Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse

doi: 10.3791/54112 Published: May 17, 2016

Summary

Denne protokollen beskriver et fullstendig integrert arbeidsflyt for karakterisering av histon post-translasjonelle modifikasjoner ved bruk av massespektroskopi (MS). Arbeidsflyten inkluderer histone rensing fra cellekulturer eller vev, histon derivatisering og fordøyelse, MS analyse ved hjelp av nano-flow væskekromatografi og instruksjoner for dataanalyse. Protokollen er utformet for ferdigstillelse innen 2 - 3 dager.

Abstract

Nukleosomer er den minste strukturelle enhet av kromatin, som består av 147 basepar av DNA pakket rundt en octamer av histonproteinene. Histon-funksjonen er mediert av omfattende post-translasjonell modifikasjon av en myriade av kjerneproteiner. Disse endringene er kritiske for kjernefysisk integritet som de regulerer kromatinstruktur og rekruttere enzymer involvert i genregulering, DNA-reparasjon og kromosom kondens. Selv om en stor del av det vitenskapelige samfunnet vedtar antistoff-baserte teknikker for å karakter histon PTM overflod, disse metodene er lav gjennomstrømning og forutinntatt mot hypermodified proteiner, som epitop kan bli hindret av nærliggende modifikasjoner. Denne protokollen beskriver bruken av nano-væskekromatografi (NLC) og massespektrometri (MS) for nøyaktig kvantifisering av histonmodifikasjonene. Denne fremgangsmåte er utviklet for å karakterisere et stort utvalg av histon PTMs og den relative overflod av flere histon-varianter innenfor single analyser. I denne protokollen, histoner derivatisert med propionsyreanhydrid fulgt av spalting med trypsin for å generere peptider fra 5 - 20 aa i lengde. Etter spaltning, blir den nylig eksponerte N-termini av histon peptidene derivatiseres for å forbedre kromatografisk retensjon under NLC-MS. Denne metoden gjør det mulig for den relative kvantifisering av histone PTMs spenner fire størrelsesordener.

Introduction

Epigenetikk er definert som studiet av arvelige endringer i genekspresjon som oppstår av andre enn å endre den underliggende DNA-sekvens 1 mekanismer. Epigenetisk regulering er kritisk under utvikling som organismen gjennomgår dramatiske fenotypiske endringer selv om det er DNA-innhold ikke endres. Det er flere kritiske komponenter som er nødvendige for riktig epigenetisk vedlikehold, deriblant histon post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), histon varianter, ikke-kodende RNA, DNA-metylering og DNA-bindende faktorer, som hver for seg påvirker genekspresjon gjennom ulike mekanismer 2. For eksempel, mens DNA-metylering er en meget stabil modifikasjon som undertrykker gen oversettelse 3, histon varianter og histon PTMs er mye mer dynamisk og kan påvirke kromatin i en rekke måter 4.

Histone PTMs er hovedsakelig lokalisert på N-terminal haler, som de er de mest utsatte og fleksible regionav proteinet. Imidlertid er nucleosome kjernen også sterkt modifisert i forhold til gjennomsnittlig proteiner 5. Selv om histone merkene har blitt omfattende karakterisert ved det siste tiåret, mange koblinger mellom kjente histone merker og deres funksjon er fortsatt uklart. Dette skyldes i stor grad at de fleste histone PTMs ikke fungerer alene, men heller fungerer i tandem med andre PTMs ( "cross-talk") for å endre en bestemt prosess som transkripsjon 6,7. For eksempel, den kombinatorisk merket H3S10K14ac av genet p21 aktiverer dens transkripsjon, og som ikke ville oppstå med bare en av de to PTMs 8. De protein HP1 komprimerer kromatin ved å anerkjenne H3K9me2 / ME3 og spre modifikasjon til nærliggende nucleosomes. Men HP1 kan ikke binde H3K9me2 / 3 når den tilstøtende S10 er fosforylert 9. Acetylering av H3K4 hemmer binding av protein spChp1 til H3K9me2 / ME3 i Schizosaccharomyces pombe 10. Videre histon lysin demethylase PHF8 har høyest nucleosome bindende effektivitet når tre PTMs H3K4me3, K9ac, og K14ac er til stede 11. Disse eksemplene markere betydningen av å oppnå en global oversikt over histone PTM endringer heller enn å fokusere på enkelt modifikasjoner.

Tilstedeværelsen av sekvensvarianter også øker kompleksiteten av histon-analyse, som histon isotypene generelt har meget lignende sekvenser, men ofte har forskjellige roller i kromatin. For eksempel har H2A.x en C-terminal sekvens som er lettere fosforyleres på DNA skade enn kanoniske H2A 12, og det er nødvendig for inaktivering av kjønnskromosomer i hannmus meiose 13; på samme måte, CENP-A erstatter kanoniske histon H3 i sentromerer 14. Til tross for deres forskjellige funksjoner, disse variantene har en stor del av deres aminosyre-sekvens med de respektive kanoniske histon, noe som gjør det vanskelig å identifisere og kvantifisere dem separat. Antistoff-baserte teknikker som western blotting har vært mye i bruk for å karakterisere histoner. Imidlertid antistoffbaserte tilnærminger er begrenset av følgende årsaker: (i) de kan bare bekrefte tilstedeværelse av en modifikasjon, og kan ikke identifisere ukjente PTMs; (Ii) de er forspent på grunn av nærværet av ko-eksisterende merker, noe som kan påvirke bindingsaffinitet; (iii) de kan ikke identifisere kombinatoriske merker, som kun meget få antistoffer som er tilgjengelige for slike formål, og (iv) de kryssreagere mellom svært like histon varianter eller lignende PTMs (for eksempel di- og trimethylation av lysinrester). Egelhofer et al. beskrevet at mer enn 25% av kommersielle antistoffer svikte spesifisitet tester ved dot blot og Western blot, og blant spesifikke antistoffer mer enn 20% mislykkes i kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter 15. Massespektrometri (MS) er for tiden den mest egnede analytiske verktøy for å studere nye og / eller kombinatoriske PTMs,og det har blitt grundig gjennomført for histonproteinene (anmeldt i 16). Dette er hovedsakelig på grunn av høy følsomhet og masse nøyaktigheten av MS, og muligheten til å utføre storskala analyser.

