Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piattaforma di coltura di epatociti tridimensionale emergente, l'impalcatura di cristalli colloidali invertiti e le tecniche concomitanti per valutare il comportamento degli epatociti. I pori controllabili in base alle dimensioni, l'interconnettività e la capacità di coniugare le proteine della matrice extracellulare all'impalcatura di poli(glicole etilenico) (PEG) migliorano le prestazioni delle cellule Huh-7.5.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di mantenere la funzione degli epatociti in vitro, allo scopo di testare citotossicità xenobiotici ', studiando virus e sviluppare farmaci mirati al fegato, richiede una piattaforma in cui le cellule ricevono adeguati segnali biochimici e meccanici. sistemi recenti ingegneria dei tessuti del fegato hanno impiegato tridimensionali (3D) impalcature composte da idrogeli sintetici o naturali, data la loro ritenzione idrica e la loro capacità di fornire gli stimoli meccanici necessari da parte delle cellule. C'è stato un crescente interesse nella scaffold invertito cristallo colloidale (ICC), uno sviluppo recente, che consente un'elevata organizzazione spaziale, omotipica e interazioni cellula heterotypic, così come matrice di interazione cellula-extracellulare (ECM). Qui, descriviamo un protocollo per fabbricare patibolo ICC utilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) e il metodo di lisciviazione delle particelle. Brevemente, un reticolo è costituito da particelle di microsfere, dopo di che un pre-polymesi aggiunge soluzione r, correttamente polimerizzato, e le particelle vengono poi rimosso o dilavati, utilizzando un solvente organico (ad esempio, tetraidrofurano). La dissoluzione dei risultati reticolari in un ponteggio altamente porosa con dimensione dei pori controllati e interconnectivities che permettono media per raggiungere le cellule più facilmente. Questa struttura unica permette elevata area superficiale per le cellule di aderire come pure facile comunicazione tra i pori, e la capacità di rivestire il ICC scaffold PEGDA con proteine mostra anche un effetto marcato sulla prestazioni della cella. Analizziamo la morfologia del patibolo, così come la cella di epatocarcinoma comportamento (Huh-7.5) in termini di fattibilità e la funzione di esplorare l'effetto della struttura ICC e rivestimenti ECM. Nel complesso, questo documento fornisce un protocollo dettagliato di una impalcatura emergente che ha ampie applicazioni in ingegneria dei tessuti, in particolare l'ingegneria dei tessuti del fegato.
Introduzione
Il fegato è un organo altamente vascolarizzato con una moltitudine di funzioni, tra cui la disintossicazione del sangue, metabolismo di xenobiotici, e la produzione di proteine del siero. tessuto epatico ha un complesso microstruttura tridimensionale (3D), composto da più tipi di cellule, canalicoli biliari, sinusoidi, e zone di diversa composizione biomatrice e concentrazioni di ossigeno differenti. Data questa struttura elaborata, è stato difficile creare un modello di fegato corretta in vitro 1. Tuttavia, vi è una crescente domanda di funzionale in modelli in vitro di hosting epatociti umani come piattaforme per la tossicità....
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Protocollo
1. ICC Scaffold Fabrication (Figura 1)
- Preparare il polistirolo (PS) reticoli (diametro = 6 mm; 8-13 strati di perline).
- Per preparare lo stampo, tagliare le punte fuori da 0,2 ml microprovette prova di bollire a livello di 40 ml. Far aderire la parte superiore del taglio tubi a 24 x 60 mm 2 microscopio scivola in vetro di copertura con colla impermeabile.
- Mettere le sfere PS (diametro = 140 micron) contenuti all'interno di una sospensione acquosa in un flaconcino da 20 ml, con attenzione pipetta la sospensione acquosa, e aggiungere 18 ml di soluzione al 70% di etanolo nel flaconcino. Mettere la soluzione sfera in un bagno....
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Risultati
I risultati rappresentativi per la caratterizzazione strutturale del ponteggio CPI e il confronto di efficacia ogni ICC di condizione di ponteggio in coltura epatociti sono illustrati e spiegati di seguito. Le condizioni ICC scaffold utilizzati in questi risultati sono rivestimenti collagene 0 pg / ml (Bare), 20 mg / ml (collagene 20), 200 mg / ml (collagene 200), e 400 mg / ml (collagene 400) e l'iniziale huh-7.5 numero di semina cellulare è 1x10 6.
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Discussione
Ponteggi ingegneria dei tessuti sono in rapida evoluzione per fornire tutti i segnali fisici e biochimici necessari per rigenerare, mantenere o riparare tessuti per l'applicazione della sostituzione di organi, lo studio delle malattie, lo sviluppo di farmaci, e molti altri 57. In ingegneria dei tessuti del fegato, epatociti umani primari rapidamente perdono le loro funzioni metaboliche, una volta isolati dal corpo, creando un grande bisogno di ponteggi di ingegneria e sviluppo di piattaforme per mantenere.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno di un Research Foundation Fellowship nazionale (NRF -NRFF2011-01) e Programma di ricerca competitiva (NRF-CRP10-2012-07).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta PCR da 0,2 ml | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Gorilla resistente all'ebollizione |
| Gorilla Glue, Inc. | Dipende dal fornitore. Questo è stato acquistato da un negozio locale. | ||
| Vetrini | VWR | 631-1575 | Dimensioni: 24&volte; 60 mm2 |
| Sfere di polistirene | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diametro = 140 µ m; 3x104 particelle per millilitro e distribuzione dimensionale 1,4% |
| Etanolo | Merck | 1.00983.1011 | assoluto per analisi EMSURE; Diluire al 70% con acqua Milli-Q |
| Bagno ad ultrasuoni | Elma | S10H | Forno per attrezzature |
| Nabertherm | N7/H | Attrezzatura | |
| 200 & micro; l puntale per pipetta | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Agitatore oscillante | VWR | 444-0142 | |
| Glicole polietilenico (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa; l'acrilazione dei monomeri PEG e la purificazione del precipitato risultante producono un macromero PEGDA con Mw = 4.6 kDa |
| Centrifuga | Beckman Coulter | 392932 | Attrezzatura |
| acrilato-poli(glicole etilenico) - Succinimidil valerato | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3,4 kDa |
| 2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Attrezzatura |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Film di paraffina | Parafilm M | #PM996 | Mantenuto a 9" con un'intensità consentita di 10,84 mW/cm2 |
| Bluewave 200 Faretto UV | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetraidrofurano (THF) | Merck | 107025 | |
| Agitatore orbitale | Heidolph | 543-123120-00-5 | |
| Collagene di tipo I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | Da ratto. 1x, senza CaCl2 MgCl2; pH = 7,2 |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% p/v aq. 10 x 10 ml |
| Paraformaldeide | VWR | 43368.9M Attrezzatura | |
| Freezone 4.5 liofilizzatore | Labconco | 7750020 | Attrezzatura |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | |
| Attrezzatura Microscopio elettronico a scansione | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anticorpi primari anti-topo contro il collagene di tipo I | Abcam | ab6308 | |
| Anticorpo secondario anti-topo coniugato con Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Piastra, coltura tissutale 24 pozzetti, fondo piatto (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2,5 g/L Glucosio con L-Gln | Lonza | 12-604F | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillina-Streptomicina (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Piastre di coltura non trattate Corning | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | Attrezzatura; 37 ° C, 5% di umidità |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubatori | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Kit di vitalità/citotossicità viva/morta per cellule di mammifero | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Reagente al sale di monosodio (MSR) |
| Lettore di micropiastre Infinite 200 PRO | Kit | ||
| Albumina | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anticorpi primari anti-topo (contro CYP3A4, albumina) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 marcato Falloidina | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Cloroformio | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanolo | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC acqua | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop Spettrofotometro 2000c | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Trascrizione inversa Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR selezionano Master Mix per CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primer (da scegliere) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
Riferimenti
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
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Ristampe e permessi
