This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
القدرة على الحفاظ على وظيفة خلايا الكبد في المختبر، لغرض اختبار السمية الخلوية الاكسيوبيوتك "، ودراسة عدوى الفيروس وتطوير عقاقير تستهدف الكبد، يتطلب منصة في الخلايا التي تستقبل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية المناسبة. وقد استخدمت النظم الهندسية أنسجة الكبد الأخيرة ثلاثية الأبعاد (3D) السقالات تتألف من الهلاميات المائية الاصطناعية أو الطبيعية، بالنظر إلى احتباس الماء العالية وقدرتها على توفير المحفزات الميكانيكية التي تحتاجها الخلايا. وكان هناك اهتمام متزايد في السقالة مقلوب الكريستال الغروية (ICC)، والتطورات الأخيرة، والذي يسمح منظمة عالية المكانية، مثلي النمط والتفاعل خلية مغاير، وكذلك المصفوفة (ECM) التفاعل بين الخلايا خارج الخلية. هنا، نحن تصف بروتوكول لافتعال سقالة للمحكمة الجنائية الدولية باستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) وطريقة الجسيمات الرشح. لفترة وجيزة، يتم إجراء شعرية من الجسيمات microsphere، وبعد ذلك وقبل البوليمريضاف حل ص، بلمرة بشكل صحيح، ثم تتم إزالة الجزيئات، أو تتسرب، وذلك باستخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، رباعي هيدرو الفوران). حل النتائج شعرية في السقالة المسامية العالية مع أحجام المسام للرقابة وinterconnectivities أن السماح لوسائل الإعلام للوصول إلى خلايا أكثر سهولة. هذا الهيكل الفريد يسمح مساحة عالية للخلايا التمسك فضلا عن سهولة الاتصال بين المسام، والقدرة على معطف المحكمة الجنائية الدولية سقالة PEGDA مع البروتينات ويظهر أيضا تأثير ملحوظ على أداء الخلية. نحن نحلل مورفولوجية السقالة وكذلك الخلايا سرطانة الكبد السلوك (هاه 7.5) من حيث الجدوى وتعمل لاستكشاف تأثير هيكل المحكمة الجنائية الدولية والطلاء ECM. وعموما، فإن هذه الورقة بروتوكول تفصيلي لسقالة الناشئة التي لها تطبيقات واسعة في هندسة الأنسجة، وخاصة الهندسة أنسجة الكبد.
الكبد هو الجهاز أوعية دموية للغاية مع العديد من المهام، بما في ذلك إزالة السموم من الدم، والتمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك، وإنتاج البروتينات في الدم. أنسجة الكبد لديها معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) المجهرية، التي تتألف من أنواع متعددة الخلايا، نفيق الصفراء، والجيوب، ومناطق مختلفة التكوين بايوماتريكس وتركيزات الأكسجين مختلفة. ونظرا لهذا الهيكل تفصيلا، فقد كان من الصعب لخلق نموذج الكبد السليم في المختبر 1. ومع ذلك، هناك الطلب المتزايد على وظيفية نماذج في المختبر استضافة خلايا الكبد البشرية كمنصات لسمية اختبار المخدرات 2 ودراسة الأمراض المرتبطة الكبد 3.
وتبسيط مناهج هندسة الأنسجة الكبد الحالية تعقيد الكبد عن طريق عزل واحدة، أو التركيز على عدد قليل من المعلمات الكبد، وهي ثقافة مشتركة من الخلايا 4، تكوين كيميائي حيوي من زوناmicroenvironments ل 5، ديناميكية تدفق 6،7 وتكوين بايوماتريكس 8. تكوين بايوماتريكس يمكن تقسيم إلى معلمات مثل المواد سقالة، تكوين المصفوفة خارج الخلية البروتينات (ECM)، وتصلب مصفوفة وكذلك تصميم وهيكل السقالة. كان هناك ارتفاع في دراسات هندسة الأنسجة باستخدام الهلاميات المائية الاصطناعية، خاصة بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) الهلاميات المائية 9، نظرا لقدرتها على ضبط الخصائص الميكانيكية، والنشاط الحيوي، ومعدل التدهور هيدروجيل ل. وفيما يتعلق البحوث المتعلقة الكبد، تم تطبيق هيدروجيل حيويا للدراسة عدوى فيروس مرض الكبد 3. ونتيجة لتصميم منصة الكبدية، وقد استخدمت العديد من الدراسات الكبدية الثقافات شطيرة 10،11 والتغليف خلية داخل هيدروجيل 12،13 لتوفير بيئة 3D وخلية ECM والتفاعل خلية خلية التي تعتبر ضرورية لتقليد في المكروية الجسم الحي. هاوالاصدار، هذه المنابر لا تمتلك درجة عالية من التحكم والتنظيم المكاني، مما يؤدي إلى خصائص غير موحدة من خلال منصة الاعدام 14.