The bottom-up strategi er den mest brukte MS-baserte proteomikk strategi for histon karakterisering og deres PTMs, hvor intakt protein enzymatisk fordøyd i korte peptider (5-20 AA). Dette fordøyelsen forenkler både LC separasjon og MS deteksjon. Massene i området fra 600 - 2000 Da blir ofte lettere ionisert og identifisert med høyere masse nøyaktighet og oppløsning enn større masser. MS / MS-fragmenteringen blir også forbedret, som korte peptider er generelt godt egnet for kollisjon indusert dissosiasjon (CID). Men histoner en utfordring for bottom-up MS som de er høyanriket i grunnleggende aminosyreresidier, nemlig lysin og arginin. Derfor fører trypsin fordøyelse til generering av peptider som er for smalt for LC retensjon og entydig lokalisering av PTMs. For å omgå dette problemet, inkluderer vår protokoll lysin og peptid N-terminal kjemisk derivatisering 17. Bruk av propionsyreanhydrid anbefales for effektiv kjemisk derivatisering i forhold til andre reagenser 18. Slike derivatiseringsreaksjoner blokkerer ɛ-amino grupper av umodifiserte og monometyl- lysinrester, slik at trypsin for å utføre proteolyse bare ved C-terminal av argininrester. Derivatiserte aminer kan ikke utveksle protoner med oppløsningen og således peptidene er vanligvis bare dobbelt eller tredobbelt ladet, tilrettelegging MS og MS / MS-deteksjon. Videre øker N-terminale peptid derivatisering hydrofobisitet og derved reversert-fase-kromatografisk retensjon. Her beskriver vi arbeidsflyten å rense histoner og forberede dem for PTM analyse via bottom-up proteomikk (figur 1). Denne strategien oppnår kvantifisering av enkelt histone merker og kombinatoriske merker feller histon PTMs som er relativt nær i aminosyresekvensen.

Protocol

1. Samling av celler fra kultur

  1. Hvis celler ble dyrket i suspensjon, samle celler ved sentrifugering ved 300 RCF i 5 min. Hvis tilhenger, aspirer og kast celle medium. Skyll vedlagte cellene med PBS uten Ca 2+ og Mg 2+ (referert til som PBS fremover). Inkuber cellene i enten trypsin eller trypsin-EDTA (0,025% - 0,5%, avhengig av cellelinjen) med tilstrekkelig volum til å dekke overflaten av platene ved 37 ° C inntil cellene løsner (tiden varierer for forskjellige cellelinjer).
  2. Samle celler ved sentrifugering ved 300 RCF i 5 min. Vask cellene to ganger i PBS og samle ved sentrifugering.
  3. Anslå hematokrit omtrent fra skoleavslutninger merket på 1,8 ml rør eller 15 ml koniske rør.
    Merk: Celler fra kultur kan hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C på ubestemt tid på dette stadiet.

2. Isolering av Nuclei fra intakte celler

  • Tine celler på is.
  • Tine atom isolasjon buffer (NIB, tabell 1).
  • Forbered ca 5 ml NIB buffer (tabell 1) for hver 100 ul hematokrit. For hver 1 ml NIB buffer, tilsett protease inhibitorer og stabiliseringsmidler som følger: 1 ul av 1 M DTT, 2,5 pl av 200 mM AEBSF, 2 ul av 2,5 uM mikrocystin og 2 ul av 5 M natriumbutyrat. NIB med inhibitorer vil bli referert til som NIB fra dette tidspunktet.
    Merk: Hvis histone fosforylering er studert, har EDTA gratis protease og fosfatase inhibitor cocktail.
  • Fjerne en femte volum av buffer NIB således fremstilt og legge til NP-40 Alternativ (tabell 1) til en sluttkonsentrasjon på 0,2%. De resterende fire femte volum skal brukes til vaskinger.
  • Vask cellepelleten i 01:10 cellepellet til NIB uten NP-40 Alternative-forhold (v / v). Fjern supernatanten ved sentrifugering ved 700 RCF i 5 min.
  • Lyse cell pellet ved å plassere den på is og tilsetning av 01:10 cellepelleten til NIB med 0,2% NP-40 Alternative (v / v).
  • Hvis trekke fra vevsprøver, homogen bruker morter eller Dounce homogenizers. Dyrkede celler kan homogeniseres ved forsiktig pipettering.
  • Inkuber cellene homogenisert på is i 5 - 10 min. Cellene vil lyse og slipp kjerner.
  • Sentrifuger ved 1000 RCF i 5 - 10 min ved 4 ° C. Pelleten inneholder hovedsakelig cellekjerner, mens supernatanten inneholder stort sett cytoplasmatiske komponenter. Lagre cytoplasmafraksjonen hvis ønskelig.
  • Vask kjerner pellet resuspenderes ved forsiktig det i 01:10 (v / v) NIB uten NP-40 Alternative.
    Merk: Dette vasketrinn er utelukkende for å fjerne spor av vaskemidler før utpakking histoner fra kjerner.
  • Sentrifuger ved 1000 RCF i 5 min ved 4 ° C og fjern supernatanten.
  • Gjenta trinn 2.10 - 2.11 minst to ganger for å fjerne NP-40 Alternative. Fjerning av NP-40 Alternative er tydelig ens forsiktig pipettering under vasketrinnet ikke lenger danner bobler.
  • For histone utvinning fra vev:
    1. Skyll fersk eller tint frossen vev i iskaldt NIB.
    2. Overfør vev til en petriskål plassert på is med NIB, akkurat nok til å holde vevet våt.
    3. Dice til minste biter (<1 mm) med barberblad for å øke overflatekontakt for kjerner isolasjon.
    4. Overfør hakket vev til en på forhånd avkjølt homogenisator og vaskes i NIB ved å pipettere opp og ned.
    5. Fjern-buffer ved sentrifugering ved 300 RCF i 5 min.
    6. Legg NIB innehold NP-40 Alternativ til cellene i løpet av celler: bufferforhold på 01:10 (v / v) og homogeniseres ved 5 - 10 slag.
    7. Se etter cellelyse og gjenta homogenisering etter behov. En god indikator på at cellene er blitt lysert er reduksjonen av pelleten volum. Den pellet bør inneholde kjerner.
    8. Sentrifuger ved 700 RCF for 5 min og spare pellet. Denne pellet kan utvinnes 1 - 2 gangs i 01:10 (v / v) av NIB innehold NP-40 Alternative; på dette stadiet, er histoner hentet ut av kromatin og pelleten har krympet betraktelig.
    9. Vask to ganger med 2 - 3 ml NIB uten NP40 alternativ for å fjerne spor av vaskemiddel.
      Merk: Interim stoppunkt: Prøve kan resuspendert i et minimalt volum NIB + 5% glycerol og lagret ved -80 ° C.
  • 3. Utvinning og rensing av Histoner fra Nuclei

    Merk: Histoner er svært rik på basiske aminosyre-rester, slik at de tett samvirke med fosforsyre ryggraden i DNA. Histoner er blant de mest grunnleggende proteiner i kjernen, noe som tillater dem å bli ekstrahert i iskald svovelsyre (0,2 MH 2 SO 4) med minimal kontaminering fra ikke-histonproteinene, som utfelles i sterk syre. Høykonsentrert TCA (til en sluttkonsentrasjon på 33%) kan deretter anvendes for å utfelle histoner fra svovelsyre. TCA lagres som 100% i brun flaske ved 4 ° C.

    1. Resuspender cellekjerner i 1: 5 (v / v) kjølt 0,2 MH 2 SO 4 (tabell 1) ved forsiktig pipettering.
    2. Inkuber prøven med konstant rotasjon eller forsiktig risting i 2 - 4 timer ved 4 ° C. Typisk for prøver med mer enn 500 ul celle-pellet, er tilstrekkelig til å ekstrahere histoner en 2 timers ekstraksjon; lengre inkubasjon kan føre til utvinning av andre grunnleggende proteiner. For mindre atom pellets (<200 mL), gir fire timers ekstraksjon en bedre avkastning.
    3. Sentrifuger ved 3400 RCF ved 4 ° C i 5 minutter.
    4. Overfør supernatanten til et nytt rør.
    5. Gjenta trinn 3.3 til 3.4 for å fjerne ethvert uløselig materiale.
    6. For å utfelle de histoner, tilsett avkjølt 100% TCA (tabell 1) for de innsamlede supernatanten (som nå inneholder histoner) i et forhold på 1: 3 (v / v), for å oppnå en endelig TCA konsentrasjon på 33%. Bland ved å snu røret noen få tIME.
      Merk: Prøvene blir grumsete ved tilsetning av TCA, noe som indikerer tilstedeværelse av histoner.
    7. Inkuber blandingen på is i minst 1 time. For mindre startpellets størrelser, blir over natten nedbør anbefales.
    8. Sentrifuger ved 3400 RCF i 5 min. Den histoner belegge sidene av rørene og også avsettes på bunnen. En hvit uløselig pellet danner også helt på bunnen av røret, som for det meste inneholder ikke-histonproteinene og andre biomolekyler. Fjern supernatanten ved aspirasjon, forsiktig uten å skrape sidene eller pellets.
    9. Ved å bruke et glass Pasteur pipette, skylles rør med iskald aceton + 0,1% HCl (tabell 1) slik at det dekker de utfelte proteiner belegg sidene og bunnen.
    10. Sentrifuger ved 3400 RCF i 2 min og aspirer supernatanten forsiktig uten å skrape sidene eller pellets.
    11. Gjenta trinn 03.09 til 03.10 med 100% iskald aceton.
    12. Tørr pellet med luftstrøm eller med en vacuum sentrifuger, eller bare ved å la røret åpent. Aceton fordamper raskt.
    13. Oppløse histoner med DDH 2 O (dobbelt-destillert vann) i minimalt volum mulig for å oppløse det hvite laget fullstendig. Histoner er lett oppløselige i vann. For pellets i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, 100 mL DDH 2 O er vanligvis nok til å samle histoner.
    14. Sentrifuger ved 3400 RCF i 2 min og Overfør supernatanten til et nytt rør.

    4. Beregning av proteinkonsentrasjon og renhet

    1. For å måle protein konsentrasjon bruker BCA, Bradford proteinanalyse eller aminosyre-analyse (AAA). Ikke bruk teknikker som vedtar absorbans ved 280 nm, som histoner er fattige i aromatiske aminosyre-rester.
    2. Bekrefte renheten av utvunnet histoner ved hjelp av SDS-PAGE-analyse med en 15% akrylamidgel og Coomassie-farging (valgfritt).
    3. Hvis høy renhet enkelt histone varianter er ønsket, fortsett å HPLC-UV fraksjonering avhistone varianter (kapittel 5). Hvis ikke kan du gå direkte til prøveopparbeidelse for bottom-up histon PTM analyse (§ 6).

    5. Separasjon av Histone Varianter ved reversfase HPLC (valgfritt)

    Merk: Høy renhet histon varianter kan oppnås ved fraksjonering av rå histon-blandingen ved anvendelse av reversert-fase HPLC koblet til en UV-detektor. Disse rensede histoner er nyttige for undersøkelser som krever høyere følsomhet og renhet. Men for standard histon PTM karakterisering, dette trinnet kan utelates da analysen er tilstrekkelig følsom og uttømmende. Fraksjonering av intakte histon-varianter krever ideelt sett minst 100-300 ug av utgangsmateriale.

    1. Koble en passende C18 5 um-kolonne til en HPLC avhengig av utgangs histon-konsentrasjon: med omtrent 100 ug av histoner, bruke 2,1 mm x 250 mm kolonne med en strømningshastighet på 0,2 ml / min; med rundt 300 mikrogram histoner, bruke 4,6 x 250 mm kolonne meden strømningshastighet på 0,8 ml / min. Forbered Buffer A og B ved hjelp av dedikerte glass som følger:
      1. Forbered Buffer A: 5% HPLC kvalitet acetonitril, 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vann.
      2. Forbered Buffer B: 95% HPLC kvalitet acetonitril, 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vann.
    2. Koble kolonnen til en UV-detektor, og satt absorbansen til 210-220 nm.
    3. Surgjøre histon prøve oppløst i vann med 100% TFA for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,1-1% TFA.
    4. Ekvilibrere kolonnen med 100% buffer A i minst 15 minutter ved den anbefalte strømningshastighet, noe som omtrent tilsvarer tre kolonnevolumer. Bruk av dette signal for innstilling av null-absorbansen nivå av UV-detektoren.
    5. Forbered hensiktsmessig størrelse for rør for å samle fraksjoner, enten manuelt eller på en automatisk prøvesamler.
    6. Injiser prøve ved en konsentrasjon på omtrent 1 pg / mL eller høyere. Prøvene som var oppløst i større volumer kan endre ekvilibrering av kolonnen during lasting og føre til lavere oppbevaring.
    7. Kjør gradient, programmert som følger: fra 0 til 30% B i 1 min, 30 til 60% B i 90 min, og 60 til 90% B i 1 min.
    8. Samle fraksjoner (f.eks kromatogrammet vist i Figur 2) i 1 minutts intervaller ved hjelp av en automatisk fraksjonsoppsamler. Samle-fraksjoner i passende format rør for å inneholde hele volumet.
    9. Tørker ned fraksjonerte prøver i et vakuum konsentrator.
      Merk: Midlertidig stoppunktet: Tørket histone fraksjoner kan lagres i romtemperatur i korte perioder (1 - 2 dager) eller i -80 ° C fryser for langsiktige perioder.

    6. Kjemisk Derivatisering histoner Bruke propionsyreanhydrid Bottom-up Analysis

    1. Løs opp histone prøver i 40 ul 50 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0 (anbefalt mengde: 50 - 100 ug). Hvis prøvene var i ren DDH 2 O, tilsett konsentrert NH 4 HCO 3 for å gjøre opp 50 mM, pH 8.0.
    2. Fukt en P10 pipettespissen i prøven for å sjekke pH-verdien ved hjelp av pH-indikator strimler uten eksempel tap. NH4OH og maursyre kan anvendes for å justere pH til 8,0.
      Merk: Den følgende del av protokollen (trinn 6.3 til 6.7) bør gjøres i grupper med maksimalt tre til fire prøver, for å holde propionsyreanhydrid reaktive.
    3. Bruk avtrekksskap for de etterfølgende trinnene der propionsyreanhydrid brukes. Fremstille frisk propionylering reagens ved å blande propionsyreanhydrid med acetonitril i forholdet 1: 3 (v / v). Legg propionylering reagens for å prøve på 1: 4 (v / v). For 40 ul histoner, tilsett 10 mL propionylering reagens.
      Merk: Det er mulig å observere hvit rusk på dette trinnet. Imidlertid, for det meste inneholder denne salter og propionsyre, og således ingen spesifikk tiltak må iverksettes.
    4. Raskt legge NH4OH for å re-etablere pH 8,0 til oppløsningen. Merk: Propionsyreanhydrid å reagere med de frie aminer av peptidene frembringer propionisk syre som reduserer pH. Vanligvis er tilsetning av NH4OH til prøven med et forhold på 1: 5 (v / v) er hensiktsmessig for å re-etablere pH 8,0, for eksempel, 8 ul av NH4OH til 40 ul prøve.
    5. Bland umiddelbart ved virvling.
    6. Sjekk pH med den samme prosedyre som trinn 6.2.
      Forsiktig: Når pH er høyere enn 10,0, er mulig merking av andre aminosyrerester med høyere pKa.
    7. Inkuber prøvene ved romtemperatur i 15 min.
    8. Gjenta trinn 06.03 til 06.07, strengt utføre reaksjonen for ikke mer enn 3 eller 4 prøver pr batch av propionylering reagens.
    9. Tørre prøver ned til 10 - 20 ul i en vakuum-konsentrator. Denne fordamper uomsatt propionsyreanhydrid, acetonitril, eddiksyre og ammoniakkgass frigjøres fra NH4OH. Hvis prøvene tørke helt ut, ingen vesentlige eksempel tap oppstår.
      Merk: Isopropanol kan brukes i stedet for acetonitril. Imidlertid har acetonitril, lavere overflatespenning og dermed merrask fordampning.
    10. Resuspender eller fortynne prøvene med DDH 2 O til 40 ul endelig volum er oppnådd.
    11. Gjenta trinn 06.02 til 06.09. En dobbel runde av histon propionylering at> 95% av ferdig reaksjon.
    12. Fyll propionsyreanhydrid flaske med argongass for derved å hindre dannelse av eddiksyre i kontakt med fuktighet i flasken.
      Merk: Midlertidig stoppunktet: Prøve kan oppbevares ved -80 ° C rekonstituert i DDH 2 O eller tørket.

    7. proteolvtiske Fordøyelse med Trypsin

    1. Resuspender histoner i 50 mM NH 4 HCO 3 for å oppnå en optimal konsentrasjon på 1 ug / mL eller høyere. Mer fortynnede prøver føre til lavere trypsin effektivitet.
      Merk: histoner på dette trinnet må være ved pH 8,0 Hvis det fortsatt surt, og deretter legge NH 4 HCO 3 salt for å smake ved hjelp av pipette tips.
    2. Legg trypsin til histon prøver ved et 01:10 forhold (vekt / vekt).
    3. Incubate ved 37 ° C i 6 - 8 timer.
    4. Stopp fordøyelsen ved å fryse i -80 ° C.
    5. Tørk ned prøven til 10 - 20 pl i en vakuum-konsentrator.
      Merk: Midlertidig stoppunktet: Prøve kan oppbevares ved -80 ° C.

    8. propionylering av Histone Peptider på N-termini

    Merk: Denne delen beskriver derivatisering av peptid N-termini generert fra trypsin fordøye. En slik fremgangsmåte forbedrer HPLC-retensjonstid av de korteste peptider (f.eks aminosyre 3 - 8 av histon H3), som propionylgruppe øker peptid hydrofobisitet.

    1. Resuspender prøvene i 30 ul 100 mM NH 4 HCO 3.
    2. Gjenta trinn 06.01 til 06.09.
      Merk: Det er normalt at tørking av prøver i vakuum tar lengre tid på dette trinnet.
    3. Resuspender eller fortynne prøvene med 50-100 ul DDH 2 O + enten 0,1% TFA eller 0,5% eddiksyre. Merk: Eddiksyre anbefales for lange lagringen, som TFA facilitates metionin oksidasjon på lang sikt. På den annen side er TFA anbefales hvis scene-tipping (seksjon 9) er utført på samme dag, som TFA bistår en bedre kromatografisk retensjon.
      Merk: Midlertidig stoppunktet: Prøve kan oppbevares ved -80 ° C.

    9. Eksempel Desalting med Stage-tips

    Merk: På dette stadiet, er det salt til stede i prøven. Salter hindre HPLC-MS-analyse fordi de ioniserer under elektrospray, undertrykker signalet fra peptider. Salter kan også dannes ioniske addukter på peptider, noe som reduserer signalintensitet for det ikke-adduktdannet peptid. Som det tilleiret peptidet vil ha en annen masse, peptidet ikke vil bli riktig identifisert og kvantifisert.

    1. Ved å bruke en P1000 pipettespiss, punch en skive av C-18 materiale fra en fastfase-ekstraksjon disk. Skyv minidisk ut av P1000 spissen ved hjelp av en sammensmeltet silika kapillær og deponere minidisk til bunnen av en pipettespiss P100 / 200. Pass på at dISK er sikkert klemt fast i bunnen av spissen (figur 3).
      Merk: P1000 spissen har et ganske lite hull for å sparke C 18 disk. Det er hensiktsmessig å kutte den siste centimeter av tuppen for å ha et hull med større diameter.
    2. Bruk to C 18 slag i samme P100 / P200 tips hvis avsalting over 25 mikrogram av prøven.
    3. Bruk en sentrifuge adapter for å holde scene-tips på plass i 1,5 ml eller 2 ml mikrosentrifugerør. Bruk sakte (300-400 RCF) rotasjon; de løsningsmidlene som normalt passerer gjennom harpiksen i løpet av mindre enn et minutt.
    4. Skyll harpiks ved å spinne med 50 mL av 100% acetonitril for å aktivere C 18 materialet og fjerne potensielle forurensninger.
    5. Stabilisere disken ved å skylle 80 ul 0,1% TFA ved langsom sentrifugering.
    6. Surgjøre prøven til pH 4,0 eller lavere med eddiksyre. Sjekk pH med pH-strips for å minimere prøven tap. Load prøven på disken ved langsom sentrifugering.
    7. vaskPrøven ved spyling 70 - 80 ul 0,1% TFA ved langsom sentrifugering.
    8. Eluere prøven ved å spyle 70 pl 75% acetonitril og 0,5% eddiksyre ved langsom sentrifugering. Samle prøven i et 1,5 ml rør.
    9. Tørr prøve i en vakuum-konsentrator.
      Merk: Midlertidig stoppunktet: Prøve kan oppbevares ved -80 ° C.

    10. Analyse av histon Peptider

    Merk: NLC-MS Plattformen skal settes opp som gjøres i tradisjonell peptid analyse. Bruken av 200-300 nl Flow-kolonne (75 um ID analytisk kolonne, C 18 partikler) anbefales, da de er en utmerket kompromiss mellom følsomhet og stabilitet. Den MS oppkjøpsmetoden kan enten være en kombinasjon av dataavhengig oppkjøp (DDA) med målrettede skanner 19 eller en data-uavhengig oppkjøp (DIA) 20,21, begge beskrevet i Representative Resultater og Figur 4.

    1. Forbered HPLC buffere - A: 0,1% maursyre iHPLC-grade vann; B: 0,1% maursyre i HPLC-kvalitet acetonitril.
    2. Programmere den HPLC-metode som følger: fra 0 til 30% buffer B i 30 minutter fra 30 til 100% B for de neste 5 minutter og ved isokratisk 100% B i 8 min. Dersom HPLC ikke er programmert for automatisk kolonne stabilisering før prøven lasting, da omfatte følgende: gradient 100-0% B i 1 min og isokratisk strøm ved 0% B i 10 min. Angi strømningshastigheten for analysen til 250-300 nl / min.
    3. Programmere MS oppkjøpsmetoden for å utføre enten DDA kombinert med målrettede skanner 19 eller DIA 20,21 (figur 4). Pass på at MS driftssyklus gjør en hel MS skanne hver ~ 2 sek, for å ha nok datapunkter til over kromatografisk topp, noe som gjør det mer nøyaktige kvantifisering. Bemerk: Med C 18 kromatografi, er den gjennomsnittlige baseline maksimum bredde omtrent 30 sekunder for graderingen er beskrevet ovenfor.
    4. Last omtrent 1 pg av prøven på HPLC-column.
    5. Kjør HPLC-MS / MS metode som programmert.
      Merk: I protokollen anbefaler vi ikke detaljene i kolonner, MS instrumenter eller MS parameter detaljer, som noen optimal oppsett som et individ proteomikk lab utviklet vil være egnet for metoden. Proteomikk laboratorier bør bruke sin optimalisert oppsett, siden histone peptider skille som tradisjonelle peptider.

    11. Data Analysis

    1. Importer MS råfiler inn programvare for å utføre toppareal integrering. Merk: EpiProfile 22 anbefales, da det er optimalisert for histon peptider; ved hjelp av retensjonstiden kjennskap til kromatografisk eluering utfører det pålitelig toppareal ekstraksjon av kjente histon peptider. Alternativt Skyline 23 er en annen ideell programvare for formålet.
      1. Beregn den relative overflod av et gitt peptid ved å dele arealet av det totale areal av det peptid i alle dens modifiserte former. Merk: Ved funn analysis Mascot anbefales å identifisere spektra av modifiserte histone peptider. Utførelsen av dette verktøyet har blitt beskrevet nylig 24. Alle andre database søkemotorer for proteomikk er også brukbare, men ved våre tester de ga lavere ytelse.

    Representative Results

    Som et eksempel, analyserte vi histoner ekstrahert fra humane embryonale stamceller (hESCs) med og uten retinsyre (RA) stimulering, og starter med 200 ul celle-pellets. Tilstedeværelse av RA i cellekultur fører til ESC differensiering. Fra cellepelleten, omtrent 50-100 ug av histoner ble trukket ut, noe som er mer enn tilstrekkelig til å utføre flere LC-MS-injeksjoner av histon peptider. Etter derivatisering, fordøyelse, og avsalting, ble prøvene applisert på en 75 um x 15 cm C-18-kolonne (partikkeldiameter 3 um, porestørrelse 300 Å) i seriemodus med en høy-ytelse væske nano-kromatografi system med microfluidic brikker koblet til en hybrid lineær felle kvadrupol - orbitrap massespektrometer. MS Kjøpet ble utført ved hjelp av DIA. Parallelt ble prøvene også analysert med en DDA-metoden ved anvendelse av en nano-strømnings UHPLC koplet til en hybrid-ion trap-orbitrap massespektrometer (data ikke vist). Ihver syklus, en hel MS orbitrap påvisning ble utført med sveipeområde på 290 til 1400 m / z, en oppløsning på 60 000 (ved 200 m / z) og AGC av 10 6. Deretter dataavhengig oppfangningsmodus ble påført med en dynamisk utelukkelse av 30 sek. MS / MS-skanninger ble fulgt på mors ioner fra de mest intense seg. Ioner med en ladetilstand en ble ekskludert fra MS / MS. En isolasjonsvindu på 2 m / z ble anvendt. Ioner ble fragmentert ved hjelp av kollisjon indusert dissosiasjon (CID) med kollisjonsenergi på 35%. Ionefelle deteksjon ble brukt med normal skanning rekkevidde modus og normal scan rate med AGC på 10 4.

    Rå MS-data ble analysert i bruk programvare for utvinning av forløperen og fragment ionekromatogrammer, nemlig Skyline 23 og EpiProfile 22. EpiProfile har blitt optimalisert for histone peptider, som det integrerer intelligent toppareal utvinning på grunn av tidligere kjennskap til peptidevann retensjonstid. På den annen side er optimalisert for Skyline DIA analyser, og dermed DIA figurene vist (figurene 4 og 5A) er skjermbilder fra denne programvaren. Fra det ekstraherte ion kromatogrammet, er området under kurven hentet frem, og denne blir brukt til å estimere den mengde av hvert peptid. Arealet av den kromatografiske topp ble beregnet for [M + H] +, [M + 2H] 2+, og [M + 3H] 3 + ioner av det samme peptid, selv om i de fleste tilfeller [M + 2H] 2+ var den utbredte formen. Dette gir den rå overflod av en gitt modifisert form av et peptid. For å oppnå den relative overflod av PTMs, var summen av alle forskjellige modifiserte former av en histon peptid betraktet som 100%, og området for det spesielle peptidet ble dividert med det totale arealet for den histon peptidet i alle dens modifiserte former .

    Histon peptider er til stede i en variety av isobariske former (figur 5). Isobariske peptider, f.eks K18ac og K23ac, bare kan kvantifiseres ved MS / MS-nivå, hvor deres unike fragmentioner anvendes for å bestemme forholdet mellom de isobariske arter (figur 5A og 5B). Dette forhold brukes for å dele opp området av kromatografiske topp mellom de to artene. Ved bruk av DDA, ble disse isobariske formene på en liste over målrettede masser, fordi disse peptider må velges for fragmentering gjennom hele eluering, som ikke ville forekomme i en standard DDA eksperiment. Diskrimineringen av den relative overflod av den isobariske arten utføres deretter ved å overvåke elueringsprofilen av de fragmentioner. På den annen side, DIA type ervervet ikke krever noen inkludering liste. Imidlertid er denne type oppkjøpsmetoden ikke er kompatible med tradisjonelle database søking, og dermed kan hindre oppdagelsen av ukjente modifiserte peptider.

    hESCs viste en klar reduksjon av acetylerte peptider ved stimulering for differensiering (Figur 6A og 6B). Dette var ikke overraskende, som tidligere resultater rapportert høyere acetylering i ESCs i forhold til differensiere seg 25,reflekterer generelt givende natur pluripotent kromatin. Ved å fokusere på histon H3, ble 35 forskjellige modifiserte former kvantifisert (figur 6C). Men alle histone proteoforms som kan undersøkes med denne tilnærmingen er mer enn 200, inkludert alle histone varianter og lav overflod modifikasjoner (data ikke vist). Videre vår analyse viste at høy reproduserbarhet kan oppnås mellom tekniske replikater, som gjenspeiles av den lille størrelsen av feilstolpene (som representerer ± standardavvik). Til sammen denne delen beskriver hvordan du kan hente den relative overflod av histone modifiserte peptider ved hjelp NLC-MS-data.

    Figur 1
    Figur 1:. Arbeidsflyt for Bottom-up MS / MS Histone Analyse De ti trinnene for histone analysen er vist, blant annet en estimering av den tiden som kreves for hvert trinn. Seksjonen nummeret er gitt i parentes som er til stede i manuskriptet. § 5, som beskriver prøvefraksjonering for å isolere de ulike histone varianter, kan utelates dersom det er behov for svært følsom analyse av en gitt variant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2: Reversed-Phase High Flow LC for Histone Variant Etter fraksjonering og Coomassie-Gel (A) LC-UV-kromatogram som representerer intakt histon separasjon.. Histon H3-varianter kan skjelnes fra hverandre i henhold til deres elueringstid. Fraksjoner kan samles enten manuelt eller ved hjelp av en automatisk fraksjonsoppsamler. (B) Coomassie-gel av tre replikater av histon rensing.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3:. Making of Stage-tipser Plug Med en P1000 pipette, punch en disk laget av C 18 materiale fra en fast fase ekstraksjon disk (andre panel). Den minidisk vil holde seg i spissen (midtre panel), slik at den kan skyves ut til en mindre P100 / 200 pipettespissen ved hjelp av en hvilken som helst form av små kapillærer. I dette eksempel ble det benyttet en 700 um ytterdiameter rØr av smeltet silisiumdioksyd. Den minidisk skal skyves til bunnen av P100 / 200 pipette inntil det ikke kan gå videre (siste panel). Scenen spissen er klar for histone avsalting, som den har tilstrekkelig kapasitet til å beholde nok prøvemateriale for mange paralleller. Nærmere bestemt er tilstrekkelig for 15 en minidisk - 20 ug sample. Hvis mer prøven er nødvendig, kan flere disker pakkes på hverandre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4:. Skjematisk fremstilling av DDA og DIA Metoder Ved bruk av DDA, er MS skannesyklus preget av sekvensiell utvalg av forløperionene for MS / MS fragmentering i henhold til deres intensitet og ladetilstand. Når en forløper ion er blitt fragmentert det er plassert i en ekskluderingsliste for å unngå gjentatt valg av det samme peptid, slik at MS kan "grave" i mindre tallrike signaler. Dette oppkjøpsmetoden er teknikken av valget i proteomikk for oppdagelsesmodus. Kvantifisering blir oppnådd ved å integrere den fullstendig skanning signal fra et gitt ion ved siden av de identifiserte MS /MS-spektrum. I DIA, er hele m / z område fragmenteres ved hver avsøkningssyklus. Denne tilnærmingen er mindre egnet for oppdagelse-modus, men det frembringer en kromatografisk profil av alle ioner, forløpere og produkter. Dette fører til mer selvsikker kvantifisering og diskriminering av isobariske former. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur 5: Kvantifisering av isobariske Peptider (A) Eksempel på to isobariske peptider ofte rikelig i histon analyse.. Den ekstraherte ion kromatogrammet (XIC) av sin forløper masse og relative isotoper (over) er identiske. Imidlertid XIC av produktioner (nedenfor) gjør det mulig for diskriminering av de to isobariske former. Spesielt bør bare unike fragmentioner være ossed å beregne den relative mengde av de to arter. (B) representasjon av det unike fragmentioner for de to beskrevne peptidene (uthevet i rødt). (C) Liste over de som vanligvis analysert peptidene i Homo sapiens som har minst en isobar ekvivalent. Sekvensvarianter mellom de nevnte histone peptider er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6: Representative Resultater av humane embryonale stamceller med og uten retinsyre behandling (A) Relativ kvantifisering av histon H3 peptid KQLATKAAR (aa 18 - 26) i alle sine modifiserte proteoforms.. Den relative overflod ble beregnet ved hjelp av alle proteoforms som 100% (relAtive prosentandel av den ikke-modifiserte peptidet ikke vist), (B) Relativ kvantifisering av histon H3 peptidet KSTGGKAPR (aa 9 -.. 17) (C) Relativ mengde av detekterte peptider for kanonisk histon H3 med og uten celle behandling med retinsyre. Figuren viser i hvilken av de to behandlingene de angitte modifikasjoner er mer rikelig (> 50%). Samlet sett viser vi at histon H3 acetylering synker i de fleste av lysinresidier ved induksjon av celledifferensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Løsning # sammensetning
    1 Nuclear isolasjonsbuffer (NIB) materiale blir laget som følger, og lagret frosset i 100 ml alikvoter ved -20 ° C; tintNIB kan lagres ved 4 ° C i noen uker: 15 mM Tris, 60 mM KCI, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 og 250 mM sukrose. PH på bufferen justeres til 7,5 med HCl.
    2 Proteasehemmere (legg frisk til buffere før bruk): 1 M ditiotreitol (DTT) i DDH 2 O (1,000x); 200 mM AEBSF i DDH 2 O (400x)
    3 fosfatase inhibitor (legg frisk til buffere før bruk): 2,5 mikrometer Mikrocystin i 100% etanol (500x)
    4 HDAC hemmer (legg frisk til buffere før bruk): 5 M Sodium butyrate, laget ved titrering av fem M smørsyre med NaOH til pH 7,0 (500x)
    5 NP-40 Alternativ: 10% v / v i DDH 2 O
    6 0,2 MH 2 SO 4 i DDH 2 O
    7 Trikloreddiksyre (TCA): 100% vekt / volum i DDH 2 O
    8 Aceton + 0,1% Saltsyre (HCl): 0,1% volum / volum HCl i aceton

    Tabell 1. Solutions.

    Discussion

    Protokollen er beskrevet her er optimalisert med tanke på kostnader, tid og ytelse. Andre preparater er mulig, men de har begrensninger, særlig i tilfellet med kobling med MS-analyse. For eksempel kan det med høy saltutvinning protokoll anvendes for å rense histoner 26 i stedet for TCA-utfelling (avsnitt 3). Høy-salt-protokollen er egen mildere, da den ikke bruker sterk syre. Dette bevarer syre-labile PTMs og øker utbyttet av utvunnet histoner, som TCA nedbør co-utfellinger mange andre kromatin bindende proteiner. Imidlertid medfører høy saltutvinning til prøver inneholdende for konsentrert salt for HPLC-MS / MS. I en alternativ fremstilling kan histon fordøyelse utføres uten propionylering (seksjon 6 - 8), for eksempel ved å redusere trypsin inkubasjonstid og enzym / substrat-forhold 27 eller ved hjelp av argc som kutteenzym 28-30. Imidlertid er derivatisering med propionsyreanhydrid anbefalt, som jegt fører til genereringen av flere hydrofobe peptider, som er bedre beholdt i løpet av væskekromatografi.

    For kjemisk derivatisering, har en rekke organiske syre anhydrider blitt evaluert og sine meritter grundig diskutert 18. Ikke desto mindre, propionsyreanhydrid viste seg å være den beste kompromiss mellom effektivitet, minimeres sideprodukter og forbedret peptid hydrofobisitet. Potensielt kan propionsyreanhydrid kjøpes i isotopically merket form; Dette gjør det mulig for multipleksing analyse på grunn av muligheten for å blande flere prøver og diskriminere dem på nivå MS basert på de ulike masser formidles fra den tunge etiketten. Imidlertid fører denne analysen til en økt kompleksitet av LC-MS-kromatogram og reduserer mengden av prøve som kan injiseres for hver enkelt tilstand.

    I denne forbindelse bør noen kritiske aspekter av protokollen bli markert. Følgende bør brukes som checklist for å finne feil i å utføre fremgangsmåten i tilfelle negative resultater oppnås. Først etter kjerner utfelling pellet bør være nøye vasket med NIB uten NP-40 Alternative (avsnitt 2.10) inntil fullstendig fjerning av detergent (merkbar ved mangel av bobler under blandingen). Unnlate å gjøre det ville kompromittere histone ekstraksjon med syrer. For det andre, etter histon nedbør med TCA (§ 3.9) vasker av pelleten med aceton er avgjørende. Tilstedeværelse av konsentrert syre ville skade følgende trinnet hvis propionylering og fordøyelse (§ 6.1) er direkte utført. Det ville ikke være problematisk i tilfelle histon fraksjoner (kapittel 5) utføres. For det tredje er det viktig at propionylering reaksjonen utføres raskt (avsnitt 6.3 til 6.7). For å gjøre dette, unngå å bruke den samme propionylering mix (propionsyreanhydrid + acetonitril) for mer enn 3 - 4 påfølgende prøver. I tillegg er pH det viktigste aspektet av trypsin fordøyelse (kapittel 7). Hvis ikkerundt 8,0 (7,5 til 8,5) fordøyelse vil være ineffektiv. Dette kan skje, som i prøven vil være rik på propion- syre ved dette trinnet. NH4OH kan tilsettes inntil det er nødvendig. Også for forskere som er kjent med proteomikk arbeidsflyt vil det føles normalt å forsurer prøven for å avslutte trypsin fordøyelsen. Dette bør ikke gjøres, da det vil sette følgende reaksjon, dvs. propionylering av peptid N-termini (punkt 8.1). Til slutt, i det samme problemet, er det viktig å huske for dataanalyse som umodifiserte peptider er faktisk ikke-modifisert; alt gratis lysinresidier og N-termini vil bli okkupert av propionylering (56,026 Da). Således utfører ekstraksjon ionekromatografi av massen som svarer entydig til peptidsekvensen ville føre til ingen resultater.

