Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering
Summary
This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Abstract
La capacità di mantenere la funzione degli epatociti in vitro, allo scopo di testare citotossicità xenobiotici ', studiando virus e sviluppare farmaci mirati al fegato, richiede una piattaforma in cui le cellule ricevono adeguati segnali biochimici e meccanici. sistemi recenti ingegneria dei tessuti del fegato hanno impiegato tridimensionali (3D) impalcature composte da idrogeli sintetici o naturali, data la loro ritenzione idrica e la loro capacità di fornire gli stimoli meccanici necessari da parte delle cellule. C'è stato un crescente interesse nella scaffold invertito cristallo colloidale (ICC), uno sviluppo recente, che consente un'elevata organizzazione spaziale, omotipica e interazioni cellula heterotypic, così come matrice di interazione cellula-extracellulare (ECM). Qui, descriviamo un protocollo per fabbricare patibolo ICC utilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) e il metodo di lisciviazione delle particelle. Brevemente, un reticolo è costituito da particelle di microsfere, dopo di che un pre-polymesi aggiunge soluzione r, correttamente polimerizzato, e le particelle vengono poi rimosso o dilavati, utilizzando un solvente organico (ad esempio, tetraidrofurano). La dissoluzione dei risultati reticolari in un ponteggio altamente porosa con dimensione dei pori controllati e interconnectivities che permettono media per raggiungere le cellule più facilmente. Questa struttura unica permette elevata area superficiale per le cellule di aderire come pure facile comunicazione tra i pori, e la capacità di rivestire il ICC scaffold PEGDA con proteine mostra anche un effetto marcato sulla prestazioni della cella. Analizziamo la morfologia del patibolo, così come la cella di epatocarcinoma comportamento (Huh-7.5) in termini di fattibilità e la funzione di esplorare l'effetto della struttura ICC e rivestimenti ECM. Nel complesso, questo documento fornisce un protocollo dettagliato di una impalcatura emergente che ha ampie applicazioni in ingegneria dei tessuti, in particolare l'ingegneria dei tessuti del fegato.
Introduction
Il fegato è un organo altamente vascolarizzato con una moltitudine di funzioni, tra cui la disintossicazione del sangue, metabolismo di xenobiotici, e la produzione di proteine del siero. tessuto epatico ha un complesso microstruttura tridimensionale (3D), composto da più tipi di cellule, canalicoli biliari, sinusoidi, e zone di diversa composizione biomatrice e concentrazioni di ossigeno differenti. Data questa struttura elaborata, è stato difficile creare un modello di fegato corretta in vitro 1. Tuttavia, vi è una crescente domanda di funzionale in modelli in vitro di hosting epatociti umani come piattaforme per la tossicità test anti-droga 2 e studiare malattie associate con il fegato 3.
Piattaforme di ingegneria tissutale epatica corrente hanno semplificato la complessità del fegato isolando uno, o concentrandosi su alcuni, dei parametri del fegato, cioè co-coltura delle cellule 4, composizione biochimica della zonaL microambienti 5, dinamica del flusso 6,7 e la configurazione del Biomatrice 8. Configurazione della biomatrice può essere suddiviso in parametri quali materiali impalcatura, la composizione di matrice extracellulare (ECM) proteine, matrice di rigidezza nonché la progettazione e la struttura del ponteggio. C'è stato un aumento negli studi di ingegneria dei tessuti utilizzando idrogel sintetici, in particolare poli (glicole etilenico) (PEG) idrogel 9, data la possibilità di regolare le proprietà meccaniche, bioattività, e velocità di degradazione del idrogel. Per quanto riguarda la ricerca di fegato legati, l'idrogel biocompatibile è stata applicata per lo studio infezione da virus della malattia epatica 3. Come un design della piattaforma degli epatociti, numerosi studi hanno utilizzato epatociti panino culture 10,11 e l'incapsulamento delle cellule all'interno di un idrogel 12,13 per fornire l'ambiente 3D e cellula-ECM e l'interazione cellula-cellula, che sono essenziali per imitare nel microambiente vivo. However, queste piattaforme non possiedono un alto grado di controllo e organizzazione spaziale, portando a proprietà non uniformi attraverso l'impalcatura 14.
Il colloidale cristallo invertita (ICC) 14 patibolo è un'impalcatura 3D altamente organizzato per coltura cellulare che è stato introdotto nei primi anni 2000. struttura unica del ponteggio può essere attribuito al semplice processo di fabbricazione utilizzando un cristallo colloidale, un reticolo ordinata di particelle colloidali di diametro variabile. In breve, per riassumere il processo, le particelle sono disposti in modo ordinato e ricotta usando il calore in modo da formare un reticolo. La lisciviazione del lattice, da un solvente organico, in polimerizzati risultati idrogel in cavità sferiche esagonale confezionati 15 con elevata area superficiale. Questa impalcatura altamente ordinato è già stato fatto con entrambi i materiali sintetici e naturali, incluso ma non limitato a poli (acrilammide) 16-21, poli (lattico-co-glicolico acido) 15,22-30, Poli (glicole etilenico) 31,32, poli (2-idrossietil metacrilato) 21,33-35, e chitosano 36-39. Impalcature ICC in materiali non sottomarina tendono a promuovere sferoidi cellulari all'interno delle cavità 14,23,40. Tipi di cellule multiple hanno dimostrato di proliferare successo, differenziare e funzione all'interno di questa configurazione, compresi condrociti 41, cellule stromali del midollo osseo 42, e cellule staminali 43,44. Per quanto riguarda epatociti, gli studi sono stati condotti con impalcature ICC fatte di Na 2 SiO 3 e poli (acrilammide), ma non PEG. Con semplici strategie bioconjugation (vale a dire, l'accoppiamento ammina attraverso EDC / NHS), ponteggi PEG basati su ECM proteine-coniugati possono essere fabbricate, che può rivelarsi siti di legame più cellulari per essere un più vivo come l'ambiente e migliorare la funzione epatica.
In questo manoscritto e il video associato, dettagliamo la fabbricazione del ponteggio ICCutilizzando poli (glicole etilenico) diacrilato idrogel (PEGDA) e un reticolo di polistirolo microsfere, ottimizzato per epatocarcinoma (Huh-7.5) cultura. Dimostriamo le differenze tra i generalmente non adesivo nude ponteggi ICC PEGDA e il collagene rivestite PEGDA ICC impalcatura in termini di topologia patibolo e le prestazioni delle cellule. La vitalità cellulare e la funzione sono misurati qualitativamente e quantitativamente per valutare il comportamento delle cellule Huh-7.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ponteggi ingegneria dei tessuti sono in rapida evoluzione per fornire tutti i segnali fisici e biochimici necessari per rigenerare, mantenere o riparare tessuti per l'applicazione della sostituzione di organi, lo studio delle malattie, lo sviluppo di farmaci, e molti altri 57. In ingegneria dei tessuti del fegato, epatociti umani primari rapidamente perdono le loro funzioni metaboliche, una volta isolati dal corpo, creando un grande bisogno di ponteggi di ingegneria e sviluppo di piattaforme per mantenere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno di un Research Foundation Fellowship nazionale (NRF -NRFF2011-01) e Programma di ricerca competitiva (NRF-CRP10-2012-07).
Materials
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
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