والغروية وضوح الشمس مقلوب (ICC) 14 سقالة هي سقالة 3D درجة عالية من التنظيم للثقافة الخلية التي تم تقديمها لأول مرة في 2000s في وقت مبكر. ويمكن أن يعزى بنية فريدة من نوعها السقالة لعملية التصنيع بسيطة باستخدام الكريستال الغروية، وهي شعرية أمر من الجسيمات الغروية من قطر متغير. لفترة وجيزة، لتلخيص العملية، جزيئات مرتبة بدقة ومطوع باستخدام الحرارة لتشكيل شعرية. رشح هذا شعرية، عن طريق المذيبات العضوية، في النتائج هيدروجيل بلمرة في تجاويف كروية معبأة سداسي 15 مع مساحة سطح عالية. تم عرض هذه السقالة أمر غاية التي سبق مع المواد الاصطناعية والطبيعية على حد سواء، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر بولي (الأكريلاميد) 16-21، وبولي (اللبنيك المشترك، حمض الجليكوليك) 15،22-30، وبولي (جلايكول الإثيلين) 31،32، بولي (ميتاكريليت 2-هيدروكسي) 21،33-35، والشيتوزان 36-39. السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مصنوعة من مواد غير قاذورات تميل إلى تعزيز الكروية الخلوية داخل تجاويف 14،23،40. وقد ثبت أن أنواع الخلايا متعددة لتتكاثر بنجاح، تمييز وظيفة ضمن هذا التكوين، بما في ذلك غضروفية 41، خلايا انسجة نخاع العظم 42، والخلايا الجذعية 43،44. وفيما يتعلق الكبدية، وقد أجريت دراسات مع السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مصنوعة من نا 2 شافي 3 و بولي (الأكريلاميد)، ولكن ليس PEG. مع استراتيجيات bioconjugation بسيطة (أي أمين اقتران من خلال EDC / NHS)، ويمكن أن تكون ملفقة السقالات ECM البروتينات مترافق أساس PEG، التي يمكن أن تثبت مواقع الربط المزيد من الخلية لتكون أكثر في الجسم الحي مثل البيئة وتعزيز وظيفة الكبد.
في هذه المخطوطة والفيديو المرتبطة بها، ونحن بالتفصيل تصنيع السقالة للمحكمة الجنائية الدوليةباستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) هيدروجيل وشعرية البوليسترين microsphere الأمثل لسرطانة الكبد (هاه 7.5) الثقافة. ونحن لشرح الفروق بين nonadhesive عموما العارية السقالات للمحكمة الجنائية الدولية PEGDA والمغلفة الكولاجين PEGDA للمحكمة الجنائية الدولية سقالة من حيث طوبولوجيا سقالة وأداء الخلية. يتم قياس بقاء الخلية وظيفة نوعيا وكميا لتقييم سلوك الخلية هوه 7.5.
والسقالات هندسة الأنسجة تتطور بسرعة لتقديم كل الاشارات الجسدية والكيميائية الحيوية اللازمة لتجديد وصيانة أو إصلاح الأنسجة لتطبيق استبدال الجهاز، ودراسة الأمراض وتطوير الأدوية، وغيرها الكثير 57. في هندسة الأنسجة الكبد وخلايا الكبد البشرية الأولية يفقد بسرعة …
The authors have nothing to disclose.
الكتاب نود أن نعترف بدعم من مؤسسة أبحاث زمالة الوطنية (جبهة الخلاص الوطني -NRFF2011-01) وبرنامج البحوث التنافسية (جبهة الخلاص الوطني، CRP10-2012-07).
0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
DAPI | Life Technologies | D3571 | |
Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
Chloroform | VWR | 22706.326 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
Primers (to be chosen) | |||
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |