Denne protokol beskriver en fuldt integreret arbejdsgang til karakterisering histon posttranslationelle modifikationer ved hjælp af massespektrometri (MS). Arbejdsgangen omfatter histon rensning fra cellekulturer eller væv, histon derivatisering og fordøjelse, MS analyse ved hjælp af nano-flow væskekromatografi og instruktioner til dataanalyse. Protokollen er designet til færdiggørelse i 2 – 3 dage.
Nukleosomer er de mindste strukturelle enhed af kromatin, sammensat af 147 basepar af DNA snoet omkring en octamer af histon-proteiner. Histon funktion medieres af omfattende posttranslationel modifikation af et utal af kerneproteiner. Disse ændringer er kritiske for nuklear integritet som de regulerer kromatinstrukturen og rekruttere enzymer involveret i genregulering, DNA-reparation og kromosom kondens. Selvom en stor del af det videnskabelige samfund vedtager antistof-baserede teknikker til at karakterisere histon PTM overflod, disse tilgange er lave gennemløb og forudindtaget mod hypermodified proteiner, som epitopen kunne spærres af nærliggende modifikationer. Denne protokol beskriver anvendelsen af nano væskekromatografi (nLC) og massespektrometri (MS) til nøjagtig kvantificering af histon modifikationer. Denne metode er konstrueret til at specificere en lang række histon PTMS og den relative forekomst af flere histon varianter inden sIngle analyser. I denne protokol, er histoner derivatiseret med propionsyreanhydrid efterfulgt af fordøjelse med trypsin at generere peptider af 5 – 20 i TA i længden. Efter fordøjelsen, er den nyligt eksponerede N-termini af histon peptider derivatiseres at forbedre kromatografisk retention under nLC-MS. Denne metode giver mulighed for den relative kvantificering af histon PTMS spænder fire størrelsesordener.
Epigenetik defineres som studiet af arvelige ændringer i genekspression, der opstår af andre end at ændre den underliggende DNA sekvens 1 mekanismer. Epigenetisk regulering er kritisk under udvikling som organismen undergår dramatiske fænotypiske ændringer selv om dens DNA-indhold ikke ændres. Der er flere kritiske komponenter, der kræves for korrekt epigenetisk vedligeholdelse, herunder histon post-translationelle modifikationer (PTMS), histon varianter, ikke-kodende RNA'er, DNA-methylering og DNA-bindende faktorer, som hver især påvirker genekspression gennem forskellige mekanismer 2. For eksempel, mens DNA-methylering er en meget stabil modifikation, der undertrykker gentranslation 3, histon varianter og histon PTMS er langt mere dynamisk og kan påvirke chromatin i en række forskellige måder 4.
Histon PTMS oftest lokaliseret på den N-terminale haler, da de er de mest udsatte og fleksible områdeaf proteinet. Men den nukleosom kerne også stærkt modificeret i forhold til gennemsnittet proteiner 5. Selvom histon-mærker er blevet grundigt karakteriseret i det sidste årti, mange forbindelser mellem kendte histon mærker og deres funktion er stadig uklart. Dette skyldes i høj grad, at de fleste histon PTMS ikke arbejde alene, men snarere fungerer sammen med andre PTMS ( "cross-talk") til at ændre en bestemt proces, såsom transskription 6,7. For eksempel den kombinatoriske mark H3S10K14ac af genet p21 aktiverer dens transkription, som ikke ville forekomme med kun én af de to PTMS 8. De protein HP1 kompakte kromatin ved at anerkende H3K9me2 / ME3 og sprede ændring nærliggende nukleosomer. Dog kan HP1 ikke binde H3K9me2 / 3, når det tilstødende S10 phosphoryleres 9. Acetylering af H3K4 inhiberer binding af proteinet spChp1 til H3K9me2 / me3 i Schizosaccharomyces pombe 10. Endvidere histon lysin demethylase PHF8 har den højeste nukleosom bindende effektivitet, når tre PTMS H3K4me3, K9ac, og K14ac er til stede 11. Disse eksempler fremhæver betydningen af at opnå et samlet overblik over histon PTM ændringer snarere end at fokusere på enkelte ændringer.
Tilstedeværelsen af sekvensvarianter også øger kompleksiteten af histon-analyse, som histon isotyper har generelt yderst lignende sekvenser, men ofte har forskellige roller i kromatin. For eksempel H2A.x har en C-terminal sekvens, som lettere phosphoryleret ved DNA skade i forhold til kanonisk H2A 12, og det er nødvendigt for at inaktivere kønskromosomer i hanmus meiose 13; Tilsvarende CENP-A erstatter kanoniske histon H3 i centromerer 14. Trods deres forskellige funktioner, disse varianter deler en stor del af deres aminosyresekvens med den respektive kanoniske histon, hvilket gør det vanskeligt at identificere og kvantificere dem separat. </p>
Antistof-baserede teknikker, såsom western blotting er blevet grundigt vedtaget at karakterisere histoner. Men antistofbaserede tilgange er begrænset af følgende årsager: (i) de kan kun bekræfte tilstedeværelsen af en ændring, og kan ikke identificere ukendte PTMS; (Ii) de er forspændt på grund af tilstedeværelsen af sameksisterende varemærker, som kan påvirke bindingsaffinitet; (iii) de kan ikke identificere kombinatoriske mærker, som kun meget få antistoffer er til rådighed til dette formål og (iv) de krydsreagere mellem højt lignende histon varianter eller lignende PTMS (f.eks di- og trimethylation af lysin rester). Egelhofer et al. beskrevet, at mere end 25% af kommercielle antistoffer mislykkes specificitetstests ved dot blot eller western blot, og blandt specifikke antistoffer over 20% mislykkes i kromatin immunopræcipitationsforsøg 15. Massespektrometri (MS) er i øjeblikket den mest passende analytisk værktøj til at studere nye og / eller kombinatoriske PTMS,og det er blevet grundigt implementeret for histonproteiner (gennemgået i 16). Dette er for det meste på grund af høj følsomhed og masse nøjagtighed MS, og muligheden for at udføre storstilet analyser.
Bottom-up strategi er den mest almindeligt anvendte MS-baserede proteomics strategi for histon karakterisering og deres PTMS, hvori det intakte protein fordøjes enzymatisk i korte peptider (5 – 20 i TA). Denne fordøjelse fremmer såvel LC separation og MS-detektion. Masser i området fra 600 – 2.000 Da almindeligvis lettere ioniseret og identificeres med højere masse nøjagtighed og opløsning end større masser. MS / MS fragmentering er også forbedret, så korte peptider er generelt velegnede til kollision induceret dissociation (CID). Imidlertid histoner udgør en udfordring for bottom-up MS, da de er stærkt beriget med basiske aminosyrerester, nemlig lysin og arginin. Derfor trypsinfordøjelse fører til dannelsen af peptider, der er for smalle for LC fastholdelse og entydig lokalisering af PTMS. For at omgå dette problem ved vores protokol omfatter lysin og peptid N-terminalt kemisk derivatisering 17. Det anbefales at bruge af propionsyreanhydrid til effektiv kemisk derivatisering i sammenligning med andre reagenser 18. Sådanne derivatisering blokerer ɛ-aminogrupperne i umodificerede og monomethylsteroler lysinrester, hvilket tillader trypsin at udføre proteolyse kun ved C-terminalen af argininrester. Derivatiserede aminer kan ikke udveksle protoner med løsningen og dermed peptiderne er generelt kun dobbelt eller tredobbelt opladet, letter MS og MS / MS detektion. Endvidere N-terminal derivatisering forøger peptid hydrofobicitet og dermed omvendt fase kromatografisk fastholdelse. Her beskriver vi arbejdsgangen at rense histoner og forberede dem til PTM-analyse via bottom-up proteomics (figur 1). Denne strategi opnår kvantificering af enkelte histon mærker og kombinatoriske mærker feller histon-PTMS der er relativt tæt på aminosyresekvensen.
Den her beskrevne protokol er optimeret overvejer omkostninger, tid og ydelse. Andre præparater er mulige, men de har begrænsninger, især i tilfælde af kobling med MS-analyse. For eksempel kan den høje salt ekstraktionsprotokol anvendes til at oprense histoner 26 i stedet for TCA-præcipitation (afsnit 3). High-salt protokollen er uløseligt mildere, da den ikke anvender stærk syre. Dette bevarer syrelabile PTMS og forøger udbyttet af ekstraherede histoner, som TCA-præcipitation co-udfældes mange andre kromatin bindende proteiner. Men høj salt-ekstraktion fører til prøver indeholdende for koncentreret salt til HPLC-MS / MS. I en alternativ fremstilling kan histon fordøjelse udføres uden propionylation (sektion 6 – 8), for eksempel ved at reducere trypsin inkubationstid og enzymet / substrat-forhold 27 eller ved hjælp ArgC som fordøjelse enzym 28-30. Imidlertid er derivatisering med propionsyreanhydrid anbefales, da jegt fører til dannelsen af flere hydrofobe peptider, som er bedre bevaret under væskekromatografi.
For kemisk derivatisering, har en bred vifte af organiske syreanhydrider blevet evalueret, og deres fortjenester omfattende diskuteret 18. Ikke desto mindre, propionsyreanhydrid viste sig at det bedste kompromis mellem effektivitet, minimerede sideprodukter og forbedret peptid hydrofobicitet. Potentielt kan propionsyreanhydrid købes i isotopisk mærket form; dette giver mulighed for multiplexing analyse på grund af muligheden for at blande flere prøver og diskriminere dem på MS niveau på basis af forskellige masser bibringes fra den tunge etiket. Men denne analyse fører til en forøget kompleksitet i LC-MS kromatogram og reducerer mængden af prøve, der kan injiceres til hver enkelt tilstand.
I denne henseende bør nogle kritiske aspekter ved protokollen blive fremhævet. Følgende bør anvendes som checklist at finde fejl i at udføre proceduren i tilfælde opnås negative resultater. Først efter kerner udfældning pelleten skal omhyggeligt vasket med NIB uden NP-40 Alternativ (afsnit 2.10), indtil fuldstændig fjernelse af detergent (mærkbar ved manglen af bobler under blanding). I modsat fald ville kompromittere histon ekstraktion med syrer. For det andet, efter histon udfældning med TCA (afsnit 3.9) vasker af pillen med acetone er afgørende. Tilstedeværelse af koncentreret syre vil skade det følgende trin, hvis propionylation og fordøjelse (afsnit 6.1) er direkte udføres. Det ville være ikke problematisk i tilfælde histon fraktionering udføres (afsnit 5). Det tredje er det vigtigt, at propionylation reaktion udføres hurtigt (afsnit 6.3 – 6.7). For at gøre dette, undgå at bruge den samme propionylation mix (propionsyreanhydrid + acetonitril) i mere end 3 – 4 på hinanden følgende prøver. Derudover pH er det vigtigste aspekt af trypsin fordøjelse (afsnit 7). Hvis ikkeomkring 8,0 (7,5 – 8,5) fordøjelsen vil være ineffektive. Dette kan ske, da prøven vil være rig på propionsyre på dette trin. NH4OH kan tilsættes indtil nødvendigt. Også for forskere fortrolige med proteomics arbejdsgange det vil føles normalt at forsure prøven at afslutte trypsin fordøjelse. Dette bør ikke ske, da det vil bringe følgende reaktion, dvs. propionylation af peptid N-termini (afsnit 8.1). Endelig i samme nummer, er det vigtigt at huske for dataanalyse, at ikke-modificerede peptider er faktisk ikke umodificeret; alle gratis lysinrester og N-termini vil blive besat af propionylation (56,026 Da). Således udfører ekstraktion ion kromatografi af masse, der svarer entydigt til peptidsekvensen ville føre til nogen resultater.
Begrænsningerne ved fremgangsmåden er primært relateret til manglende evne til at detektere kombinatoriske PTMS, på grund af de korte peptidsekvenser, og skævheder i at opnå den sande abundans af en modifikation, på grund af det faktum, at peptider i forskellige modificerede former kan ionisere med forskellige effektiviteter. Det første spørgsmål kan løses ved at kombinere denne teknik med en midt-down eller top-down tilgang (revideret i 16). Denne form for analyse, selv om teknisk mere udfordrende, er ideel til at studere sameksistens frekvenser af ændringer. Desuden giver det en bedre diskrimination af histon-varianter, som ikke altid kan opnås med bottom-up, da nogle peptider har den samme sekvens i forskellige histon varianter. Det andet spørgsmål, relateret til ionisering effektivitet, kan løses ved hjælp af et bibliotek af syntetiske peptider 31. Denne fremgangsmåde sikrer en mere præcis vurdering af den relative forekomst af histon PTMS. Men i de fleste eksperimenter, det ønskede resultat er den relative udvikling af givne ændringerne mellem analyserede betingelser. I dette tilfælde, sådan korrektion ikke nødvendig, på grund af det faktum, at alle prøver har samme bias.
Afslutningsvis denne protokol giver mulighed for analyse af histon PTMS der kan være afsluttet i 3 dage ved hjælp nLC koblet til tandem MS. Sammenligninger med andre end MS-teknikker, dvs. ved brug antistofbaserede strategier som diskuteret i indledningen, ikke er egnede, da de ikke kan opnå endnu næsten dette niveau af gennemløb. Hertil kommer, at antistof-baserede teknikker ikke mulighed for opdagelsen af hidtil ukendte modifikationer, men de er alene baseret på bekræftelse og kvantificering forudsagte varemærker. Vi spekulere derfor, at bottom-up proteomics på histon-peptider vil vinde popularitet i proteomics laboratorier på grund af de intuitive fordele i at vide reguleringen af histon mærker, som er hovedpersoner i tuning genekspression og således påvirke reguleringen af proteom. Desuden beskrev Protokollen indeholder de seneste forbedringer i prøveforberedelse og software til dataanalyse, som gør histon analyse mere også trivielt for laboratorier, der aldrig oplevet karakterisering af denne type hypermodified peptider.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra NIH tilskud (DP2OD007447, R01GM110174 og R01AI118891).
Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 25200056 | For harvesting cells |
PBS | Invitrogen | 14200075 | |
Tris | Roche | 77-86-1 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Calcium Chloride, anhydrous | Sigma | C1016 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
AEBSF | EMD Millipore Corp | 101500 | |
Microcystin | Sigma | M4194 | |
Sodium Butyrate | Sigma | B5887 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) | Fisher Scientific | 78445 | |
NP-40 Alternative | CALBIOCHEM | 492016 | |
Sulfuric Acid, ACS grade | Fisher Chemical | 7664-93-9 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
Acetone | Sigma | 179124 | |
HCl | Fisher Chemical | A144-500 | |
Bradford reagent | Biorad | 500-0006 | |
30% acrylamide/bis 29:1 — 500ml | Biorad | 1610156 | |
Coomassie | Fisher Scientific | 20278 | |
C18 Column (5um) 2.1mm x 250mm | Grace | 218TP52 | |
C18 Column (5um) 4.6mm x 250mm | Grace | 218TP54 | |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 338818 | |
propionic anhydride | Sigma | 240311 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | PRV5113 | For digesting histones for MS |
Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
C18 extraction disk | Empore | 2215 | |
Formic Acid | Sigma | F0507 |