Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ters Kolloidal Kristal Poli (etilen glikol) İskele imalatı: Karaciğer Doku Mühendisliği için Üç boyutlu Hücre Kültürü Platformu

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54331
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

, Ksenobiyotiklerin 'sitotoksisite testi virüs enfeksiyonu okuyan ve karaciğer hedefleyen ilaçların geliştirilmesi amacıyla, in vitro hepatosit fonksiyonunu korumak için yeteneği, hücreler uygun biyokimyasal ve mekanik ipuçları aldığınız bir platform gerektirir. Son karaciğer doku mühendisliği sistemleri, yüksek su tutma ve hücreler tarafından ihtiyaç duyulan mekanik uyarıcılara sağlamak için kendi özellikleri göz önüne alındığında, sentetik ya da doğal hidrojeller oluşan üç boyutlu (3D) iskeleleri kullanmışlardır. ters koloidal kristal (ICC) iskele artan bir ilgi olmuştur, yüksek uzaysal organizasyon, homotipik ve heterotypic hücre etkileşimi yanı sıra hücre dışı matriks (ECM) etkileşimi sağlayan bir son gelişme. Burada, poli (etilen glikol) diakrilat (PEGDA) ve partikül ayrıştırma yöntemi kullanılarak ICC iskele imal etmek için bir protokol açıklar. Kısaca, bir örgü mikrosfer parçacıklarından yapıldığı bir ön polimer daha sonraR solüsyonu doğru polimerize ilave edilir ve tanecikler daha sonra organik bir çözücü (ör tetrahidrofuran) kullanılarak kaldırılır veya yıkanarak ekstre edilir. Kontrollü gözenek boyutları ve ortam daha kolay hücrelere ulaşmasına izin interconnectivities ile çok gözenekli iskele kafes sonuçlarının çözünme. Bu benzersiz yapı hücreleri hem de kolay gözenekler arasındaki iletişim ve proteinlerle PEGDA ICC skafold, hücre performansı üzerinde belirgin bir etki gösterir kat yeteneği yapışması için yüksek bir yüzey alanı sağlar. Biz canlılığı açısından iskele morfolojisi yanı sıra hepatokarsinom hücre (Huh-7.5) davranış analiz ve ICC yapısı ve ECM kaplamaların etkisini araştırmak için çalışır. Genel olarak, bu kağıt doku mühendisliği geniş bir uygulama, özellikle karaciğer doku mühendisliği sahip gelişmekte olan bir iskele ayrıntılı bir protokol sağlar.

Introduction

Karaciğer kan detoksifikasyon, ksenobiyotiklerin metabolizması ve serum proteinlerinin üretimi dahil fonksiyonları çok sayıda, bir çok kanlanan bir organdır. Karaciğer dokusu birden fazla hücre tipleri, safra kanalcıklarının, sinüzoidler ve farklı biyomatris kompozisyon ve farklı oksijen konsantrasyonlarına bölgelerinin içeren karmaşık bir üç boyutlu (3D) mikro-yapıya sahiptir. Bu ayrıntılı yapısı göz önüne alındığında, in vitro 1 uygun bir karaciğer model oluşturmak için zor olmuştur. Ancak, in vitro modellerde fonksiyonel test ilaç toksisitesi 2 platformları gibi insan hepatositleri barındırma ve karaciğer 3 ile ilişkili hastalıkların araştırılması için yükselen bir talep var.

Güncel karaciğer doku mühendisliği platformları zona, biyokimyasal bileşimi bir izole veya karaciğer parametreleri, bir kaç hücrelerinin 4 yani ko-kültür odaklanarak karaciğer karmaşıklığını basitleştirilmiş varl microenvironments 5, akış dinamikleri 6,7 ve biyolojik matris 8 yapılandırma. biyolojik matris konfigürasyonu, iskele malzemeler, hücre dışı matris (ECM) proteinlerin bileşimin, bir matris sertlik ve skafoldun tasarım ve yapı gibi parametreler ayrılabilir. Ayarlamak hidrojelin mekanik özellikler, biyo ve bozulma oranı yeteneği göz önüne alındığında, sentetik hidrojeller, özellikle poli (etilen glikol) (PEG) 9 hidrojeller ile doku mühendisliği çalışmaları bir artış olmuştur. Karaciğer ile ilişkili araştırma ile ilgili, biyouyumlu hidrojel karaciğer hastalığı 3 virüs enfeksiyonu çalışması için uygulanmıştır. Hepatosit platformu tasarım olarak, çok sayıda çalışma in vivo mikroçevresinin taklit etmek için gerekli olan 3D çevre ve hücre-ECM ve hücre-hücre etkileşim sağlamak için bir hidrojel 12,13 içindeki hepatosit sandviç kültürü 10,11 ve hücre kapsülleme kullanmışlardır. However, bu platformlar iskele 14 ile düzgün olmayan özellikleri lider, kontrol ve mekansal organizasyon yüksek derecede sahip değillerdir.

Ters kristal kolloidal (ICC) 14 iskelesi ilk 2000'lerin başında tanıtılan hücre kültürü için son derece organize 3D iskele olduğunu. skafold eşsiz yapısı kolloidal kristal, değişken çap koloidal parçacıkları sıralı kafes kullanarak basit imalat sürecine bağlı olabilir. Kısaca, süreç özetlemek, parçacıklar özenle düzenlenmiş ve bir kafes oluşturacak şekilde ısı kullanılarak tavlanır. Yüksek yüzey alanına sahip, altıgen şeklinde yerleştirilmiş küresel oyuk 15 bir polimerleştirilmiş hidrojel sonuçlarında bir organik çözücü, bu kafesin ayrıştırma,. Bu çok düzenli skafold, daha önce (akrilamid) 16-21, poli (laktik-ko-glikolik asit), poli 15,22-30 sınırlı, sentetik ve doğal malzemeler hem de yapılan da dahil olmak üzere, ancak edilmiştir, Poli (etilen glikol) 31,32, poli (2-hidroksietil metakrilat) 21,33-35 ve çitosan 36-39. Olmayan kirlenme malzemelerden yapılmış ICC iskeleleri boşlukların 14,23,40 içinde hücresel parçacıklarının teşvik etmek eğilimindedir. Çok sayıda hücre türleri başarıyla hücrelerin 43,44, prolifere Bu yapılandırma içinde ayırt ve işlevi, kondrositler 41, kemik iliği stromal hücreleri 42 de dahil olmak üzere, ve sap gösterilmiştir. Hepatosit ile ilgili olarak, çalışmalar, ICC Na 2 SiO 3 ve poli (akrilamid) imal iskeleler, ancak PEG ile gerçekleştirilmiştir. Basit bir bioconjugation stratejileriyle (örneğin, EDC / NHS ile amin birleştirme), ECM proteinleri konjuge edilmiş PEG-bazlı iskeleleri ortamı gibi in vivo olarak daha büyük olabilir ve hepatik fonksiyonu geliştirmek için daha fazla hücre bağlama sitesi ispat ki, imal edilebilir.

Bu yazıda ve ilgili videoda, detay ICC iskele yapımını biz(Huh-7.5), kültür hepatokarsinoma için optimize edilmiş poli (etilen glikol) diakrilat (PEGDA) hidrojel ve bir polistiren mikro-küre kafes kullanılarak. Bu iskele topoloji ve hücre performansı açısından, genel olarak yapışkan olmayan çıplak PEGDA ICC iskeleler ve kolajen kaplı PEGDA ICC iskele arasındaki farkları gösterir. Hücre canlılığı ve fonksiyonu Huh-7.5 hücre davranışını değerlendirmek için kalitatif ve kantitatif olarak ölçülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ICC İskele İmalatı (Şekil 1)

  1. polistiren (PS) menfezler (; boncuk 8-13 katmanları çapı = 6 mm) hazırlayın.
    1. 40 ul seviyesinde 0.2 ml kaynatın geçirmez mikrosantrifüj tüpler ipuçları kesti, kalıp hazırlamak. Su geçirmez yapıştırıcı ile 24 x 60 mm 2 mikroskop cam kapak fişleri kesme tüplerin üst uyun.
    2. dikkatle 20 ml'lik bir şişe bir su süspansiyonu içinde bulunan PS küreleri (çap = 140 mm) konulan su süspansiyonu üzerinden pipet ve şişe içine 18 ml% 70 etanol çözeltisi ilave edilir. toplu küreler gevşetmek için ultrasonik banyoya küre çözümü koyun. Tamamen Su ve suda çözünür bileşenleri çıkarmak için bu yıkama aşamasından birkaç kez tekrarlayın.
    3. kalıplar içine etanol içinde 100 ul pipet.
    4. 4 mm 200 ul mikropipet ucu üst kesti. iki kez elde etmek için 200 ul mikropipet kullanılarak kalıba kürelerin pipetle 25 ulHer bir kalıp içinde 50 ul toplam hacim.
    5. 120 rpm gecede bir sallanan çalkalayıcı üzerinde kalıpları yerleştirin.
    6. bir optik mikroskop altında, her kalıpta kürelerin düzenleme kontrol edin. Küreler altıgen sipariş ise,% 70 etanol içinde 50 ul ve düzenleme düzeltmek için uzunlamasına ve yanal ekseni yönünde elle çalkalanır.
    7. İki gece boyunca oda sıcaklığında (RT) etanol buharlaşması olsun. PS boncuk tavlanmasına 6 saat süreyle 130 ° C fırın içinde kalıp ve boncuk kompleksi yerleştirin.
  2. çıplak ve ECM-kaplı PEGDA iskeleleri hazırlanması.
    1. (= 4.6 kDa w M) doğrusal PEG makromerleri acrylating kurulan protokolleri 45,46 kullanarak PEGDA makromerleri sentez.
    2. iyonu giderilmiş (Di) su içinde PEGDA çözeltisi (ağ / hac)% 50 hazırlamak ve makromer doğru tamamen eriyene kadar 4713 x g'de santrifüj çözünmesi için izin verir.
      1. ECM konjuge ICC İskele, ek çözülür% 10 50,% PEGDA çözeltisi akriloil-PEG-NHS (M 3.4 W = kDa) (a / h).
    3. % 20 Hazırlama, 2-hidroksi-4 stok çözeltisi (w / v) - (2-hidroksietoksi) -2-methylpropiophenone (PI),% 70 etanol içinde.
    4. % 20,% 50 1 ml (ağırlık / hacim), PI stok çözeltisi 50 ul ekle (a / h) PEGDA arasında. PEGDA molekül ağırlığına göre PI stok çözeltisi gerekli miktarını ayarlayın.
    5. 1 dakika vorteksleyin santrifüj tüpüne karışım, homojen bir çözelti ulaşmak için.
    6. Peel (aşama 1.1.7 itibaren) cam slayt kalıpları, kalıplardan tutkal kaldırmak dikkatlice bir spatula kullanarak kafesler dışarı itmek ve bir 1.5 ml tüp içine her biri yerleştirin. 5 dakika boyunca 845 xg'de PEGDA çözeltisi ve santrifüj Pipet 300 ul kafes içerisine düzgün PEGDA çözeltisi filtre edilmesi.
    7. cımbız kullanarak tüp kafes çıkarın ve dikkatlice eldiven kuru aşırı PEGDA çözüm kurulayın. Düz CIR ile parafin film kaplı cam üzerinde kafes yerleştirinyukarı bakacak vasküler yüzey.
    8. UV nokta lamba kullanılarak 5 dakika boyunca 365 nm ultraviyole (UV) ışık (10.84 mW / cm2) için PEGDA çözüm sızmış iskele Açığa.
    9. Yeni şişelerde PEGDA polimerize kristal kafeslerindeki yerleştirin ve 20 ml tetrahidrofuran ilave (THF) (10 vial başına kafeslerin civarında). 300 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde şişeleri çalkalanır. 1-2 saatlik bir aralık ile, THF, en azından 3 kez değiştirin.
      Not: sırayla PS eksik kaldırılmasını neden olabilir iskeleleri, girmesini kabarcıklarını önlemek amacıyla THF değiştirirken tamamen THF çıkarmayın. menfezler kapak ve yeni THF eklemek için yeterli bir çözüm bırakın.
      Dikkat: THF toksiktir. eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük takın. davlumbaz altında çalıştırarak solumaktan kaçının.
    10. PS küreler kullanılan THF içine su koyarak ve çözüm rengi gözlemleyerek çözülür olup olmadığını kontrol edin. PS küreler düzgün çözülmüş değilse adımı tekrarlayın 1.2.9.
      Not: Çözelti rengi değişecektirbeyaz kalan PS küreler varsa.
  3. Biyogüvenlik kabini (BSC) iskeleleri temizleyin.
    1. iskeleler sterilize etmek için, iskele ortalama% 70, 2 ml etanol ile 50 ml santrifüj tüpüne hazırlama ve bir ıspatula kullanılarak tüp içinde iskeleleri yerleştirin. iskeleleri 1 saat etanol içinde bekletin. ileri bu adımı, BSC tüm işlemleri yürütmek.
    2. Dikkatlice etanol dökmek ve 3 dak kabarcıklarını çıkarmak için 524 x g'de fosfat tamponlu salin (PBS) (iskele başına 2 mi) ve santrifüj ile değiştirin. buzdolabında tutun ve 1-2 saat ara ile PBS birkaç kez değiştirin.
      1. Kollajen türü için, kolajen tip 1 stok çözeltisi ihtiva eden başka bir 50 ml santrifüj tüpüne (iskele başına 1 mi) hazırlanması 3 dakika boyunca 524 x g'de bir spatula ve santrifüj kullanılarak bu boru sterilize iskeleleri transfer iskelesi I-kaplı. 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde 400 rpm'de iskeleleri çalkalanır ve Soğutucu tüp tutmakya da bir gecede.
      2. PBS aspire sonra taze PBS iskeleleri daldırarak ve iki kez kullanımdan önce PBS ile iskeleleri yıkayın.
        Not: NHS kimyasal bağı (Şekil 2) oluşturmak için bir amin grubu gerektirdiği için, başka bir ECM proteinleri de yerine kolajen tip I kullanılabilir.

Şekil 1
ICC imalat 1. Genel Bakış Şekil. PEG-bazlı ICC iskeleleri ile ECM-fonksiyonlandırmalar olmadan mikroüretim teknikleri kullanılarak imal edilir. ECM ile kaplanmış ICC iskeleleri, PEG-NHS ve PEGDA (Şekil 2'de ayrıntılı olarak) gerektirir. PS örgü 6 mm'lik bir çapa ve 8-13 kordon tabakaları arasında bir yüksekliğe sahiptir. PS, polistiren; PEGDA, poli (etilen glikol) diakrilat; UV morötesi; THF, tetrahidrofuran; ECM, hücre dışı matriks. Bu rakam değiştirilmiş ve Wi izni ile kullanılmaktadırley 47. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. ICC Yapısı Karakterizasyonu

  1. , Ya da konjuge proteinler olmadan ICC yapısını analiz taramalı elektron mikroskobu (SEM) 47 kullanın.
    1. % 4 paraformaldehid (PFA) ile iskeleleri Fix, seri 25, 50, 75, 95 ve% 100 etanol çözümleri bunları kurutmak ve etanol tamamen buharlaşır kadar -80 ° C'de saklayın.
    2. 48 saat boyunca, bir dondurmalı kurutucu içinde kuru örnekler.
    3. Bir püskürtme kaplayıcı karbon bant ve yer kullanarak numune tutucu üzerine numuneyi yapıştırın.
    4. Otomatik vakumlama sonra, 20 mA 60 saniye boyunca püskürtme yoluyla 10 nm kalınlığında Pt filmi ile kapla.
    5. 5 kV (Şekil 3A, Şekil 4A) bir gerilimde SEM kullanarak görüntü ICC iskeleler.
  2. gözenek ölçmek veboşlukların arabağlantı çapı, görüntü analiz yazılımı 48 (Şekil 3B, C, örneğin ImageJ) kullanarak SEM mikrograflar analiz.
  3. Hücreleri olmadan iskele konjüge kolajen, floresan etiket görselleştirmek için antikorları (1: 100) kullanılarak kolajen konfokal lazer tarama mikroskobu 47 ile kollajen tip I ve görüntü karşı (CLSM, Şekil 4B).

3. Huh-7.5 Hücre Kültürü ve Tohum

  1. 10 mi Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş (DMEM) ve 100 U / ml, 100 mm'lik bir hücre kültür tabaklarında 2-2.5 x 10 6 hücre / ml'lik bir tohumlama yoğunluğunda kültür Huh-7.5 hücreleri BSC 37 ° C 'de, penisilin-streptomisin (büyüme ortamı) ve% 5 CO 2. değiştirme ortamı, her üç günde bir bu% 75-80 konfluent ulaşana kadar.
  2. BSC hücre tohumlama için iskeleleri hazırlayın.
    1. Dikkatle Scaff koyundüz yüzeyli bir 24 plaka yaş yukarı bakacak.
    2. Her iyi bir iskele içeren için iskele, pipet 2 ml PBS yıkamak için. PBS ve pipet 2 ml her kuyuya taze PBS aspire.
    3. PBS ve büyüme ortamı pipetle 2 ml hacme sahip (adım 3.1) ve 30 dakika boyunca bırakın. medya aspire ve iskele 1 saat kurumasını bekleyin.
  3. tripsin sindirim yöntemini kullanarak BSC kültür plaka (adım 3.1) birleşen Huh-7.5 hücreleri ayırmak.
    1. plaka aspire medya, yapışık hücreleri yıkamak için 4 ml PBS ekleyin ve sonra PBS aspire.
    2. Pipet, 37 ° C'de bir kuluçka 0.75-1 mi,% 0.25 tripsin ve yeri,% 5, 3 dakika için CO2.
    3. tripsin reaksiyonu durdurmak için kuvöz ve pipetle 5 ml ortamı plakasını sökün. 15 ml'lik bir tüp içine pipetle ortam, ayrılan hücreler ve tripsin kanşım.
    4. 3 dakika boyunca 524 xg'de santrifüj, süpernatant kaldırmak ve 5 ml medya pelletini.
  4. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 25 ul başına, hedef numarası, N 0 hücreleri içeren hücre süspansiyonu hacmini hesaplamak (standart deney için, N 0 1 x 10 6 hücre) olduğunu.
    Hücre süspansiyonu hacmi = (hücreler hedef sayısı) / (hücre süspansiyonu konsantrasyonu)
  5. Yavaş yavaş doğrudan (adım 3.1.4 itibaren) her iskele üstündeki hücre süspansiyonu içeren (N 0 hücreleri) 25 ul pipetle. inkübatör 24 oyuklu plaka koyun.
  6. 12 saat sonra, her bir yeni bir 24 oyuklu plaka ve pipet içine bir spatula kullanılarak dikkatli bir şekilde ortam 2 ml iskelesi aktarın. inkübatör 24 oyuklu plaka koyun.
  7. 3 günde ortamı değiştirmek ya da medya protein salgılanması analizi (Adım 5.1) için toplanan zaman bağlı.

4. Hücre Canlılık

  1. niteliksel hücre canlılığını analiz etmek, C kullanarak hücrelerin ve görüntü leke floresan canlı / ölü boyama kitleri kullanınLSM.
    1. Kit talimat izlenerek, 4 uM kalsein AM ve 8 uM etidyum homo-dimer-1 medya sahip bir çözelti hazırlanmıştır (adım 3.1.3).
      Not: Hücre sayısına bağlı olarak optimize edin. Hücreler çoğalmaya ve (yaklaşık 2 milyon) sayısı çift ise reaktif çift miktarda kullanın.
    2. BSC, iyi bir yapı iskeleti (aşama 3.7) ve pipet hazırlanan solüsyon 500 ul her aspire ortam. 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin.
    3. kuluçka plaka çıkarırken ışıktan örnekleri korumak için folyo tabak örtün. CLSM49 kullanarak görüntü örnekleri.
  2. Kantitatif (canlı hücreler olarak) enzimsel aktivitesini ölçmek kolorimetrik tahlilleri 50 kullanılarak hücre sağ kalabilirliğinin değerlendirmek için (yani, 2- (2-metoksi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolyum (monosodyum tuzu reaktifi)).
    1. ICC platformu için standart bir eğri (absorbans (OD) v, yani bir grafik oluşturmakErsus) hücre sayısı verilen.
      Not: Hücreler iskelelerinin boşluklarında geçebilir çünkü Hücre tohumlama, diğer platformlara kıyasla% 100 etkilidir.
      1. Standart eğri yapmak için kullanılacak hücre ekim numaraları, n, 0 belirler.
        Not: Deneyde tahmin edilmektedir hücre sayıları içeren bir dizi seçin. Örneğin, ilk hücre sayısı 5 x 10 5 hücre ve 2.5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6, ve 2 x seçim deney son gününe kadar tahminen ~ 3 kat artış varsa N 0 olarak 10 6 hücre.
      2. Adımlarda 3,1-3,6 açıklandığı gibi ICC iskeleleri (25 ul tohumlama hacmi iskele başına bir N 0) hücre ekim yapın.
      3. 6 saat sonra, iyi bir 24-çukurlu plaka iskeleleri aktarın. Hücre uyumu sağlar, ancak çoğalmasını hücre bir zamanı seçin.
      4. transfer ICC iskele üzerinde hücre sayımı gerçekleştirin.
        1. Bir iskele her kuyuya BSC ve pipet 500 ul 1x MSR çözeltisi içinde medya ile 1x 10x monosodyum tuzu ayıracı (MSR) çözümü sulandırmak. 1 saat süre ile 37 ° C'de 24 oyuklu plaka inkübe edin.
        2. her bir kaynaktan, bir 96-yuvalı plaka içine 100 ul aktarın. Boş, pipet 96 oyuklu bir plaka, farklı kuyu taze 1x monosodyum tuzu reaktif çözeltisi 100 ul olarak. El ile ışıktan korumak için folyo 96-plaka herhangi kabarcıklar kuru pipet kullanarak bulundular kaldırmak ve kapağı.
        3. λ = 450 nm ölçün OD bir spektrofotometre kullanılarak okuma. Doğru OD 51 bulmak için diğer değerlerden boş OD çıkarın.
      5. Hemasitometre kullanarak iskele (adım 4.2.1.3) aktardıktan sonra kuyuda kalan hücrelerin sayısını (N L) sayın.
        Not: hücrelerini trypsinize için tripsin 300 ul kullanın.
      6. Gerçek hücre sayısını, N A hesaplayın.
        gerçek =İlk - iyi sol
        N A = N 0 N L
      7. Vs gerçek hücre sayısı (N A) Aşama 4.2.1.4.3 elde edilen OD çizerek standart eğri yapmak ve deneylerde hücre sayısını tahmin etmek için bu kullanın.
        Not: Herhangi bir ICC parametreleri (örneğin, porojen boyutu, iskelenin boyutları, ECM protein, vs.) değiştirilirse, yeni bir standart eğri olun.

5. Hücre İşleyişine

  1. Enzim tarafından (aşama 3,7) toplanan ortamdan Huh-7.5 hücrelerinin (örneğin, albümin, üre) protein salgılanmasını analiz immünosorbent deneyi (ELISA) ile 52 bağlantılı.
    Not: ortamı seyreltilir, tohumlu hücre sayısı ve toplanan ortamın miktarına bağlı olarak. Antikor-Ön kaplanmış kuyulara sunmadan önce, 25 oranını: 5 x 10 5 hücre ICC numaralı seribaşı, bir ~ 1 kullanın.
  2. niteliksel hücre fonksiyonunu analiz etmek, belirli hücre içi proteinleri immunostain(Örneğin, albümin), enzimler (örneğin, CYP450), leke yapı bileşenleri (yani, hücre aktin) ve çekirdekler ve CLSM 49 kullanarak görüntüsü.
    1. ve pipet 2 ml PBS (aşama 3,7) medya aspire hücre yüklü ICC iskeleleri yıkayın.
    2. Pipet 1% 4 PFA ml ve sabitleme için, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
    3. 2 ml PBS ile yıkayın 3x.
    4. 30 dakika boyunca% 0.1 4- (1,1,3,3-tetrametilbütil) fenil-polietilen glikol (yüzey aktif madde), 1 ml iskeleleri inkübe edilerek membranlar geçirgenliği.
    5. 2 ile yıkayın 3x PBS herhangi sızıntı proteinleri uzaklaştırmak için ml.
    6. Pipet 500 ul% 1 sığır serumu albümini (BSA) ve spesifik olmayan engelleme 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    7. Seyreltilmiş birincil antikor (yani, albumin, CYP450) çözeltisi hazırlayın.
      1. Pipet 500 15 ml tüp içine% 1 BSA çözeltisi ul toplam 5 mi% 0.1 BSA çözeltisi hazırlamak için 4.5 ml% 0.1 yüzey aktif madde çözeltisi ilave edilir.
      2. Pipet 200 ul mikrosantrifüj tüpü içine% 0.1 BSA çözeltisi 98 ul 1:50 üretilmesi için birincil antikor 2 ul (birincil antikor:% 0.1 BSA) içinde primer antikor çözeltisi.
    8. Pipet 40 iskele üzerinde birincil antikor çözüm ul ve parafin film ile alt tabakayı kapsamaktadır. Alüminyum folyo ile 24 plaka sarın ve gece boyunca 4 ° C'de çanak saklayın.
    9. 2 ml PBS ile yıkayın 3x ve yıkama arasında yavaşça plaka sallayın.
    10. Seyreltilmiş biyotinile edilmiş ikincil antikor (örneğin, anti-fare antikoru) bir stok çözelti hazırlayın.
      1. 100 (ikincil antikor:% 0.1 BSA) ikincil antikor çözeltisi pipetle 198 ul% 0.1 BSA çözeltisi ve 2 ul, ikinci antikor, bir 1 üretmek.
      2. % 0.1 BSA çözeltisi içinde rodamin ya da floresan işaretlenmiş falloidinle (selüler aktin filamanlarını leke) içindeki bir% 0.1 stok çözelti hazırlayın.
      3. Pipet, her çözeltiden 25 ul bir tüp ve W karışımıell.
    11. Pipet platform üzerinde ikincil antikor stok çözeltisi 50 ul. Parafin film iskele kapağı 2 st için oda sıcaklığında alüminyum folyo ve mağaza ile çanak sarın.
    12. 2 ml PBS ile yıkayın 3x.
    13. Pipet% 0.2 4'-6-diamidino-2-fenilindol, 200 ul (DAPI; bir çekirdek boyası) bir platform üzerinde çözeltisi ve 2-3 dakika için oda sıcaklığında saklayın. alüminyum folyo ile plaka örtün.
    14. 2 ml PBS ile yıkayın 2x.
    15. bir damlalık kullanılarak, alt-tabaka üzerine monte edilmek ortam bir damla yerleştirin.
    16. Dikkatle CLSM 47 kullanarak bir bardak slayt ve görüntü üzerinde iskelesi koydu.
  3. gerçek zamanlı, polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gen ekspresyonunu değerlendirmek. Ters transkriptaz PCR (RT-PCR) 53 ve üreticinin talimatlarına göre qPCR 54 standart kitleri kullanın. aşağıda tarif edildiği gibi hücre RNA ekstrakte edin.
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (aşama 3,7) iskele yerleştirin.
    2. Her bir mikrosantrifüj tüpü içine kloroform 200 ul pipet ve 15-20 saniye için el kuvvetli bir şekilde tüp sallayın. fazlar ayrılana kadar ~ 3 dakika, oda sıcaklığında tüpler tutun.
    3. 13.000 xg, 15 dakika 4 ° C'de örnek Santrifüj ve fazlar karışmaz böylece dikkatlice tüpleri çıkarın.
    4. Dikkatli bir şekilde ikinci bir mikrosantrifüj tüpü içine önce tüpten üst aköz faz 500-600 ul pipetle.
    5. bu ikinci tüpün izopropanol eşdeğer bir hacmi (500-600 ul) eklenir.
    6. tüpü 3-5 kez ters çevirin ve 10 dakika oda sıcaklığında kaldıktan tüpü terk.
    7. 13.000 x g'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
      1. Pelet 5 dakika daha tüp, santrifüj altındaki görünür değilse.
        Not: hala görünür pelet ise, RNA miktarı yetersiz olabilir.
    8. bentüp içine DEPC su ile seyreltilir, 1 ml% 70 etanol içinde süpernatan ve pipet atmak için açık kapakla nvert borular.
    9. pelet tüpün duvarından ayrılır yani biraz tüpü vorteks ve ardından tüp hava kurumaya bırakın.
    10. Pelet tekrar süspansiyon DPEC su 50 ul ekle.
    11. pelet eriyene kadar pipetlenmesini tutun.
    12. Tek-şeritli RNA'ya iki-şeritli RNA denatüre etmek için 55 ° C'de 10 dakika süre ile devam edin.
    13. Hafif tüpler kısaca santrifüj sonra (7500 xg, 4 dakika, 4 ° C) tüp alt parmaklarını davul ve.
    14. 56 de tarif edildiği gibi ters transkriptaz 55 ve gerçek zamanlı PCR performans kadar buz tüpler tutun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ICC iskele yapısal karakterizasyon ve hepatositler kültüre her ICC iskele condition en etkinliğinin karşılaştırılması için temsili sonuçlar gösterilmiştir ve aşağıda açıklanmıştır. Bu sonuçlar kullanılan ICC iskele şartları 0 ug / ml (çıplak), 20 ug / ml (Kollajen 20), 200 ug / ml (Kollajen 200) ve 400 ug / ml (400 kolajen) ve ilk kollajen kaplamalar huh-7.5 hücre tohum sayısı 1x10 6.

ICC gözenek bağlantıları ve iskele topoloji karakterizasyonu.

SEM görüntüleme, ICC iskelelerinin tespit ve dondurularak kurutulduktan sonra, ilk ICC gözenekler arasında uygun bağlantıları kuruldu olup olmadığını belirlemek için ve iskele topolojisine çeşitli kollajen konsantrasyonlarının konjugasyon etkisini görmek için kullanıldı. İki d kantitatif analizimensional çıplak ICC SEM görüntüleri (Şekil 3A) ImageJ yazılımı kullanılarak, 102.3 ± 9.3 um arasında bir ortalama gözenek çapına ve 38.6 ± 4.3 um arasında bir ortalama çapa bağlantı (Şekil 3B, C) ​​elde edilmiştir. gözenekler arasındaki bu bağlantı yapı iskeletinin her yerinde önemli hücrelere besinlerin uygun difüzyon rol hem de hücre-hücre etkileşim oynar. Kollajen kaplama fazla kolajen konjugasyon (Şekil 4A) daha yüksek konsantrasyonlarda tanımlanan bir elyaf gözlü ağ ile sonuçlanmıştır. Konfokal görüntüler kolajen konsantrasyonunda (Şekil 4B) artışlara boşluğu yüzeyleri üzerinde kolajen ve daha yüksek yüzey alanı içerisinde bile katmanları ortaya koymaktadır.

Huh-7.5 hücre canlılığı ve fonksiyonu ICC platformu koşullarının etkisi.

Huh-7.5 hücrelerin floresan Live / Dead leke tabi tutulduŞekil 5 'de gösterildiği gibi, tahlil (4 uM kalsein AM ve 8 uM EthD-1) ing ve CLSM kullanarak görüntülü. çıplak yapıştırıcı olmayan ICC iskeleleri Serpilen hücreleri, gözenek ve hücre-hücre ara bağlantı arasındaki agrega eğiliminde gözenekler İlerleyen zamanlarda (Gün 7 ve 10) görüldü. Hücreler iskele yüzeyi olarak günün erken saatlerinde 1. Hücre canlılığı olarak arası gözenekli hücre-hücre etkileşimine bağlı izin ICC iskeleler bir kolajen kaplamanın varlığı, yeşil boya ile gösterilen zamanla artmıştır ve genellikle daha yüksek kolajen kaplı iskeleler, daha yüksek yeşil floresan ile gösterildiği gibi. 6 hücre canlılığı ICC 3D yapı ve protein konsantrasyonunun etkisi daha fazla araştırma için niceliksel MSR sonuçlarını göstermektedir. Bir kolorimetrik hücre canlılığı deneyi t normalize edildi ICC iskele koşullarında hem de (450 nm'de ölçülen), 2B polistiren kültür plakası ve absorbans verilerine kültürlenmiş hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştirO kontrolü (Gün 1). 2D plakalar üzerine kültürlenmiş hücreler hücre canlılığını muhafaza ancak hücre çoğalmasında artış gözlenmiştir. 3D çıplak ICC iskele büyük ölçüde 3D matrisinin önemini belirten, 2B durumuna göre hücre çoğalmasını geliştirilmiş. Kollajen kaplamanın eklenmesi ile, bu şekilde 5 niteliksel gözlem teyit 14. Günde 200 ug / ml kaplanmış ICC iskele hücre çoğalması, tüm kolajen konsantrasyonlarda zamanla artmıştır ve maksimum çoğalma bulunmuştur.

Hepatosit fonksiyonu ELISA albümin ile miktarı da 7 salgılanmış serum albümini arasında pozitif bir korelasyon göstermektedir Şekil. Albümin salgılama değişikliklerini hem de farklı bir ICC iskele koşullar üç yapışma proteinlerinin gen tanımlama profili izlenmesi yolu ile değerlendirilebilir ve kollajen konsantrasyonu konjüge edildi iskele. içinde kültür Gün 14, Huh-7.5 hücrelerin400 mg / ml kaplı ICC iskeleleri çıplak iskele kültüre gibi albümin fazla üç katını salgılanan. E-kadherin, N-kadherin, ve farklı ICC skafold koşullarında β1 proteinleri integrin gen ekspresyon profillerinin için sonuçlar Şekil 8'de görülmektedir. Diğer kaplama koşullarında (Şekil 8A) ile karşılaştırıldığında, 400 ug / ml kaplanmış ICC iskeleler E-kadherin mRNA ifadesinin hızı fazla 4 kat artmıştır. N-kaderin gen ifadesinin kat değişim kollajen kaplamanın yüksek konsantrasyonlarda daha fazlaydı. Ancak, gen ekspresyonu β1 integrin nispeten sabit kaldı ve 200 ug / ml kaplanmış ICC iskeleleri dışındaki tüm ICC iskeleleri koşullarda azalmıştır.

Şekil 32
NHS aracılığıyla PEGDA iskelesine kollajen Şekil 2. çekimi kimya. Biyoaktif iskeleleri iskele konjügasyon sağlayan kolajen amin grubuna reaksiyona giren bir amin-reaktif süksinimidil (NHS) ester sahip PEG-NHS kullanımı. PEG, poli (etilen glikol); NHS, N-hidroksisukinimid, UV ultraviyole. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
ICC boşluk ve bağlantıların büyüklüğü Şekil 3. Analiz. (A), ICC iskele SEM mikrograflan (ölçek çubuğu = 100 um) ImageJ yazılımı kullanılarak analiz edildi ve kantitatif histogramları olarak temsil edilmiştir (B) gözenek çapı ve (C) arabağlantı çapı. Bu rakam değiştirilmiş ve Wiley 47 izni ile kullanılmıştır."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
ICC iskele topoloji kollajen kaplama Şekil 4. Etkisi. (A) SEM görüntüleri ve (B) konfokal görüntüleri niteliksel 20 ug / ml ile kaplı iskelelerinin yüzey topolojisini, 200 mikrogram / ​​ml değerlendirmek için alındı ​​ve 400 mg / ml kollajen. Kırmızı kutular aşağıda daha yüksek büyütme görüntüleri gösterilen boşluğu çevreleyen. Ölçek çubukları (A) 5 um, (B), 200 um ile 100 um (daha yüksek büyütme). Bu rakam değiştirilmiş ve Wiley 47 izni ile kullanılmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 5. nitel Live / Dead tahlil kullanarak hücre canlılığı ve morfolojisi ICC platformu koşullarının etkisi. Farklı kollajen konsantrasyonu kaplamalar (0, 20, 200 ile ICC iskeleleri numaralı seribaşı Live / Dead lekeli Huh-7.5 hücrelerin Konfokal görüntüler ve 400 ug / ml), 1, 4, 7 ve 10 gün sonra, ekimden alınmıştır. (Kalsein) Yeşil leke canlı hücreleri ve kırmızı leke gösterir (Ethidium homodimer-1) hücre ölümünü gösterir. Ölçek çubukları 200 uM göstermektedir. [Bu rakam değiştirilmiş ve Wiley 47 izni ile kullanılmıştır] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. Etkisikantitatif kolorimetrik hücre canlılığı testi kullanılarak hücre canlılığı üzerindeki platform tipi ve ICC platformu koşulları. 2B polistiren kültür plaka ve farklı kollajen konsantrasyonu kaplamalar (0, 20, 200 ile ICC iskeleleri numaralı seribaşı Huh-7.5 hücrelerde ve 400 mg / ml ) kolorimetrik MAB canlılığı deneyi 1, 4, 7, 10 tabi tutuldu ve alınan 14 gün sonra tohumlama. Absorbans 450 nm'de ölçülür ve veriler Gün 1 absorbans değerleri normalize edilmiştir. (n = 3, ortalama ± SD; ***: p <her grubun Günlük 1 için okuma MSR çözüm absorbans göre 0.001.) [Bu rakam değiştirilmiş ve Wiley 47 izni ile kullanılmıştır] bir görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Şekil 7,
ICC p Şekil 7. etkisiSalgılanan albümin konsantrasyonu ELISA analizi kullanılarak Huh-7.5 fonksiyonu latform koşulu. Albümin ELISA serum albümini sekresyonu ölçmek için kullanıldı Farklı kollajen konsantrasyonu kaplamalar (0, 20, 200 ve 400 ug / ml) gün 1, 4, 7, 10 ve tohumlama sonra 14 hücre yüklü ICC iskeleleri toplanan medya. Her veri noktası, 3 örneğin ortalama temsil eder ve kolorimetrik MAB hücre canlılığı deneyi kullanılarak bulunan hücrelerin sayısı ve oluşturulmuş bir standart eğri ile normalize edilir (n = 3, ortalama ± SD). [Bu rakam değiştirilmiş ve Wiley 47 izni ile kullanılmıştır] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8,
Huh-7.5 ICC platformu durumunun Şekil 8. etkisigen ekspresyon analizi kullanılarak fonksiyonu. Gerçek zamanlı kantitatif PCR farklı kollajen konsantrasyonu kaplamalar ICC iskeleler kültürlenen hücrelerin gen tanımlama profili kullanılmıştır (0, 20, 200 ve 400 ug / ml) gün 1, 4 ve 7 sonrası tohumlama. Üç birleşim proteinleri, yani (A) E-kadherin, (b) N-kaderin, ve (C) integrin Beta 1 ifade seviyeleri, GAPDH normalize edilmiştir mRNA seçilmiştir. (n = 3, ortalama ± SD *:. p <0.05 **:.. p <0.01 Gün 1 her grup gen ifadesi ile karşılaştırıldığında) [Bu rakam, modifiye ve Wiley 47 izni ile kullanılır olmuştur] için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Doku mühendisliği iskeleleri hızla tüm yeniden korumak veya ilaçlar, hastalığın okuyan gelişen organ değiştirme uygulaması için dokuları onarmak için gerekli olan fiziksel ve biyokimyasal ipuçları, ve diğerleri 57 sağlamak için gelişmektedir. karaciğer doku mühendisliği, birincil insan hepatositler hızla kez vücuttan izole onların metabolik fonksiyonları, mühendislik iskeleleri için büyük bir ihtiyaç yaratmak ve karaciğer fonksiyon korumak için platformlar geliştirme kaybedersiniz. In vitro hepatosit kültür platformlarında mevcut farklı biomateryaller kullanmışlardır. Bu alandaki araştırmalar, ECM protein yapılandırması 58,59, ko-kültür 60,61 ve 62 micropatterning gibi in vivo karaciğer mikroçevresinin çeşitli özelliklerini, taklit merkezli olmuştur. Ancak, kontrollü gözeneklilik ve yüksek uzaysal organizasyon ile iskelelerinin eksikliği olmuştur. Bu bağlamda tarif edilen ICC hücre kültürü platform, onun izotropik özellikleri ve yüksek organizasyonu ile, bu boşluğu giderir. ICC PEGDA iskele hepatokarsinoma hücrelerinin, hepatositler için bir model hücre tipi kültürlenmesi için uygun bir platform göstermektedir, ve bu daha da kolajen kaplama hücre davranışını 47 arttırır.

Uygulamada, ICC iskele boşluğu boyutunu PS, mikro-büyüklüğüne göre ayarlanabilir. Buna ek olarak, skafoldun birbirine boyutu zaman ve tavlama işleminin sıcaklığı ile kontrol edilebilir; daha yüksek tavlama sıcaklığı ya da daha büyük bir bağlantı çaplarında daha tavlama süresi ile sonuçlanır. daha büyük bir bağlantı çapları iskele mekanik stabilitesini tehlikeye atar Bu nedenle, bu parametrelerin dikkatle seçilmelidir. Bu çalışmada, çapı 140 um PS küreler de merkezinde hücre nekrozunu önlemek için çıplak ICC iskeleler sonuçlanan hepatospheres boyutunu sınırlamak için hepatosit hücre kültürü için seçilmiştirpatocyte sfero. temsili sonuçlarında görüldüğü gibi 63, ICC iskele 3D mimari 2D polistiren plaka hücre kültürüne göre daha yüksek Huh-7.5 hücre çoğalmasını sağlar. Sonuçlar ICC skafoldun birbirine üniform kaviteler boşlukları arasında etkin hücre-hücre etkileşimleri ve karışma sağlar göstermektedir.

kolajen tip konsantrasyonu Etkilenen hücre morfolojisi, canlılığı ve fonksiyonu kaplanması. Kolajen tip I Disse, hepatositler 64 bitişik bir alan boşluğu içinde bulunan önemli bir ECM proteindir. Yapışkan olmayan, çıplak PEGDA ICC iskeleleri geniş yüzey alanı bugünü kullanan ise hepatosit sfero oluşumunu, iskele yüzeyine yapışmış iskele biyoaktif ve Huh-7.5 hücrelerin hale kollajen kaplama terfi. upregüle E-kadherin, N-cadhe ile gösterildiği gibi ECM proteini kaplı ICC iskeleleri, hücre ECM etkileşim hem de her iki hücre-hücre etkileşim geliştirilmişhücre davranışını düzenleyen önemli bir rol oynayabilir rin ve integrin β1 gen ekspresyonları,. Kolajen tip I 200 mL ug / 400 ug / ml konsantrasyonlarda, hücre proliferasyonunu ve albumin salgılanmasını artırır, Huh-7.5 kültürü için uygun idi.

ICC fabrikasyon yarattığı ana sınırlama PS küre hizalama ve menfezler yapma numarası üzerinden kontrol edilmesidir. etanol pratik buharlaştırma kalıplara küreler yükleme örgülerde kürelerin katmanların farklı sayıda sonuçlanan farklı alanda yoğunluğu neden olurken. Bununla birlikte, su gibi daha az uçucu çözeltisinin kullanımı da dezavantajları vardır. Bu montaj sistemi 65 kayan az düzenli Aday yol açar ve bağlı menisküs oluşumuna yüksek eğimli iskele yüzeyinin yüksek bir olasılık vardır. Başka bir sınırlama bağlantıları en yüksek verimliliği sağlamak için kalıplar içinde kürelerin doğru hizalama olduğunu. sallayarak adım (adım 1.1.5 ve 1.1.6) Bu nedenle cICC imalat tekniğine ritical. İyi bir düzenleme mikroskopi tarafından gözlemlenen değilse, adım 1.1.6 tekrarlayın.

Genel olarak, ICC PEGDA iskele basit üretim protokolü ile, 3D hücre kültür uygulamaları için bir platform olarak rahat bir şekilde kullanılabilir. Proteinleri ile çıplak iskele biyoaktivasyonu daha fonksiyonel özelliklerini 14 artırır. Bu yazıda, biz imalat protokolü uyarlanmış ve karaciğer doku mühendisliği uygulamaları için hücre değerlendirme analizleri seçti. Bununla birlikte, bir çok hücre tipinde aralığı bu eşsiz iskele içinde kültürlenebilir ve her bir hücre tipi belirli parametrelerin değişiklik yapılması gerekebilir. Bir biyoreaktör kullanılarak çoklu ECM protein türü, ko-kültür ve dinamik kültür açısından karmaşıklığı da katları daha da hücre performansını arttırmak için ilave edilebilir. Bu platform, karaciğer hastalıkları çalışma ve nakli için kullanılmak üzere, doku rejenerasyonu ve ilaç geliştirilmesine yardımcı olmak için bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar Ulusal Araştırma Vakfı Bursu (NRF -NRFF2011-01) ve Rekabet Araştırmaları Programı (NRF-CRP10-2012-07) dan destek için teşekkürlerimizi sunarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR tube Axygen Scientific PCR-02D-C Boil-proof
Gorilla Glue Gorilla Glue, Inc. Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides VWR 631-1575 Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres Fisher Scientific TSS#4314A Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol Merck 1.00983.1011 absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath Elma S10H Equiment
Furnace Nabertherm N7/H Equipment
200 µl pipette tip Axygen Scientific T-210-Y-R-S
Rocking shaker VWR 444-0142
Polyethylene Glycol (PEG) Merck 1.09727.0100 Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge Beckman Coulter 392932 Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate Laysan Bio ACRL-PEG-SVA-3400-1g Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma Aldrich 410896
Vortex VWR 58816-123 Equipment
Microcentrifuge Eppendorf 5404 000.413
Paraffin Film Parafilm M  #PM996 Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight Blaze Technology  120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF) Merck 107025
Orbital shaker Heidolph 543-123120-00-5
Collagen Type I Sigma Aldrich C3867-1VL From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 20012-027 16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde VWR 43368.9M Equipment
Freezone 4.5 freeze drier Labconco 7750020 Equipment
Sputter coater Jeol Ltd. JFC-1600 Equipment
Scanning Electron Microscope Jeol Ltd. JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Life Technologies A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)  Bio-Rev PTE LTD 3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		 Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S) Life Tchnologies 15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes Sigma Aldrich CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators Thermofisher Scientific 371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer Thermofisher Scientific 02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Life Technologies L3224 
CCK-8 Assay Dojindo Laboratories CK04-11 Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader  Tecan
Albumin Human ELISA kit Abcam ab108788
Triton X-100 Bio-Rad #1610407
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) Santa Cruz Biotechnology sc-53850; sc-271605
DAPI Life Technologies D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin Life Technologies A34055
Trizol Life Technologies 15596-026
Chloroform VWR 22706.326
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
DPEC water Thermofisher Scientific AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer Thermofisher Scientific ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix  Bio-Rad Laboratories 1708840
SYBR select Master Mix for CFX Life Technology 4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  2. Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
  3. Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
  4. Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
  5. Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
  6. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
  7. Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  9. Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
  10. Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  11. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
  12. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  13. Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
  14. Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
  15. Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
  16. Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
  17. da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
  18. da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
  19. Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
  20. Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
  21. Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
  22. Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
  23. Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
  24. Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
  25. Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
  26. Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
  27. Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
  28. Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
  29. Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
  30. Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
  31. Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
  32. Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
  33. Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
  34. Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
  35. Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
  36. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
  37. Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
  38. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  39. Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
  40. Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
  41. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  42. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
  43. Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
  44. Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
  45. Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
  46. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
  47. Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
  48. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
  49. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  50. Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
  51. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  52. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  53. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  54. JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  55. JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
  56. Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
  57. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
  58. Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
  59. Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
  60. Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
  61. Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
  62. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  63. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  64. Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
  65. Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).

Tags

Bioengineering Sayı 114 Karaciğer doku mühendisliği poli (etilen glikol) hidrojel ters kolloidal kristal hepatosit hücre kültürü biofunctionalization
Ters Kolloidal Kristal Poli (etilen glikol) İskele imalatı: Karaciğer Doku Mühendisliği için Üç boyutlu Hücre Kültürü Platformu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon,… More

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon, W. Y., Kim, M. H., Lee, J. H., Ng, S. S., Tabaei, S. R., Cho, N. J. Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (114), e54331, doi:10.3791/54331 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter