følgende bør anvendes som checklist at finde fejl i at udføre proceduren i tilfælde opnås negative resultater. Først efter kerner udfældning pelleten skal omhyggeligt vasket med NIB uden NP-40 Alternativ (afsnit 2.10), indtil fuldstændig fjernelse af detergent (mærkbar ved manglen af ​​bobler under blanding). I modsat fald ville kompromittere histon ekstraktion med syrer. For det andet, efter histon udfældning med TCA (afsnit 3.9) vasker af pillen med acetone er afgørende. Tilstedeværelse af koncentreret syre vil skade det følgende trin, hvis propionylation og fordøjelse (afsnit 6.1) er direkte udføres. Det ville være ikke problematisk i tilfælde histon fraktionering udføres (afsnit 5). Det tredje er det vigtigt, at propionylation reaktion udføres hurtigt (afsnit 6.3 - 6.7). For at gøre dette, undgå at bruge den samme propionylation mix (propionsyreanhydrid + acetonitril) i mere end 3 - 4 på hinanden følgende prøver. Derudover pH er det vigtigste aspekt af trypsin fordøjelse (afsnit 7). Hvis ikkeomkring 8,0 (7,5 - 8,5) fordøjelsen vil være ineffektive. Dette kan ske, da prøven vil være rig på propionsyre på dette trin. NH4OH kan tilsættes indtil nødvendigt. Også for forskere fortrolige med proteomics arbejdsgange det vil føles normalt at forsure prøven at afslutte trypsin fordøjelse. Dette bør ikke ske, da det vil bringe følgende reaktion, dvs. propionylation af peptid N-termini (afsnit 8.1). Endelig i samme nummer, er det vigtigt at huske for dataanalyse, at ikke-modificerede peptider er faktisk ikke umodificeret; alle gratis lysinrester og N-termini vil blive besat af propionylation (56,026 Da). Således udfører ekstraktion ion kromatografi af masse, der svarer entydigt til peptidsekvensen ville føre til nogen resultater.

    Begrænsningerne ved fremgangsmåden er primært relateret til manglende evne til at detektere kombinatoriske PTMS, på grund af de korte peptidsekvenser, og skævheder i at opnå den sande abundans af en modifikation, på grund af det faktum, at peptider i forskellige modificerede former kan ionisere med forskellige effektiviteter. Det første spørgsmål kan løses ved at kombinere denne teknik med en midt-down eller top-down tilgang (revideret i 16). Denne form for analyse, selv om teknisk mere udfordrende, er ideel til at studere sameksistens frekvenser af ændringer. Desuden giver det en bedre diskrimination af histon-varianter, som ikke altid kan opnås med bottom-up, da nogle peptider har den samme sekvens i forskellige histon varianter. Det andet spørgsmål, relateret til ionisering effektivitet, kan løses ved hjælp af et bibliotek af syntetiske peptider 31. Denne fremgangsmåde sikrer en mere præcis vurdering af den relative forekomst af histon PTMS. Men i de fleste eksperimenter, det ønskede resultat er den relative udvikling af givne ændringerne mellem analyserede betingelser. I dette tilfælde, sådan korrektion ikke nødvendig, på grund af det faktum, at alle prøver har samme bias.

    Afslutningsvis denne protokol giver mulighed for analyse af histon PTMS der kan være afsluttet i 3 dage ved hjælp nLC koblet til tandem MS. Sammenligninger med andre end MS-teknikker, dvs. ved brug antistofbaserede strategier som diskuteret i indledningen, ikke er egnede, da de ikke kan opnå endnu næsten dette niveau af gennemløb. Hertil kommer, at antistof-baserede teknikker ikke mulighed for opdagelsen af ​​hidtil ukendte modifikationer, men de er alene baseret på bekræftelse og kvantificering forudsagte varemærker. Vi spekulere derfor, at bottom-up proteomics på histon-peptider vil vinde popularitet i proteomics laboratorier på grund af de intuitive fordele i at vide reguleringen af ​​histon mærker, som er hovedpersoner i tuning genekspression og således påvirke reguleringen af ​​proteom. Desuden beskrev Protokollen indeholder de seneste forbedringer i prøveforberedelse og software til dataanalyse, som gør histon analyse mere også trivielt for laboratorier, der aldrig oplevet karakterisering af denne type hypermodified peptider.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af midler fra NIH tilskud (DP2OD007447, R01GM110174 og R01AI118891).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Trypsin 0.25% EDTA Invitrogen 25200056 For harvesting cells
    PBS Invitrogen 14200075
    Tris Roche 77-86-1
    Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
    Sodium Chloride Sigma S9888
    Magnesium Chloride hexahydrate Sigma M9272
    Calcium Chloride, anhydrous Sigma C1016
    Sucrose Fisher Scientific BP220-1
    DTT Invitrogen 15508-013
    AEBSF EMD Millipore Corp 101500
    Microcystin Sigma M4194
    Sodium Butyrate Sigma B5887
    Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)  Fisher Scientific 78445
    NP- 40 Alternative CALBIOCHEM 492016
    Sulfuric Acid, ACS grade Fisher Chemical 7664-93-9
    Trichloroacetic acid Sigma T6399
    Acetone Sigma 179124
    HCl Fisher Chemical A144-500
    Bradford reagent Biorad 500-0006
    30% acrylamide/bis 29:1 — 500 ml Biorad 1610156
    Coomassie Fisher Scientific 20278
    C18 Column (5 µm) 2.1 mm x 250 mm Grace 218TP52
    C18 Column (5 µm) 4.6 mm x 250 mm Grace 218TP54
    HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
    HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
    TFA Fisher Scientific A11650
    Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
    ammonium hydroxide Sigma 338818
    propionic anhydride Sigma 240311
    Sequencing grade modified trypsin Promega PRV5113 For digesting histones for MS
    Acetic Acid Sigma 49199
    C18 extraction disk Empore 2215
    Formic Acid Sigma F0507

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Waddington, C. H. Canalization of development and the inheritance of acquired characters. Nature. 150, 563-565 (1942).
    2. Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis. 31, (1), 27-36 (2010).
    3. Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, (5532), 1089-1093 (2001).
    4. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, (4), 693-705 (2007).
    5. Tessarz, P., Kouzarides, T. Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics. Nat Rev Mol Cell Bio. 15, (11), 703-708 (2014).
    6. Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. Histone and chromatin cross-talk. Curr Opin Cell Biol. 15, (2), 172-183 (2003).
    7. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142, (5), 682-685 (2010).
    8. Simboeck, E., et al. A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors. J Biol Chem. 285, (52), 41062-41073 (2010).
    9. Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature. 438, (7071), 1176-1180 (2005).
    10. Xhemalce, B., Kouzarides, T. A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly. Genes Dev. 24, (7), 647-652 (2010).
    11. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, (6), 967-980 (2010).
    12. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19, (5), 207-217 (2009).
    13. Fernandez-Capetillo, O., et al. H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis. Dev Cell. 4, (4), 497-508 (2003).
    14. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. Embo J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
    15. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
    16. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, (12), 3419-3433 (2012).
    17. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones. J Proteome Res. 8, (11), 5367-5374 (2009).
    18. Sidoli, S., et al. Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis. Proteomics. 15, (9), 1459-1469 (2015).
    19. Lin, S., Garcia, B. A. Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry. Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).
    20. Sidoli, S., et al. SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications. Mol Cell Proteomics. (2015).
    21. Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. J Proteome Res. (2015).
    22. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra. Mol Cell Proteomics. 14, (6), 1696-1707 (2015).
    23. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, (7), 966-968 (2010).
    24. Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications. J Proteome Res. 13, (10), 4470-4478 (2014).
    25. Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (28), 11493-11498 (2013).
    26. Vonholt, C., et al. Isolation and Characterization of Histones. Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).
    27. Zhang, K. L., et al. Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 306, (2), 259-269 (2002).
    28. Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells. Plos One. 6, (1), e15960 (2011).
    29. Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications. Proteomics. 4, (5), 1382-1396 (2004).
    30. Zhao, X. L., et al. Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury. J Proteome Res. 13, (4), 2175-2186 (2014).
    31. Lin, S., et al. Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13, (9), 2450-2466 (2014).
    Komplet Workflow for Analyse af Histon post-translationelle modifikationer Brug Bottom-up-massespektrometri: Fra Histon Extraction til dataanalyse
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).More

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter