تصنيع مقلوب الغروية كريستال بولي (جلايكول الإثيلين) سقالة: وثلاثي الأبعاد منصة الثقافة خلية للهندسة الأنسجة الكبد
Summary
This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Abstract
القدرة على الحفاظ على وظيفة خلايا الكبد في المختبر، لغرض اختبار السمية الخلوية الاكسيوبيوتك "، ودراسة عدوى الفيروس وتطوير عقاقير تستهدف الكبد، يتطلب منصة في الخلايا التي تستقبل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية المناسبة. وقد استخدمت النظم الهندسية أنسجة الكبد الأخيرة ثلاثية الأبعاد (3D) السقالات تتألف من الهلاميات المائية الاصطناعية أو الطبيعية، بالنظر إلى احتباس الماء العالية وقدرتها على توفير المحفزات الميكانيكية التي تحتاجها الخلايا. وكان هناك اهتمام متزايد في السقالة مقلوب الكريستال الغروية (ICC)، والتطورات الأخيرة، والذي يسمح منظمة عالية المكانية، مثلي النمط والتفاعل خلية مغاير، وكذلك المصفوفة (ECM) التفاعل بين الخلايا خارج الخلية. هنا، نحن تصف بروتوكول لافتعال سقالة للمحكمة الجنائية الدولية باستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) وطريقة الجسيمات الرشح. لفترة وجيزة، يتم إجراء شعرية من الجسيمات microsphere، وبعد ذلك وقبل البوليمريضاف حل ص، بلمرة بشكل صحيح، ثم تتم إزالة الجزيئات، أو تتسرب، وذلك باستخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، رباعي هيدرو الفوران). حل النتائج شعرية في السقالة المسامية العالية مع أحجام المسام للرقابة وinterconnectivities أن السماح لوسائل الإعلام للوصول إلى خلايا أكثر سهولة. هذا الهيكل الفريد يسمح مساحة عالية للخلايا التمسك فضلا عن سهولة الاتصال بين المسام، والقدرة على معطف المحكمة الجنائية الدولية سقالة PEGDA مع البروتينات ويظهر أيضا تأثير ملحوظ على أداء الخلية. نحن نحلل مورفولوجية السقالة وكذلك الخلايا سرطانة الكبد السلوك (هاه 7.5) من حيث الجدوى وتعمل لاستكشاف تأثير هيكل المحكمة الجنائية الدولية والطلاء ECM. وعموما، فإن هذه الورقة بروتوكول تفصيلي لسقالة الناشئة التي لها تطبيقات واسعة في هندسة الأنسجة، وخاصة الهندسة أنسجة الكبد.
Introduction
الكبد هو الجهاز أوعية دموية للغاية مع العديد من المهام، بما في ذلك إزالة السموم من الدم، والتمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك، وإنتاج البروتينات في الدم. أنسجة الكبد لديها معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) المجهرية، التي تتألف من أنواع متعددة الخلايا، نفيق الصفراء، والجيوب، ومناطق مختلفة التكوين بايوماتريكس وتركيزات الأكسجين مختلفة. ونظرا لهذا الهيكل تفصيلا، فقد كان من الصعب لخلق نموذج الكبد السليم في المختبر 1. ومع ذلك، هناك الطلب المتزايد على وظيفية نماذج في المختبر استضافة خلايا الكبد البشرية كمنصات لسمية اختبار المخدرات 2 ودراسة الأمراض المرتبطة الكبد 3.
وتبسيط مناهج هندسة الأنسجة الكبد الحالية تعقيد الكبد عن طريق عزل واحدة، أو التركيز على عدد قليل من المعلمات الكبد، وهي ثقافة مشتركة من الخلايا 4، تكوين كيميائي حيوي من زوناmicroenvironments ل 5، ديناميكية تدفق 6،7 وتكوين بايوماتريكس 8. تكوين بايوماتريكس يمكن تقسيم إلى معلمات مثل المواد سقالة، تكوين المصفوفة خارج الخلية البروتينات (ECM)، وتصلب مصفوفة وكذلك تصميم وهيكل السقالة. كان هناك ارتفاع في دراسات هندسة الأنسجة باستخدام الهلاميات المائية الاصطناعية، خاصة بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) الهلاميات المائية 9، نظرا لقدرتها على ضبط الخصائص الميكانيكية، والنشاط الحيوي، ومعدل التدهور هيدروجيل ل. وفيما يتعلق البحوث المتعلقة الكبد، تم تطبيق هيدروجيل حيويا للدراسة عدوى فيروس مرض الكبد 3. ونتيجة لتصميم منصة الكبدية، وقد استخدمت العديد من الدراسات الكبدية الثقافات شطيرة 10،11 والتغليف خلية داخل هيدروجيل 12،13 لتوفير بيئة 3D وخلية ECM والتفاعل خلية خلية التي تعتبر ضرورية لتقليد في المكروية الجسم الحي. هاوالاصدار، هذه المنابر لا تمتلك درجة عالية من التحكم والتنظيم المكاني، مما يؤدي إلى خصائص غير موحدة من خلال منصة الاعدام 14.
والغروية وضوح الشمس مقلوب (ICC) 14 سقالة هي سقالة 3D درجة عالية من التنظيم للثقافة الخلية التي تم تقديمها لأول مرة في 2000s في وقت مبكر. ويمكن أن يعزى بنية فريدة من نوعها السقالة لعملية التصنيع بسيطة باستخدام الكريستال الغروية، وهي شعرية أمر من الجسيمات الغروية من قطر متغير. لفترة وجيزة، لتلخيص العملية، جزيئات مرتبة بدقة ومطوع باستخدام الحرارة لتشكيل شعرية. رشح هذا شعرية، عن طريق المذيبات العضوية، في النتائج هيدروجيل بلمرة في تجاويف كروية معبأة سداسي 15 مع مساحة سطح عالية. تم عرض هذه السقالة أمر غاية التي سبق مع المواد الاصطناعية والطبيعية على حد سواء، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر بولي (الأكريلاميد) 16-21، وبولي (اللبنيك المشترك، حمض الجليكوليك) 15،22-30، وبولي (جلايكول الإثيلين) 31،32، بولي (ميتاكريليت 2-هيدروكسي) 21،33-35، والشيتوزان 36-39. السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مصنوعة من مواد غير قاذورات تميل إلى تعزيز الكروية الخلوية داخل تجاويف 14،23،40. وقد ثبت أن أنواع الخلايا متعددة لتتكاثر بنجاح، تمييز وظيفة ضمن هذا التكوين، بما في ذلك غضروفية 41، خلايا انسجة نخاع العظم 42، والخلايا الجذعية 43،44. وفيما يتعلق الكبدية، وقد أجريت دراسات مع السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مصنوعة من نا 2 شافي 3 و بولي (الأكريلاميد)، ولكن ليس PEG. مع استراتيجيات bioconjugation بسيطة (أي أمين اقتران من خلال EDC / NHS)، ويمكن أن تكون ملفقة السقالات ECM البروتينات مترافق أساس PEG، التي يمكن أن تثبت مواقع الربط المزيد من الخلية لتكون أكثر في الجسم الحي مثل البيئة وتعزيز وظيفة الكبد.
في هذه المخطوطة والفيديو المرتبطة بها، ونحن بالتفصيل تصنيع السقالة للمحكمة الجنائية الدوليةباستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) هيدروجيل وشعرية البوليسترين microsphere الأمثل لسرطانة الكبد (هاه 7.5) الثقافة. ونحن لشرح الفروق بين nonadhesive عموما العارية السقالات للمحكمة الجنائية الدولية PEGDA والمغلفة الكولاجين PEGDA للمحكمة الجنائية الدولية سقالة من حيث طوبولوجيا سقالة وأداء الخلية. يتم قياس بقاء الخلية وظيفة نوعيا وكميا لتقييم سلوك الخلية هوه 7.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
والسقالات هندسة الأنسجة تتطور بسرعة لتقديم كل الاشارات الجسدية والكيميائية الحيوية اللازمة لتجديد وصيانة أو إصلاح الأنسجة لتطبيق استبدال الجهاز، ودراسة الأمراض وتطوير الأدوية، وغيرها الكثير 57. في هندسة الأنسجة الكبد وخلايا الكبد البشرية الأولية يفقد بسرعة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نود أن نعترف بدعم من مؤسسة أبحاث زمالة الوطنية (جبهة الخلاص الوطني -NRFF2011-01) وبرنامج البحوث التنافسية (جبهة الخلاص الوطني، CRP10-2012-07).
Materials
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
References
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
- Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
- Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
- Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
- Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
- Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
- Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
- Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
- Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
- Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
- Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
- Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
- Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
- da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
- da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
- Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
- Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
- Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
- Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
- Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
- Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
- Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
- Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
- Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
- Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
- Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
- Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
- Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
- Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
- Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
- Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
- Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
- Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
- Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
- Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
- Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
- Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
- Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
- Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
- Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
- Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
- Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
- Ferreira, T., Rasband, W. . ImageJ User Guide. , (2012).
- JoVE Science Education Database. . General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , (2015).
- Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
- JoVE Science Education Database. . General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , (2015).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , (2015).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
- JoVE Science Education Database. . Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , (2016).
- JoVE Science Education. . Essentials of Environmental Microbiology. , (2015).
- Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering–current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
- Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
- Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
- Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
- Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
- Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
- Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).