    Begrensningene for fremgangsmåten er stort sett knyttet til den manglende evne til å påvise kombinatoriske PTMs, på grunn av den korte peptidsekvenser, og de skjevheter i å oppnå den sanne abundans av en modifikasjon, på grunn av det faktum at peptider i forskjellige modifiserte former kan ionisere med forskjellig effektivitet. Den første utgaven kan løses ved å kombinere denne teknikken med en midt-ned eller top-down tilnærming (anmeldt i 16). Denne type analyse, selv om teknisk mer krevende, er ideelt for å studere sameksistens frekvenser modifikasjoner. Dessuten blir bedre diskriminering av histone varianter, som ikke alltid kan oppnås med bottom-up siden noen peptider har samme sekvens i ulike histone varianter. Det andre problemet, relatert til ionisering effektivitet, kan løses ved hjelp av et bibliotek av syntetiske peptider 31. Denne tilnærmingen sikrer en mer nøyaktig vurdering av den relative overflod av histone PTMs. Men i de fleste eksperimenter, er det ønskede resultatet relative endringer av gitte modifikasjoner mellom analyserte forhold. I dette tilfelle, er en slik korreksjon ikke er nødvendig, på grunn av det faktum at alle prøvene har de samme bias.

    Som konklusjon, gir denne protokollen for analyse av histone PTMs som kan være ferdig i 3 dager ved hjelp av NLC koblet til tandem MS. Sammenligninger med andre enn MS-teknikker, dvs. ved hjelp av antistoffbaserte strategier som er omtalt i innledningen, er ikke egnet, da de ikke kan oppnå enda nesten dette nivået av gjennomstrømning. I tillegg trenger antistoffbaserte teknikker ikke tillate for oppdagelsen av nye modifikasjoner, men de er utelukkende basert på bekrefter og kvantifisering av predikerte merker. Vi spekulerer derfor at bottom-up proteomikk på histone peptider vil vinne popularitet i proteomikk laboratorier på grunn av intuitive fordeler i å vite reguleringen av histone merker, som er hovedpersonene i tuning genekspresjon og dermed påvirke reguleringen av proteomet. Videre protokollen beskrevet omfatter siste forbedringer i prøveopparbeidelse og programvare for dataanalyse, som gjør histone analyse mer trivielle også for laboraToryene som aldri opplevd karakterisering av denne typen hypermodified peptider.

    Disclosures

    Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av midler fra NIH tilskudd (DP2OD007447, R01GM110174 og R01AI118891).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Trypsin 0.25% EDTA Invitrogen 25200056 For harvesting cells
    PBS Invitrogen 14200075
    Tris Roche 77-86-1
    Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
    Sodium Chloride Sigma S9888
    Magnesium Chloride hexahydrate Sigma M9272
    Calcium Chloride, anhydrous Sigma C1016
    Sucrose Fisher Scientific BP220-1
    DTT Invitrogen 15508-013
    AEBSF EMD Millipore Corp 101500
    Microcystin Sigma M4194
    Sodium Butyrate Sigma B5887
    Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)  Fisher Scientific 78445
    NP- 40 Alternative CALBIOCHEM 492016
    Sulfuric Acid, ACS grade Fisher Chemical 7664-93-9
    Trichloroacetic acid Sigma T6399
    Acetone Sigma 179124
    HCl Fisher Chemical A144-500
    Bradford reagent Biorad 500-0006
    30% acrylamide/bis 29:1 — 500 ml Biorad 1610156
    Coomassie Fisher Scientific 20278
    C18 Column (5 µm) 2.1 mm x 250 mm Grace 218TP52
    C18 Column (5 µm) 4.6 mm x 250 mm Grace 218TP54
    HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
    HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
    TFA Fisher Scientific A11650
    Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
    ammonium hydroxide Sigma 338818
    propionic anhydride Sigma 240311
    Sequencing grade modified trypsin Promega PRV5113 For digesting histones for MS
    Acetic Acid Sigma 49199
    C18 extraction disk Empore 2215
    Formic Acid Sigma F0507

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Waddington, C. H. Canalization of development and the inheritance of acquired characters. Nature. 150, 563-565 (1942).
    2. Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis. 31, (1), 27-36 (2010).
    3. Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, (5532), 1089-1093 (2001).
    4. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, (4), 693-705 (2007).
    5. Tessarz, P., Kouzarides, T. Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics. Nat Rev Mol Cell Bio. 15, (11), 703-708 (2014).
    6. Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. Histone and chromatin cross-talk. Curr Opin Cell Biol. 15, (2), 172-183 (2003).
    7. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142, (5), 682-685 (2010).
    8. Simboeck, E., et al. A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors. J Biol Chem. 285, (52), 41062-41073 (2010).
    9. Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature. 438, (7071), 1176-1180 (2005).
    10. Xhemalce, B., Kouzarides, T. A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly. Genes Dev. 24, (7), 647-652 (2010).
    11. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, (6), 967-980 (2010).
    12. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19, (5), 207-217 (2009).
    13. Fernandez-Capetillo, O., et al. H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis. Dev Cell. 4, (4), 497-508 (2003).
    14. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. Embo J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
    15. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
    16. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, (12), 3419-3433 (2012).
    17. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones. J Proteome Res. 8, (11), 5367-5374 (2009).
    18. Sidoli, S., et al. Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis. Proteomics. 15, (9), 1459-1469 (2015).
    19. Lin, S., Garcia, B. A. Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry. Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).
    20. Sidoli, S., et al. SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications. Mol Cell Proteomics. (2015).
    21. Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. J Proteome Res. (2015).
    22. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra. Mol Cell Proteomics. 14, (6), 1696-1707 (2015).
    23. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, (7), 966-968 (2010).
    24. Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications. J Proteome Res. 13, (10), 4470-4478 (2014).
    25. Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (28), 11493-11498 (2013).
    26. Vonholt, C., et al. Isolation and Characterization of Histones. Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).
    27. Zhang, K. L., et al. Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 306, (2), 259-269 (2002).
    28. Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells. Plos One. 6, (1), e15960 (2011).
    29. Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications. Proteomics. 4, (5), 1382-1396 (2004).
    30. Zhao, X. L., et al. Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury. J Proteome Res. 13, (4), 2175-2186 (2014).
    31. Lin, S., et al. Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13, (9), 2450-2466 (2014).
    Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).More

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter