Denne protokollen beskriver et fullstendig integrert arbeidsflyt for karakterisering av histon post-translasjonelle modifikasjoner ved bruk av massespektroskopi (MS). Arbeidsflyten inkluderer histone rensing fra cellekulturer eller vev, histon derivatisering og fordøyelse, MS analyse ved hjelp av nano-flow væskekromatografi og instruksjoner for dataanalyse. Protokollen er utformet for ferdigstillelse innen 2 – 3 dager.
Nukleosomer er den minste strukturelle enhet av kromatin, som består av 147 basepar av DNA pakket rundt en octamer av histonproteinene. Histon-funksjonen er mediert av omfattende post-translasjonell modifikasjon av en myriade av kjerneproteiner. Disse endringene er kritiske for kjernefysisk integritet som de regulerer kromatinstruktur og rekruttere enzymer involvert i genregulering, DNA-reparasjon og kromosom kondens. Selv om en stor del av det vitenskapelige samfunnet vedtar antistoff-baserte teknikker for å karakter histon PTM overflod, disse metodene er lav gjennomstrømning og forutinntatt mot hypermodified proteiner, som epitop kan bli hindret av nærliggende modifikasjoner. Denne protokollen beskriver bruken av nano-væskekromatografi (NLC) og massespektrometri (MS) for nøyaktig kvantifisering av histonmodifikasjonene. Denne fremgangsmåte er utviklet for å karakterisere et stort utvalg av histon PTMs og den relative overflod av flere histon-varianter innenfor single analyser. I denne protokollen, histoner derivatisert med propionsyreanhydrid fulgt av spalting med trypsin for å generere peptider fra 5 – 20 aa i lengde. Etter spaltning, blir den nylig eksponerte N-termini av histon peptidene derivatiseres for å forbedre kromatografisk retensjon under NLC-MS. Denne metoden gjør det mulig for den relative kvantifisering av histone PTMs spenner fire størrelsesordener.
Epigenetikk er definert som studiet av arvelige endringer i genekspresjon som oppstår av andre enn å endre den underliggende DNA-sekvens 1 mekanismer. Epigenetisk regulering er kritisk under utvikling som organismen gjennomgår dramatiske fenotypiske endringer selv om det er DNA-innhold ikke endres. Det er flere kritiske komponenter som er nødvendige for riktig epigenetisk vedlikehold, deriblant histon post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), histon varianter, ikke-kodende RNA, DNA-metylering og DNA-bindende faktorer, som hver for seg påvirker genekspresjon gjennom ulike mekanismer 2. For eksempel, mens DNA-metylering er en meget stabil modifikasjon som undertrykker gen oversettelse 3, histon varianter og histon PTMs er mye mer dynamisk og kan påvirke kromatin i en rekke måter 4.
Histone PTMs er hovedsakelig lokalisert på N-terminal haler, som de er de mest utsatte og fleksible regionav proteinet. Imidlertid er nucleosome kjernen også sterkt modifisert i forhold til gjennomsnittlig proteiner 5. Selv om histone merkene har blitt omfattende karakterisert ved det siste tiåret, mange koblinger mellom kjente histone merker og deres funksjon er fortsatt uklart. Dette skyldes i stor grad at de fleste histone PTMs ikke fungerer alene, men heller fungerer i tandem med andre PTMs ( "cross-talk") for å endre en bestemt prosess som transkripsjon 6,7. For eksempel, den kombinatorisk merket H3S10K14ac av genet p21 aktiverer dens transkripsjon, og som ikke ville oppstå med bare en av de to PTMs 8. De protein HP1 komprimerer kromatin ved å anerkjenne H3K9me2 / ME3 og spre modifikasjon til nærliggende nucleosomes. Men HP1 kan ikke binde H3K9me2 / 3 når den tilstøtende S10 er fosforylert 9. Acetylering av H3K4 hemmer binding av protein spChp1 til H3K9me2 / ME3 i Schizosaccharomyces pombe 10. Videre histon lysin demethylase PHF8 har høyest nucleosome bindende effektivitet når tre PTMs H3K4me3, K9ac, og K14ac er til stede 11. Disse eksemplene markere betydningen av å oppnå en global oversikt over histone PTM endringer heller enn å fokusere på enkelt modifikasjoner.
Tilstedeværelsen av sekvensvarianter også øker kompleksiteten av histon-analyse, som histon isotypene generelt har meget lignende sekvenser, men ofte har forskjellige roller i kromatin. For eksempel har H2A.x en C-terminal sekvens som er lettere fosforyleres på DNA skade enn kanoniske H2A 12, og det er nødvendig for inaktivering av kjønnskromosomer i hannmus meiose 13; på samme måte, CENP-A erstatter kanoniske histon H3 i sentromerer 14. Til tross for deres forskjellige funksjoner, disse variantene har en stor del av deres aminosyre-sekvens med de respektive kanoniske histon, noe som gjør det vanskelig å identifisere og kvantifisere dem separat. </p>
Antistoff-baserte teknikker som western blotting har vært mye i bruk for å karakterisere histoner. Imidlertid antistoffbaserte tilnærminger er begrenset av følgende årsaker: (i) de kan bare bekrefte tilstedeværelse av en modifikasjon, og kan ikke identifisere ukjente PTMs; (Ii) de er forspent på grunn av nærværet av ko-eksisterende merker, noe som kan påvirke bindingsaffinitet; (iii) de kan ikke identifisere kombinatoriske merker, som kun meget få antistoffer som er tilgjengelige for slike formål, og (iv) de kryssreagere mellom svært like histon varianter eller lignende PTMs (for eksempel di- og trimethylation av lysinrester). Egelhofer et al. beskrevet at mer enn 25% av kommersielle antistoffer svikte spesifisitet tester ved dot blot og Western blot, og blant spesifikke antistoffer mer enn 20% mislykkes i kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter 15. Massespektrometri (MS) er for tiden den mest egnede analytiske verktøy for å studere nye og / eller kombinatoriske PTMs,og det har blitt grundig gjennomført for histonproteinene (anmeldt i 16). Dette er hovedsakelig på grunn av høy følsomhet og masse nøyaktigheten av MS, og muligheten til å utføre storskala analyser.
The bottom-up strategi er den mest brukte MS-baserte proteomikk strategi for histon karakterisering og deres PTMs, hvor intakt protein enzymatisk fordøyd i korte peptider (5-20 AA). Dette fordøyelsen forenkler både LC separasjon og MS deteksjon. Massene i området fra 600 – 2000 Da blir ofte lettere ionisert og identifisert med høyere masse nøyaktighet og oppløsning enn større masser. MS / MS-fragmenteringen blir også forbedret, som korte peptider er generelt godt egnet for kollisjon indusert dissosiasjon (CID). Men histoner en utfordring for bottom-up MS som de er høyanriket i grunnleggende aminosyreresidier, nemlig lysin og arginin. Derfor fører trypsin fordøyelse til generering av peptider som er for smalt for LC retensjon og entydig lokalisering av PTMs. For å omgå dette problemet, inkluderer vår protokoll lysin og peptid N-terminal kjemisk derivatisering 17. Bruk av propionsyreanhydrid anbefales for effektiv kjemisk derivatisering i forhold til andre reagenser 18. Slike derivatiseringsreaksjoner blokkerer ɛ-amino grupper av umodifiserte og monometyl- lysinrester, slik at trypsin for å utføre proteolyse bare ved C-terminal av argininrester. Derivatiserte aminer kan ikke utveksle protoner med oppløsningen og således peptidene er vanligvis bare dobbelt eller tredobbelt ladet, tilrettelegging MS og MS / MS-deteksjon. Videre øker N-terminale peptid derivatisering hydrofobisitet og derved reversert-fase-kromatografisk retensjon. Her beskriver vi arbeidsflyten å rense histoner og forberede dem for PTM analyse via bottom-up proteomikk (figur 1). Denne strategien oppnår kvantifisering av enkelt histone merker og kombinatoriske merker feller histon PTMs som er relativt nær i aminosyresekvensen.
Protokollen er beskrevet her er optimalisert med tanke på kostnader, tid og ytelse. Andre preparater er mulig, men de har begrensninger, særlig i tilfellet med kobling med MS-analyse. For eksempel kan det med høy saltutvinning protokoll anvendes for å rense histoner 26 i stedet for TCA-utfelling (avsnitt 3). Høy-salt-protokollen er egen mildere, da den ikke bruker sterk syre. Dette bevarer syre-labile PTMs og øker utbyttet av utvunnet histoner, som TCA nedbør co-utfellinger mange andre kromatin bindende proteiner. Imidlertid medfører høy saltutvinning til prøver inneholdende for konsentrert salt for HPLC-MS / MS. I en alternativ fremstilling kan histon fordøyelse utføres uten propionylering (seksjon 6 – 8), for eksempel ved å redusere trypsin inkubasjonstid og enzym / substrat-forhold 27 eller ved hjelp av argc som kutteenzym 28-30. Imidlertid er derivatisering med propionsyreanhydrid anbefalt, som jegt fører til genereringen av flere hydrofobe peptider, som er bedre beholdt i løpet av væskekromatografi.
For kjemisk derivatisering, har en rekke organiske syre anhydrider blitt evaluert og sine meritter grundig diskutert 18. Ikke desto mindre, propionsyreanhydrid viste seg å være den beste kompromiss mellom effektivitet, minimeres sideprodukter og forbedret peptid hydrofobisitet. Potensielt kan propionsyreanhydrid kjøpes i isotopically merket form; Dette gjør det mulig for multipleksing analyse på grunn av muligheten for å blande flere prøver og diskriminere dem på nivå MS basert på de ulike masser formidles fra den tunge etiketten. Imidlertid fører denne analysen til en økt kompleksitet av LC-MS-kromatogram og reduserer mengden av prøve som kan injiseres for hver enkelt tilstand.
I denne forbindelse bør noen kritiske aspekter av protokollen bli markert. Følgende bør brukes som checklist for å finne feil i å utføre fremgangsmåten i tilfelle negative resultater oppnås. Først etter kjerner utfelling pellet bør være nøye vasket med NIB uten NP-40 Alternative (avsnitt 2.10) inntil fullstendig fjerning av detergent (merkbar ved mangel av bobler under blandingen). Unnlate å gjøre det ville kompromittere histone ekstraksjon med syrer. For det andre, etter histon nedbør med TCA (§ 3.9) vasker av pelleten med aceton er avgjørende. Tilstedeværelse av konsentrert syre ville skade følgende trinnet hvis propionylering og fordøyelse (§ 6.1) er direkte utført. Det ville ikke være problematisk i tilfelle histon fraksjoner (kapittel 5) utføres. For det tredje er det viktig at propionylering reaksjonen utføres raskt (avsnitt 6.3 til 6.7). For å gjøre dette, unngå å bruke den samme propionylering mix (propionsyreanhydrid + acetonitril) for mer enn 3 – 4 påfølgende prøver. I tillegg er pH det viktigste aspektet av trypsin fordøyelse (kapittel 7). Hvis ikkerundt 8,0 (7,5 til 8,5) fordøyelse vil være ineffektiv. Dette kan skje, som i prøven vil være rik på propion- syre ved dette trinnet. NH4OH kan tilsettes inntil det er nødvendig. Også for forskere som er kjent med proteomikk arbeidsflyt vil det føles normalt å forsurer prøven for å avslutte trypsin fordøyelsen. Dette bør ikke gjøres, da det vil sette følgende reaksjon, dvs. propionylering av peptid N-termini (punkt 8.1). Til slutt, i det samme problemet, er det viktig å huske for dataanalyse som umodifiserte peptider er faktisk ikke-modifisert; alt gratis lysinresidier og N-termini vil bli okkupert av propionylering (56,026 Da). Således utfører ekstraksjon ionekromatografi av massen som svarer entydig til peptidsekvensen ville føre til ingen resultater.
Begrensningene for fremgangsmåten er stort sett knyttet til den manglende evne til å påvise kombinatoriske PTMs, på grunn av den korte peptidsekvenser, og de skjevheter i å oppnå den sanne abundans av en modifikasjon, på grunn av det faktum at peptider i forskjellige modifiserte former kan ionisere med forskjellig effektivitet. Den første utgaven kan løses ved å kombinere denne teknikken med en midt-ned eller top-down tilnærming (anmeldt i 16). Denne type analyse, selv om teknisk mer krevende, er ideelt for å studere sameksistens frekvenser modifikasjoner. Dessuten blir bedre diskriminering av histone varianter, som ikke alltid kan oppnås med bottom-up siden noen peptider har samme sekvens i ulike histone varianter. Det andre problemet, relatert til ionisering effektivitet, kan løses ved hjelp av et bibliotek av syntetiske peptider 31. Denne tilnærmingen sikrer en mer nøyaktig vurdering av den relative overflod av histone PTMs. Men i de fleste eksperimenter, er det ønskede resultatet relative endringer av gitte modifikasjoner mellom analyserte forhold. I dette tilfelle, er en slik korreksjon ikke er nødvendig, på grunn av det faktum at alle prøvene har de samme bias.
Som konklusjon, gir denne protokollen for analyse av histone PTMs som kan være ferdig i 3 dager ved hjelp av NLC koblet til tandem MS. Sammenligninger med andre enn MS-teknikker, dvs. ved hjelp av antistoffbaserte strategier som er omtalt i innledningen, er ikke egnet, da de ikke kan oppnå enda nesten dette nivået av gjennomstrømning. I tillegg trenger antistoffbaserte teknikker ikke tillate for oppdagelsen av nye modifikasjoner, men de er utelukkende basert på bekrefter og kvantifisering av predikerte merker. Vi spekulerer derfor at bottom-up proteomikk på histone peptider vil vinne popularitet i proteomikk laboratorier på grunn av intuitive fordeler i å vite reguleringen av histone merker, som er hovedpersonene i tuning genekspresjon og dermed påvirke reguleringen av proteomet. Videre protokollen beskrevet omfatter siste forbedringer i prøveopparbeidelse og programvare for dataanalyse, som gjør histone analyse mer trivielle også for laboraToryene som aldri opplevd karakterisering av denne typen hypermodified peptider.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler fra NIH tilskudd (DP2OD007447, R01GM110174 og R01AI118891).
Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 25200056 | For harvesting cells |
PBS | Invitrogen | 14200075 | |
Tris | Roche | 77-86-1 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Calcium Chloride, anhydrous | Sigma | C1016 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
AEBSF | EMD Millipore Corp | 101500 | |
Microcystin | Sigma | M4194 | |
Sodium Butyrate | Sigma | B5887 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) | Fisher Scientific | 78445 | |
NP-40 Alternative | CALBIOCHEM | 492016 | |
Sulfuric Acid, ACS grade | Fisher Chemical | 7664-93-9 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
Acetone | Sigma | 179124 | |
HCl | Fisher Chemical | A144-500 | |
Bradford reagent | Biorad | 500-0006 | |
30% acrylamide/bis 29:1 — 500ml | Biorad | 1610156 | |
Coomassie | Fisher Scientific | 20278 | |
C18 Column (5um) 2.1mm x 250mm | Grace | 218TP52 | |
C18 Column (5um) 4.6mm x 250mm | Grace | 218TP54 | |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 338818 | |
propionic anhydride | Sigma | 240311 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | PRV5113 | For digesting histones for MS |
Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
C18 extraction disk | Empore | 2215 | |
Formic Acid | Sigma | F0507 |