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Bioengineering

उल्टे कोलाइडयन क्रिस्टल पाली (ethylene glycol) पाड़ के निर्माण: जिगर ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक तीन आयामी सेल संस्कृति मंच

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54331
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

, Xenobiotics 'cytotoxicity के परीक्षण के वायरस के संक्रमण का अध्ययन और जिगर पर लक्षित दवाओं को विकसित करने के उद्देश्य के लिए इन विट्रो में hepatocyte समारोह को बनाए रखने की क्षमता है, एक मंच है जो कोशिकाओं में उचित जैव रासायनिक और यांत्रिक संकेतों प्राप्त की आवश्यकता है। हाल जिगर ऊतक इंजीनियरिंग सिस्टम कृत्रिम या प्राकृतिक हाइड्रोजेल से बना तीन आयामी (3 डी) scaffolds कार्यरत है, उनके उच्च पानी प्रतिधारण और कोशिकाओं द्वारा की जरूरत यांत्रिक उत्तेजनाओं प्रदान करने की क्षमता को देखते हुए। वहाँ उल्टे कोलाइडयन क्रिस्टल (आईसीसी) पाड़ में बढ़ती रुचि रही है, हाल ही में एक विकास है, जो उच्च स्थानिक संगठन, homotypic और heterotypic सेल बातचीत, साथ ही सेल-बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) बातचीत की अनुमति देता है। इस के साथ साथ, हम पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) diacrylate (PEGDA) और कण लीचिंग विधि का उपयोग आईसीसी पाड़ निर्माण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। संक्षेप में, एक जाली microsphere कणों से बना है, जो एक पूर्व polyme के बादआर समाधान जोड़ा जाता है, ठीक से polymerized, और कणों तो हटा रहे हैं, या leached, एक कार्बनिक विलायक (जैसे, tetrahydrofuran) का उपयोग। नियंत्रित ताकना आकार और interconnectivities है कि मीडिया और अधिक आसानी से कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के साथ एक बेहद असुरक्षित पाड़ में जाली परिणाम के विघटन। इस अनूठी संरचना कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से pores के बीच आसानी से संचार, और कोट करने की क्षमता प्रोटीन के साथ PEGDA आईसीसी पाड़ भी सेल के प्रदर्शन पर एक उल्लेखनीय प्रभाव को दर्शाता है का पालन करने के लिए उच्च सतह क्षेत्र की अनुमति देता है। हम व्यवहार्यता के संदर्भ में पाड़ की आकृति विज्ञान के साथ ही हिपेटोकार्सिनोमा सेल (हं-7.5) व्यवहार का विश्लेषण और आईसीसी संरचना और ईसीएम कोटिंग्स के प्रभाव का पता लगाने के लिए कार्य करते हैं। कुल मिलाकर, इस पत्र में एक उभरती हुई पाड़ कि ऊतक इंजीनियरिंग में विस्तृत आवेदन पत्र, विशेष रूप से जिगर ऊतक इंजीनियरिंग की है की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Introduction

जिगर कार्यों की एक भीड़, खून की विषहरण, xenobiotics की चयापचय, और सीरम प्रोटीन के उत्पादन सहित के साथ एक उच्च vascularized अंग है। जिगर ऊतक अनेक प्रकार की कोशिकाओं, पित्त canaliculi, sinusoids, और विभिन्न biomatrix संरचना और विभिन्न ऑक्सीजन सांद्रता के क्षेत्रों के शामिल है, एक जटिल तीन आयामी (3 डी) microstructure है। इस विस्तृत संरचना को देखते हुए यह मुश्किल हो गया है इन विट्रो 1 में एक उचित जिगर मॉडल बनाने के लिए। हालांकि, वहाँ इन विट्रो मॉडल में कार्यात्मक परीक्षण दवा विषाक्तता 2 के लिए प्लेटफॉर्म के रूप में मानव hepatocytes होस्टिंग और जिगर 3 के साथ जुड़े रोगों के अध्ययन के लिए एक बढ़ती मांग है।

वर्तमान जिगर ऊतक इंजीनियरिंग प्लेटफॉर्म एक अलग-थलग, या Zona की, जैव रासायनिक संरचना में कुछ पर ध्यान केंद्रित कर, जिगर के मापदंडों के, 4 कोशिकाओं का अर्थात् सह संस्कृति से जिगर की जटिलता को सरल बना दियाएल microenvironments 5, प्रवाह की गतिशीलता 6,7 और 8 biomatrix के विन्यास। biomatrix का विन्यास ऐसी पाड़ सामग्री, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन की संरचना, मैट्रिक्स कठोरता के रूप में अच्छी तरह से डिजाइन और पाड़ की संरचना के रूप में मानकों में तोड़ा जा सकता है। वहाँ सिंथेटिक हाइड्रोजेल, विशेष रूप से पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) 9 हाइड्रोजेल का उपयोग ऊतक इंजीनियरिंग की पढ़ाई में वृद्धि की गई है, धुन हाइड्रोजेल के यांत्रिक गुणों, bioactivity, और गिरावट की दर की क्षमता दी। जिगर से संबंधित अनुसंधान के बारे में, biocompatible हाइड्रोजेल जिगर की बीमारी के 3 वायरस के संक्रमण के अध्ययन के लिए लागू किया गया था। एक hepatocyte मंच डिजाइन के रूप में, कई अध्ययनों 3 डी वातावरण और सेल ईसीएम और सेल सेल बातचीत जो विवो microenvironment में नकल करने के लिए आवश्यक हैं प्रदान करने के लिए एक हाइड्रोजेल 12,13 भीतर hepatocyte सैंडविच संस्कृतियों 10,11 और सेल encapsulation उपयोग किया है। होवेदेखें, इन प्लेटफार्मों नियंत्रण और स्थानिक संगठन के एक उच्च डिग्री के पास नहीं है, पाड़ 14 के माध्यम से गैर वर्दी गुण के लिए अग्रणी।

उल्टे क्रिस्टल कोलाइडयन (आईसीसी) 14 पाड़ सेल संस्कृति है कि पहली बार 2000 के दशक में शुरू किया गया था के लिए एक उच्च स्तरीय आयोजन 3 डी पाड़ है। पाड़ की अनोखी संरचना सरल निर्माण की प्रक्रिया एक कोलाइडयन क्रिस्टल, चर व्यास के कोलाइडयन कण के एक आदेश जाली का उपयोग करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। संक्षेप में, इस प्रक्रिया को संक्षेप में प्रस्तुत करने, कण बड़े करीने से व्यवस्था और गर्मी का उपयोग कर एक जाली फार्म annealed रहे हैं। इस जाली के leaching, एक कार्बनिक विलायक से, उच्च सतह क्षेत्र के साथ hexagonally पैक गोलाकार गुहाओं 15 में एक polymerized हाइड्रोजेल परिणामों में। यह बेहद आदेश दिया पाड़ पहले दोनों कृत्रिम और प्राकृतिक सामग्री के साथ बनाया गया है, लेकिन सहित नहीं (एक्रिलामाइड) 16-21, पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) 15,22-30 पाली तक सीमित, पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) 31,32, पाली (2-hydroxyethyl methacrylate) 21,33-35, और chitosan 36-39। आईसीसी गैर-दूषण सामग्री के बने मचान गुहाओं 14,23,40 भीतर सेलुलर spheroids को बढ़ावा देने के लिए करते हैं। अनेक प्रकार की कोशिकाओं को सफलतापूर्वक पैदा करने के लिए इस विन्यास के भीतर अंतर और समारोह, chondrocytes 41, अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं 42 सहित, और स्टेम कोशिकाओं 43,44 दिखाया गया है। Hepatocyte के बारे में, पढ़ाई के ना 2 SiO 3 और पाली (एक्रिलामाइड) के बने आईसीसी scaffolds, लेकिन नहीं खूंटी के साथ आयोजित किया गया है। सरल bioconjugation रणनीति के साथ (यानी, ईडीसी / एन एच एस के माध्यम से अमाइन युग्मन), ईसीएम प्रोटीन संयुग्मित खूंटी-आधारित scaffolds, गढ़े जा सकता है कि और अधिक सेल बाध्यकारी साइटों साबित हो सकता है पर्यावरण की तरह विवो में एक और अधिक हो सकता है और यकृत समारोह में वृद्धि करने के लिए।

इस पांडुलिपि और जुड़े वीडियो में, विस्तार आईसीसी पाड़ के निर्माण हमपाली (एथिलीन ग्लाइकोल) diacrylate (PEGDA) हाइड्रोजेल और एक polystyrene microsphere जाली, हिपेटोकार्सिनोमा के लिए अनुकूलित (ना-7.5) संस्कृति का उपयोग कर। हम पाड़ टोपोलॉजी और सेल प्रदर्शन के मामले में आम तौर पर nonadhesive नंगे PEGDA आईसीसी scaffolds और कोलेजन लेपित PEGDA आईसीसी पाड़ के बीच मतभेदों को प्रदर्शित करता है। सेल व्यवहार्यता और समारोह हं-7.5 सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक मापा जाता है।

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Protocol

1. आईसीसी पाड़ निर्माण (चित्रा 1)

  1. polystyrene (पी एस) lattices (; मोतियों की 8-13 परतों व्यास = 6 मिमी) तैयार करें।
    1. मोल्ड तैयार करने के लिए, 40 μl स्तर पर 0.2 मिलीग्राम फोड़ा प्रूफ microcentrifuge ट्यूब से बंद सुझावों काटा। 24 x 60 मिमी 2 माइक्रोस्कोप पानी के सबूत गोंद के साथ कांच कवर फिसल जाता है के लिए कट-ट्यूब के शीर्ष पालन करें।
    2. पुनश्च क्षेत्रों (व्यास = 140 माइक्रोन) एक 20 मिलीलीटर की शीशी में एक पानी निलंबन के भीतर निहित रखो, ध्यान से पानी निलंबन बाहर पिपेट, और शीशी में से 18 मिलीलीटर 70% इथेनॉल समाधान जोड़ें। एकत्रित क्षेत्रों ढीला करने के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में क्षेत्र के समाधान रखो। पूरी तरह से पानी और पानी में घुलनशील घटक को दूर करने के क्रम में इस धोने कदम कई बार दोहराएँ।
    3. सांचों में इथेनॉल के 100 μl पिपेट।
    4. 4 मिमी से एक 200 μl micropipette टिप के शीर्ष कट। पिपेट 25 ढालना दो बार 200 μl micropipette का उपयोग कर एक को प्राप्त करने में क्षेत्रों के μlप्रत्येक सांचे में 50 μl की कुल मात्रा।
    5. 120 आरपीएम रात भर में एक कमाल प्रकार के बरतन पर नए नए साँचे रखें।
    6. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक सांचे में क्षेत्रों की व्यवस्था की जाँच करें। क्षेत्रों hexagonally आदेश नहीं कर रहे हैं, तो 70% इथेनॉल के 50 μl जोड़ें और व्यवस्था को सही करने के अनुदैर्ध्य और पार्श्व अक्ष दिशा में मैन्युअल हिला।
    7. दो रातों के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में इथेनॉल लुप्त हो जाना। पुनश्च मोती पानी रखना करने के लिए 6 घंटे के लिए मोल्ड और एक 130 डिग्री सेल्सियस भट्ठी में मनका जटिल रखें।
  2. नंगे और ईसीएम लेपित PEGDA मचानों की तैयारी।
    1. (डब्ल्यू = 4.6 केडीए एम) रैखिक खूंटी macromers acrylating के लिए स्थापित प्रोटोकॉल 45,46 का उपयोग कर PEGDA macromers synthesize।
    2. 50% (w / v) de-ionized (डीआई) पानी में PEGDA समाधान तैयार है और macromer ठीक से 4,713 XG पर centrifuging जब तक यह पूरी तरह से भंग कर रहा है द्वारा भंग करने के लिए अनुमति देते हैं।
      1. ईसीएम संयुग्मित आईसीसी scaffolds के लिए, एक अतिरिक्त भंग10% (w / v) Acryloyl खूंटी एनएचएस (एम डब्ल्यू = 3.4 केडीए) 50% PEGDA समाधान में।
    3. एक 20% तैयार (डब्ल्यू / वी) 2-हाइड्रोक्सी 4 की 'शेयर समाधान - 70% इथेनॉल में (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone (पीआई)।
    4. 20% (डब्ल्यू / वी) 50% से 1 मिलीलीटर प्रति पीआई शेयर समाधान के 50 μl जोड़ें (w / v) PEGDA की। PEGDA की आणविक वजन के आधार पर पीआई स्टॉक समाधान की जरूरत राशि को समायोजित करें।
    5. भंवर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब में मिश्रण एक समरूप समाधान तक पहुँचने के लिए।
    6. पील गिलास स्लाइड (कदम 1.1.7 से) से नए नए साँचे, नए नए साँचे से गोंद निकालने ध्यान से एक रंग का उपयोग lattices बाहर धक्का और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में उनमें से प्रत्येक जगह है। 5 मिनट के लिए 845 XG पर PEGDA समाधान और सेंट्रीफ्यूज की पिपेट 300 μl जाली में उचित समाधान PEGDA घुसपैठ की अनुमति है।
    7. चिमटी का उपयोग कर ट्यूब से जाली निकालें और ध्यान दस्ताने पर सूखी अतिरिक्त PEGDA समाधान दाग। एक आयल फिल्म से ढके कांच पर जाली फ्लैट CIR साथ रखेंcular सतह का सामना करना पड़।
    8. एक स्पॉट यूवी लैंप का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 365 एनएम पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश (10.84 मेगावाट / 2 सेमी) के लिए PEGDA समाधान घुसपैठ पाड़ बेनकाब।
    9. और tetrahydrofuran के 20 मिलीलीटर जोड़ने (THF) (शीशी प्रति 10 lattices के आसपास) की जगह नया शीशियों में PEGDA-polymerized क्रिस्टल lattices। 300 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर शीशियों हिला। 1-2 घंटा के अंतराल के साथ THF बदले कम से कम 3 बार।
      नोट: पूरी तरह से THF दूर नहीं है जब आदेश scaffolds, जो बारी में पीएस की अधूरी हटाने का कारण बन सकती में प्रवेश करने से रोकने के लिए बुलबुले में THF बदल रहा है। lattices कवर और नए THF जोड़ने के लिए पर्याप्त समाधान छोड़ दें।
      सावधानी: THF विषैला होता है। दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट और काले चश्मे पहनें। धूआं हुड के तहत काम से साँस लेना बचें।
    10. चेक पी एस क्षेत्रों में इस्तेमाल किया THF समाधान में पानी डालने और समाधान रंग देख कर भंग कर रहे हैं। दोहराएँ कदम 1.2.9 यदि पीएस क्षेत्रों ठीक से भंग नहीं कर रहे हैं।
      नोट: समाधान रंग के लिए बदल जाएगासफेद अगर वहाँ किसी भी शेष पी एस क्षेत्रों रहे हैं।
  3. जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में scaffolds साफ करें।
    1. scaffolds बाँझ करने के लिए, पाड़ प्रति 70% इथेनॉल के 2 मिलीलीटर के साथ एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार है और एक रंग का उपयोग ट्यूब में scaffolds जगह है। scaffolds के 1 घंटे के लिए इथेनॉल में सोख करने की अनुमति दें। इस कदम से आगे, बीएससी में सभी प्रक्रियाओं का संचालन।
    2. ध्यान से इथेनॉल उंडेल और 3 मिनट के बुलबुले को दूर करने के लिए 524 XG पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (पाड़ प्रति 2 मिलीलीटर) और सेंट्रीफ्यूज के साथ बदलें। यह फ्रिज में रखें और 1-2 घंटा के अंतराल के साथ पीबीएस एक बार कुछ बदल जाते हैं।
      1. कोलेजन प्रकार के लिए मैं लेपित scaffolds, एक और 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज कोलेजन टाइप 1 शेयर समाधान युक्त ट्यूब (पाड़ प्रति 1 मिलीलीटर) तैयार निष्फल scaffolds 3 मिनट के लिए 524 XG पर एक रंग के, और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर इस ट्यूब को हस्तांतरण। 30 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 400 rpm पर मचान हिला और refrigerat में ट्यूब रखेंया रात।
      2. ताजा पीबीएस में scaffolds जलमग्न और फिर पीबीएस aspirating द्वारा दो बार उपयोग करने से पहले पीबीएस के साथ scaffolds धो लें।
        नोट: अन्य ईसीएम प्रोटीन भी मैं कोलेजन प्रकार के बजाय प्रयोग किया जा सकता है क्योंकि एनएचएस रसायन विज्ञान बांड (चित्रा 2) के रूप में एक amine समूह की आवश्यकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. आईसीसी निर्माण का अवलोकन। खूंटी-आधारित आईसीसी scaffolds के साथ और बिना ईसीएम-functionalization microfabrication तकनीक का उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं। ईसीएम लेपित आईसीसी scaffolds खूंटी एनएचएस के साथ ही PEGDA (चित्रा 2 में विस्तृत रूप में) की आवश्यकता होती है। पुनश्च जाली 6 मिमी की एक व्यास और 8-13 मनका परतों की ऊंचाई है। पुनश्च, polystyrene; PEGDA, पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) diacrylate; यूवी, पराबैंगनी; THF, tetrahydrofuran; ईसीएम, बाह्य मैट्रिक्स। यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और वाई से अनुमति के साथ इस्तेमाल कियाLey 47। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. आईसीसी संरचना विशेषता

  1. के साथ या बिना संयुग्मित प्रोटीन आईसीसी संरचना का विश्लेषण करने के लिए, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) 47 का उपयोग करें।
    1. 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ scaffolds फिक्स, क्रमानुसार उन्हें 25, 50, 75, 95 और 100% इथेनॉल समाधान में निर्जलीकरण, और जब तक पूरी तरह से इथेनॉल evaporates -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।
    2. 48 घंटे के लिए एक फ्रीज सुखाने की मशीन में सूखी नमूने हैं।
    3. एक धूम coater में कार्बन टेप और जगह का उपयोग नमूना धारक पर नमूना प्रत्यय।
    4. स्वत: सफाई के बाद, 20 मा पर 60 सेकंड के लिए sputtering द्वारा 10 एनएम मोटाई की एक फिल्म के साथ पं कोट इसे।
    5. छवि आईसीसी 5 केवी (चित्रा 3 ए, चित्रा -4 ए) के एक वोल्टेज पर SEM का उपयोग scaffolds।
  2. ताकना को मापने के लिए औरगुहाओं की एक दूसरे का संबंध व्यास, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 48 (चित्रा 3 बी, सी जैसे, ImageJ) का उपयोग SEM micrographs का विश्लेषण।
  3. कोशिकाओं के बिना पाड़ संयुग्मित कोलेजन, fluorescently टैग कल्पना करने के लिए कोलेजन एंटीबॉडी (1: 100) का उपयोग कोलेजन प्रकार मैं और confocal माइक्रोस्कोपी लेजर स्कैनिंग 47 के साथ छवि के खिलाफ (CLSM, चित्रा 4 बी)।

3. हं-7.5 सेल संस्कृति और सीडिंग

  1. 10 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक और 100 यू / मिलीलीटर के साथ 2-2.5 x 10 6 कोशिकाओं / 100 मिमी सेल संस्कृति बर्तन में मिलीलीटर की एक बोने घनत्व पर संस्कृति हं 7.5 कोशिकाओं पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (विकास मीडिया) 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2. बदलें मीडिया बीएससी में हर तीन दिन तक वे 75-80% confluency पर पहुंच गया है।
  2. बीएससी में सेल बोने के लिए scaffolds तैयार करें।
    1. ध्यान से Scaff जगहफ्लैट सतह के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में बच्चों सामना करना पड़ रहा।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से एक पाड़ युक्त करने के लिए चबूतरा, पिपेट 2 मिलीलीटर पीबीएस धोने के लिए। पीबीएस और पिपेट 2 मिलीलीटर प्रत्येक कुएं में ताजा पीबीएस aspirate।
    3. पीबीएस और पिपेट 2 विकास मीडिया की मिलीलीटर महाप्राण (3.1 कदम देखें) और 30 मिनट के लिए छोड़ दें। मीडिया Aspirate और पाड़ 1 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
  3. बीएससी में संस्कृति की थाली trypsin पाचन विधि का उपयोग करने से (3.1 कदम से) मिला हुआ हं 7.5 कोशिकाओं को अलग करें।
    1. थाली से महाप्राण मीडिया, पक्षपाती कोशिकाओं को धोने के लिए 4 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने और फिर पीबीएस aspirate।
    2. पिपेट 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.75-1 मिलीलीटर 0.25% trypsin और जगह एक मशीन में, 5% 3 मिनट के लिए सीओ 2।
    3. इनक्यूबेटर और पिपेट से थाली निकालें 5 मिलीलीटर मीडिया trypsin प्रतिक्रिया को रोकने के। पिपेट मीडिया, अलग कोशिकाओं, और trypsin मिश्रण एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में।
    4. 3 मिनट के लिए 524 XG पर अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला निकालें और 5 मिलीलीटर मीडिया में गोली resuspend।
  4. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और सेल निलंबन लक्ष्य संख्या, एन 0 पर सेल शामिल है कि की मात्रा की गणना, 25 μl प्रति (मानक प्रयोग के लिए, एन 0 1 x 10 6 कोशिकाओं है)।
    सेल निलंबन का आयतन = (कोशिकाओं के लक्ष्य की संख्या) / (सेल निलंबन की एकाग्रता)
  5. धीरे-धीरे सेल निलंबन (युक्त एन 0 कोशिकाओं) सीधे एक पाड़ (कदम 3.1.4 से) के शीर्ष पर 25 μl विंदुक। इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
  6. 12 घंटे के बाद, scaffolds ध्यान से एक रंग के उपयोग के साथ एक नया 24 अच्छी तरह से थाली और पिपेट में मीडिया के 2 मिलीलीटर प्रत्येक कुएं में हस्तांतरण। इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
  7. मीडिया बदलें हर 3 दिन या जब मीडिया प्रोटीन का स्राव विश्लेषण (5.1 कदम देखें) के लिए एकत्र किया जाता है पर निर्भर करता है।

4. सेल व्यवहार्यता

  1. गुणात्मक सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए, कोशिकाओं और छवि सी का उपयोग दाग फ्लोरोसेंट लाइव / मृत धुंधला किट का उपयोगएल एस एम।
    1. किट के निर्देश के बाद, के साथ 4 माइक्रोन के calcein AM और 8 माइक्रोन के ethidium होमो-डिमर -1 मीडिया में एक समाधान तैयार (कदम 3.1.3 देखें)।
      नोट: सेल नंबर के आधार पर अनुकूलन। अभिकर्मक की दोहरी राशि का उपयोग करें यदि कोशिकाओं को पैदा करना और संख्या में डबल (2 लाख के आसपास)।
    2. बीएससी में, अच्छी तरह से एक पाड़ (3.7 चरण) और पिपेट तैयार समाधान के 500 μl के साथ प्रत्येक में महाप्राण मीडिया। 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नमूने सेते हैं।
    3. पन्नी में प्लेटें कवर जब इनक्यूबेटर से बाहर थाली हटाने प्रकाश से नमूनों की रक्षा के लिए। छवि CLSM49 का उपयोग कर नमूने हैं।
  2. मात्रात्मक सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, enzymatic गतिविधि को मापने (जीवित कोशिकाओं में) वर्णमिति assays 50 का उपयोग कर (यानी, 2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3 (4-nitrophenyl) -5 (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium (मोनोसोडियम नमक अभिकर्मक))।
    1. आईसीसी मंच के लिए एक मानक वक्र (यानी, absorbance (ओवर ड्राफ्ट) वी के एक ग्राफ बनाएंErsus सेल नंबर दिया)।
      नोट: सेल बोने नहीं 100% अन्य प्लेटफार्मों की तुलना में कुशल है, क्योंकि कोशिकाओं मचानों की गुहाओं के माध्यम से पारित कर सकते हैं।
      1. सेल बोने नंबर, एन 0 कि मानक वक्र बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा निर्धारित करते हैं।
        नोट: एक सीमा है कि सेल नंबर है कि प्रयोग में शामिल होने का अनुमान है चुनें। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक सेल नंबर 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं है और एक अनुमान के अनुसार प्रयोग के अंतिम दिन से ~ 3 गुना वृद्धि हुई है, का चयन 2.5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 एक्स 10 6, और 2 एक्स अगर वहाँ एन 0 के रूप में 10 6 कोशिकाओं।
      2. आईसीसी scaffolds (एक एन 25 μl के बोने की मात्रा के साथ पाड़ प्रति 0) कदम 3.1-3.6 में वर्णित के रूप में सेल बोने प्रदर्शन करना।
      3. 6 घंटे के बाद, अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए scaffolds हस्तांतरण। एक समय था कि सेल पालन की अनुमति देता है, लेकिन प्रसार सेल नहीं का चयन करें।
      4. स्थानांतरित कर आईसीसी पाड़ पर सेल गिनती प्रदर्शन करना।
        1. पतला 10x मोनोसोडियम नमक अभिकर्मक (MSR) समाधान के लिए एक पाड़ के साथ प्रत्येक कुएं में बीएससी और पिपेट 500 μl 1x एमएसआर समाधान में मीडिया के साथ 1x करने के लिए। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी तरह से थाली सेते हैं।
        2. प्रत्येक अच्छी तरह से, अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में 100 μl हस्तांतरण। एक खाली, पिपेट 96 अच्छी तरह से थाली पर अलग कुओं में ताजा 1x मोनोसोडियम नमक अभिकर्मक समाधान के 100 μl के रूप में। मैन्युअल किसी भी बुलबुले मौजूद एक सूखी विंदुक टिप का उपयोग प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में हटाने और 96 अच्छी तरह से थाली को कवर किया।
        3. λ = 450 एनएम पर उपाय आयुध डिपो एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर पढ़ रहे हैं। अन्य मूल्यों से खाली आयुध डिपो घटाएँ सटीक आयुध डिपो 51 खोजने के लिए।
      5. कोशिकाओं की संख्या (एन एल) पाड़ (कदम 4.2.1.3) एक hemocytometer का उपयोग स्थानांतरित होने के बाद अच्छी तरह से शेष गणना।
        नोट: कोशिकाओं trypsinize को trypsin के 300 μl का प्रयोग करें।
      6. वास्तविक सेल नंबर, एन ए की गणना।
        वास्तविक =प्रारंभिक - में छोड़ दिया अच्छी तरह से
        एन ए = एन 0 एन एल
      7. चरण 4.2.1.4.3 बनाम वास्तविक सेल नंबर (एन ए) में प्राप्त आयुध डिपो की साजिश रचने के मानक वक्र बनाने के लिए और इस का उपयोग प्रयोगों में सेल नंबर का अनुमान है।
        नोट: एक नए मानक वक्र बनाने के किसी भी अगर आईसीसी मानकों (यानी, porogen आकार, पाड़ के आयामों, ईसीएम प्रोटीन, आदि) बदल रहे हैं।

5. सेल समारोह

  1. एंजाइम द्वारा (कदम 3.7 से) एकत्र मीडिया से हं 7.5 कोशिकाओं (यानी, एल्बुमिन, यूरिया) द्वारा प्रोटीन का स्राव का विश्लेषण करें immunosorbent परख (एलिसा) 52 जुड़ा हुआ है।
    नोट: मीडिया पतला, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या और एकत्र मीडिया की मात्रा पर निर्भर करता है। 25 अनुपात, एंटीबॉडी प्रीकोटेड कुओं के लिए यह शुरू करने से पहले: 5 x 10 5 कोशिकाओं आईसीसी में वरीयता प्राप्त के लिए, एक ~ 1 का उपयोग करें।
  2. गुणात्मक सेल समारोह का विश्लेषण करने के लिए, विशिष्ट intracellular प्रोटीन immunostain(यानी, एल्बुमिन), एंजाइम (यानी, CYP450), दाग संरचनात्मक घटकों (यानी, सेलुलर actin) के साथ ही नाभिक और छवि CLSM 49 का उपयोग कर।
    1. और पिपेट 2 मिलीलीटर पीबीएस (3.7 चरण से) महाप्राण मीडिया सेल से लदी आईसीसी scaffolds धोने के लिए।
    2. पिपेट 4% पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर और निर्धारण के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो 3x।
    4. 30 मिनट के लिए 0.1% 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) फिनाइल-पॉलीथीन ग्लाइकोल (surfactant) के 1 मिलीलीटर में scaffolds incubating द्वारा झिल्ली permeabilize।
    5. 2 के साथ धो 3x एमएल पीबीएस किसी भी लीक प्रोटीन को हटाने के लिए।
    6. पिपेट 500 μl 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के लिए 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
    7. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, एल्बुमिन, CYP450) समाधान तैयार है।
      1. पिपेट एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 1% बीएसए समाधान के 500 μl और 4.5 मिलीलीटर 0.1% की surfactant समाधान जोड़ने के कुल 0.1% की 5 मिलीलीटर बीएसए समाधान तैयार करने के लिए।
      2. पिपेट एक 200 μl microcentrifuge ट्यूब में 0.1% BSA समाधान के 98 μl और प्राथमिक एंटीबॉडी एक 1:50 का उत्पादन करने के 2 μl (प्राथमिक एंटीबॉडी: 0.1% बीएसए) प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान।
    8. पाड़ पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के पिपेट 40 μl और आयल फिल्म के साथ सब्सट्रेट को कवर किया। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 24 अच्छी तरह से थाली लपेटें और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर पकवान की दुकान।
    9. 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो 3x और कपड़े धोने के बीच में धीरे थाली हिला।
    10. पतला biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी (यानी, विरोधी माउस एंटीबॉडी) शेयर समाधान तैयार है।
      1. 100 (माध्यमिक एंटीबॉडी: 0.1% बीएसए) माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान पिपेट 198 μl 0.1% BSA समाधान और 2 μl दूसरी एंटीबॉडी एक 1 निर्माण करने के लिए।
      2. 0.1% बीएसए समाधान में rhodamine या fluorescein लेबल phalloidin (सेलुलर एक्टिन तंतु दाग) के एक 0.1% शेयर समाधान तैयार है।
      3. पिपेट एक ट्यूब में और w मिश्रण प्रत्येक समाधान के 25 μlपक्ष।
    11. पिपेट पाड़ पर माध्यमिक एंटीबॉडी शेयर समाधान के 50 μl। आयल फिल्म के साथ पाड़ कवर, 2 घंटे के लिए आरटी पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ पकवान लपेटो।
    12. 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो 3x।
    13. पिपेट 0.2% 4'-6-diamidino-2-phenylindole के 200 μl (DAPI, एक नाभिक दाग) पाड़ पर समाधान और 2-3 मिनट के लिए आरटी पर रहते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट कवर।
    14. 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो 2x।
    15. एक dropper का उपयोग करना, सब्सट्रेट पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद जगह है।
    16. ध्यान से एक गिलास स्लाइड और छवि CLSM 47 के प्रयोग पर पाड़ डाल दिया।
  3. वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा जीन अभिव्यक्ति का आकलन करें। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर (आरटी पीसीआर) 53 और 54 qPCR निर्माता के निर्देशों के अनुसार के लिए मानक किट का प्रयोग करें। कोशिकाओं से शाही सेना निकालने के रूप में नीचे वर्णित है।
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में (कदम 3.7 से) पाड़ रखें।
    2. प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में क्लोरोफॉर्म के 200 μl पिपेट और 15-20 सेकंड के लिए हाथ में सख्ती ट्यूब हिला। जब तक चरणों को अलग ~ 3 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों रखें।
    3. 13,000 XG, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र और इतना है कि चरणों मिश्रण नहीं है ध्यान नलियों को हटा दें।
    4. ध्यान से एक दूसरे microcentrifuge ट्यूब में पहली ट्यूब से ऊपरी जलीय चरण के 500-600 μl विंदुक।
    5. isopropanol के एक बराबर मात्रा (500-600 μl) इस दूसरे ट्यूब में जोड़े।
    6. ट्यूब पलटना 3-5 बार और ट्यूब 10 मिनट के लिए आरटी पर खड़े छोड़ दें।
    7. 13,000 XG, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र।
      1. एक गोली नहीं दिखाई ट्यूब, सेंट्रीफ्यूज के तल पर 5 मिनट के लिए फिर से है।
        नोट: यदि फिर भी कोई दिखाई गोली है, शाही सेना की राशि अपर्याप्त हो सकती है।
    8. मैंटोपी 1 मिलीलीटर 70% इथेनॉल ट्यूब में DEPC पानी में पतला में सतह पर तैरनेवाला और पिपेट त्यागने के लिए खोलने के साथ nvert ट्यूबों।
    9. थोड़ा ट्यूब भंवर इसलिए गोली ट्यूब की दीवार से खिसकाते और फिर ट्यूब शुष्क हवा।
    10. गोली resuspend DPEC पानी की 50 μl जोड़ें।
    11. गोली घुल जब तक pipetting रखें।
    12. आदेश में एकल असहाय शाही सेना में डबल असहाय शाही सेना denature करने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रखें।
    13. हल्के ट्यूब तल पर उंगलियों के ड्रम और फिर नलियों संक्षेप में अपकेंद्रित्र (7500 XG, 4 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस)।
    14. 56 में वर्णित के रूप में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 55 और वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन जब तक बर्फ में ट्यूबों रखें।

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Representative Results

आईसीसी पाड़ की संरचनात्मक लक्षण और hepatocytes संवर्धन में प्रत्येक आईसीसी पाड़ हालत की प्रभावकारिता की तुलना के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है और नीचे की व्याख्या कर रहे हैं। आईसीसी पाड़ इन परिणामों में इस्तेमाल की स्थिति 0 माइक्रोग्राम / एमएल (नंगे), 20 माइक्रोग्राम / एमएल (कोलेजन 20), 200 माइक्रोग्राम / एमएल (कोलेजन 200), और 400 माइक्रोग्राम / एमएल (कोलेजन 400) और प्रारंभिक के कोलेजन कोटिंग्स हैं हं-7.5 सेल बोने नंबर 1x10 6 है।

आईसीसी ताकना interconnections और पाड़ टोपोलॉजी की विशेषता।

SEM इमेजिंग, आईसीसी scaffolds के निर्धारण और फ्रीज सुखाने के बाद, पहले यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आईसीसी pores के बीच उचित अंतर सम्बन्ध का गठन किया गया और पाड़ टोपोलॉजी पर विविध कोलेजन सांद्रता के विकार का प्रभाव देखने के लिए इस्तेमाल किया गया था। दो-डी के मात्रात्मक विश्लेषणimensional नंगे आईसीसी SEM छवियों (चित्रा 3 ए) ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, 102.3 ± 9.3 माइक्रोन के एक औसत ताकना व्यास और 38.6 ± 4.3 माइक्रोन के एक औसत एक दूसरे का संबंध व्यास (चित्रा 3 बी, सी) का पता चला। pores के बीच यह एक दूसरे का संबंध एक महत्वपूर्ण कोशिकाओं को पोषक तत्वों की समुचित प्रसार में पाड़ भर सेल सेल बातचीत भूमिका के रूप में अच्छी तरह से खेलता है। कोलेजन की कोटिंग एक फाइबर जाल नेटवर्क है कि अधिक कोलेजन विकार (चित्रा 4 ए) की उच्च सांद्रता में परिभाषित किया गया था में हुई। Confocal छवियों कोलेजन एकाग्रता (चित्रा 4 बी) में वृद्धि के साथ पर गुहा सतहों कोलेजन और उच्च सतह क्षेत्र कवरेज की भी परतें प्रकट करते हैं।

हं-7.5 सेल व्यवहार्यता और समारोह पर आईसीसी मंच की स्थिति का प्रभाव।

हं 7.5 कोशिकाओं फ्लोरोसेंट लाइव / मृत दाग के अधीन थेपरख (4 माइक्रोन के calcein AM और 8 माइक्रोन के EthD -1) आईएनजी और CLSM का उपयोग imaged, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है। नंगे, गैर चिपकने वाला आईसीसी scaffolds में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के बीच ताकना और सेल सेल एक दूसरे का संबंध के केंद्र में कुल करने की प्रवृत्ति pores बाद के समय (दिन 7 और 10) में देखा गया था। आईसीसी मचानों पर एक कोलेजन कोटिंग की उपस्थिति कोशिकाओं पाड़ सतह के रूप में अच्छी तरह से एक अंतर-ताकना सेल सेल बातचीत के रूप में शुरुआती दिन 1. सेल व्यवहार्यता के रूप में पालन करने के लिए अनुमति दी है, हरे रंग के दाग ने संकेत दिया है, समय के साथ वृद्धि हुई है और आम तौर पर अधिक था कोलेजन लेपित scaffolds में, के रूप में उच्च हरी प्रतिदीप्ति ने संकेत दिया। चित्रा 6 सेल व्यवहार्यता पर आईसीसी 3 डी संरचना और प्रोटीन एकाग्रता के प्रभाव के आगे की जांच के लिए मात्रात्मक एमएसआर परिणाम दिखाता है। एक वर्णमिति सेल व्यवहार्यता परख आईसीसी पाड़ की स्थिति में के रूप में अच्छी तरह से एक 2 डी polystyrene संस्कृति की थाली और absorbance डेटा (450 एनएम पर मापा जाता है) पर संवर्धित कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया था करने के लिए टी सामान्यीकृत थावह नियंत्रण दिवस (1)। 2 डी प्लेटों पर संवर्धित कोशिकाओं सेल व्यवहार्यता बनाए रखा लेकिन सेल प्रसार में कोई वृद्धि मनाया गया। 3 डी नंगे आईसीसी पाड़ बहुत 2 डी हालत की तुलना में सेल प्रसार बढ़ाया, 3 डी मैट्रिक्स के महत्व को दर्शाता है। कोलेजन कोटिंग के अलावा के साथ, सेल प्रसार डे 14. पर सभी कोलेजन सांद्रता में समय के साथ वृद्धि हुई है और 200 माइक्रोग्राम / एमएल लेपित आईसीसी पाड़ में अधिकतम प्रसार मिला था इस चित्रा 5 में गुणात्मक टिप्पणियों की पुष्टि करता है।

Hepatocyte समारोह एल्बुमिन स्राव में परिवर्तन के रूप में अच्छी तरह से अलग आईसीसी पाड़ की स्थिति में तीन आसंजन प्रोटीन के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल निगरानी के द्वारा मूल्यांकन किया गया था। चित्रा 7, स्रावित सीरम albumin के बीच सकारात्मक संबंध दिखाता है के रूप में एलिसा एल्बुमिन द्वारा मात्रा, और कोलेजन एकाग्रता संयुग्मित पाड़। 14 दिन पर, हं 7.5 कोशिकाओं में सुसंस्कृत400 माइक्रोग्राम / एमएल लेपित आईसीसी scaffolds नंगे पाड़ में सभ्य लोगों के रूप में अधिक से अधिक तीन बार एल्बुमिन की राशि स्रावित। ई cadherin, एन cadherin, और विभिन्न आईसीसी पाड़ की स्थिति में β1 प्रोटीन इंटीग्रिन के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लिए परिणाम चित्रा 8 में दिखाई देते हैं। अन्य कोटिंग की स्थिति (चित्रा 8A) की तुलना में 400 माइक्रोग्राम / एमएल लेपित आईसीसी scaffolds में ई cadherin mRNA अभिव्यक्ति की दर से अधिक 4 परतों की वृद्धि हुई। एन cadherin जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन गुना कोलेजन कोटिंग के उच्च सांद्रता में अधिक से अधिक था। हालांकि, जीन अभिव्यक्ति β1 इंटीग्रिन अपेक्षाकृत स्थिर रहे या 200 माइक्रोग्राम / एमएल लेपित आईसीसी मचानों को छोड़कर सभी आईसीसी मचानों की स्थिति में कमी आई है।

चित्रा 32
चित्रा 2. एनएचएस के माध्यम से PEGDA पाड़ के लिए कोलेजन के विकार रसायन शास्त्र। बायोएक्टिव scaffolds खूंटी एनएचएस एक amine प्रतिक्रियाशील succinimidyl (एनएचएस) एस्टर कि कोलेजन पाड़ करने के लिए अनुमति देने में विकार एमाइन समूह के प्रति प्रतिक्रिया करता है कि का उपयोग करें। खूंटी, पाली (एथिलीन ग्लाइकोल); एन एच एस, एन -hydroxysuccinimide; यूवी, पराबैंगनी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. आईसीसी cavities और interconnections के आकार का विश्लेषण। (ए) आईसीसी पाड़ के SEM micrographs (पैमाने बार = 100 माइक्रोन) ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और मात्रात्मक की histograms के रूप में प्रतिनिधित्व (बी) ताकना व्यास और (सी) एक दूसरे का संबंध व्यास। यह आंकड़ा संशोधित और विले 47 से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया गया है।"Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. आईसीसी पाड़ टोपोलॉजी पर कोलेजन कोटिंग का प्रभाव। (ए) SEM छवियों और (बी) के confocal छवियों गुणात्मक 20 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ लेपित मचानों की सतह टोपोलॉजी, 200 माइक्रोग्राम / एमएल का आकलन करने के लिए ले जाया गया, और 400 माइक्रोग्राम / एमएल के कोलेजन। लाल बक्से गुहा नीचे उच्च बढ़ाई छवियों में दिखाया गया है चारों ओर। स्केल सलाखों के हैं (ए) 5 माइक्रोन, (बी) 200 माइक्रोन और 100 माइक्रोन (उच्च बढ़ाई)। यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और विले 47 से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5. सेल व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान पर आईसीसी मंच की स्थिति गुणात्मक लाइव / मृत परख का उपयोग का प्रभाव। लाइव / मृत दाग हं 7.5 कोशिकाओं अलग कोलेजन एकाग्रता कोटिंग्स (0, 20, 200 के साथ आईसीसी scaffolds में वरीयता प्राप्त Confocal छवियों, और 400 माइक्रोग्राम / एमएल) 1, 4, 7, और 10 दिनों के बोने के बाद ले जाया गया। ग्रीन दाग (calcein) जीवित कोशिकाओं और लाल दाग को इंगित करता है (ethidium homodimer -1) कोशिका मृत्यु इंगित करता है। स्केल सलाखों 200 माइक्रोन से संकेत मिलता है। [यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और विले 47 से अनुमति के साथ इस्तेमाल] यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 प्रभावहं 7.5 कोशिकाओं को एक 2 डी polystyrene संस्कृति की थाली पर और विभिन्न कोलेजन एकाग्रता कोटिंग्स (0, 20, 200 के साथ आईसीसी scaffolds में वरीय और 400 माइक्रोग्राम / एमएल सेल व्यवहार्यता पर मंच के प्रकार और आईसीसी मंच की स्थिति एक मात्रात्मक वर्णमिति सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करने का। ) वर्णमिति एमएसआर व्यवहार्यता परख 1, 4, 7, 10 के अधीन थे, और बोने 14 दिनों के बाद। Absorbance 450 एनएम पर मापा गया था और डेटा दिवस 1 absorbance के मूल्यों के लिए सामान्यीकृत किया गया। (एन = 3, ± एसडी मतलब है, ***: पी <0.001 एमएसआर समाधान absorbance के प्रत्येक समूह के दिन 1 के लिए पढ़ने की तुलना में।) [यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और विले 47 से अनुमति के साथ इस्तेमाल] यहाँ एक देखने के लिए क्लिक करें यह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

चित्रा 7
चित्रा 7. आईसीसी पी का प्रभावहं-7.5 समारोह पर latform हालत स्रावित एल्बुमिन एकाग्रता एलिसा विश्लेषण का उपयोग। Albumin एलिसा सीरम albumin स्राव यों इस्तेमाल किया गया था अलग कोलेजन एकाग्रता कोटिंग्स (0, 20, 200, और 400 माइक्रोग्राम / एमएल) के दिन 1, 4, 7, 10 पर, और 14 बोने के बाद से सेल से लदी आईसीसी मचानों से एकत्र मीडिया में। प्रत्येक डेटा बिंदु 3 नमूने के एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है और पाया कोशिकाओं की संख्या वर्णमिति एमएसआर सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग और बनाए गए मानक वक्र के लिए सामान्यीकृत है (एन = 3, ± एसडी मतलब है)। [यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और विले 47 से अनुमति के साथ इस्तेमाल] यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा हं-7.5 पर आईसीसी मंच हालत का प्रभावसमारोह जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का उपयोग। वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर अलग कोलेजन एकाग्रता कोटिंग्स के साथ आईसीसी scaffolds में संवर्धित कोशिकाओं के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल करने के लिए (0, 20, 200 से 400 माइक्रोग्राम / एमएल, और) दिन 1, 4 पर 7 के बाद इस्तेमाल किया गया था, और बोने। तीन जंक्शन प्रोटीन चुने गए हैं, अर्थात् (ए) ई cadherin, (बी) एन cadherin, और (सी) Integrin बीटा 1. mRNA अभिव्यक्ति के स्तर GAPDH द्वारा सामान्यीकृत किया गया। (एन = 3, ± एसडी मतलब *:। पी <0.05 **:।। पी <0.01 दिवस 1 प्रत्येक समूह के जीन की अभिव्यक्ति की तुलना में) [यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और विले 47 से अनुमति के साथ इस्तेमाल] कृपया यहाँ के लिए क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

ऊतक इंजीनियरिंग scaffolds तेजी से सभी शारीरिक और जैव रासायनिक, पुनर्जन्म को बनाए रखने, या अंग प्रतिस्थापन के आवेदन के लिए ऊतकों की मरम्मत, बीमारी का अध्ययन दवाओं के विकास के लिए आवश्यक संकेत, और कई अन्य लोगों के 57 प्रदान करने के लिए विकसित हो रहे हैं। जिगर ऊतक इंजीनियरिंग में, प्राथमिक मानव hepatocytes तेजी से अपने चयापचय कार्यों एक बार शरीर से अलग, इंजीनियरिंग scaffolds के लिए एक बड़ी जरूरत बनाने और प्लेटफार्मों के विकास यकृत समारोह को बनाए रखने के लिए खो देते हैं। इन विट्रो hepatocyte संस्कृति प्लेटफार्मों में वर्तमान विभिन्न biomaterials का उपयोग किया है। इस क्षेत्र में अनुसंधान में इस तरह के ईसीएम प्रोटीन विन्यास 58,59, सह संस्कृति 60,61, और 62 micropatterning के रूप में विवो यकृत microenvironment के विभिन्न सुविधाओं, नकल उतार पर केन्द्रित किया गया है। हालांकि, वहाँ नियंत्रित porosity और उच्च स्थानिक संगठन के साथ scaffolds की कमी की गई है। इस संबंध में वर्णित आईसीसी सेल संस्कृति platfORM, इसके isotropic गुण और उच्च संगठन के साथ, इस शून्य को संबोधित करते हैं। हम आईसीसी PEGDA पाड़ हिपेटोकार्सिनोमा कोशिकाओं, hepatocytes के लिए एक मॉडल सेल प्रकार संवर्धन के लिए एक उपयुक्त मंच है दिखाना है, और कहा कि आगे कोलेजन कोटिंग सेल व्यवहार 47 को बढ़ाता है।

अभ्यास में, आईसीसी पाड़ की गुहा आकार पी एस microspheres के आकार से देखते जा सकता है। इसके अलावा, पाड़ के परस्पर आकार समय और annealing प्रक्रिया के तापमान से नियंत्रित किया जा सकता है; उच्च annealing तापमान या बड़ा एक दूसरे का संबंध व्यास में अब annealing समय का परिणाम है। इसलिए, इन मानकों को ध्यान से चयनित किया जाना चाहिए के रूप में बड़ा एक दूसरे का संबंध व्यास पाड़ के यांत्रिक स्थिरता समझौता होगा। इस काम में, व्यास 140 माइक्रोन के पी एस क्षेत्रों आदेश के केंद्र में सेल की नेक्रोसिस को रोकने के लिए नंगे आईसीसी scaffolds में जिसके परिणामस्वरूप hepatospheres के आकार को सीमित करने के लिए hepatocyte सेल संस्कृति के लिए चुने गए हैं वहpatocyte अंडाकार आकृति। 63 के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, आईसीसी पाड़ की 3 डी 2 डी वास्तुकला polystyrene प्लेट सेल संस्कृति की तुलना में अधिक हं-7.5 सेल प्रसार की अनुमति देता है। परिणाम बताते हैं कि आईसीसी पाड़ के परस्पर वर्दी गुहाओं कुशल सेल सेल बातचीत और cavities के बीच crosstalk अनुमति देते हैं।

कोलेजन प्रकार की एकाग्रता मैं कोटिंग प्रभावित सेल आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता और समारोह। कोलेजन प्रकार मैं एक महत्वपूर्ण ईसीएम प्रोटीन Disse, एक क्षेत्र hepatocytes 64 से सटे की अंतरिक्ष में पाया जाता है। Nonadhesive, नंगे PEGDA आईसीसी scaffolds जबकि hepatocyte अंडाकार आकृति गठन, एक कोलेजन कोटिंग पाड़ बायोएक्टिव और हं 7.5 कोशिकाओं पाड़ की सतह का पालन प्रदान की गई पदोन्नत, बड़े सतह क्षेत्र वर्तमान का उपयोग। ईसीएम प्रोटीन लेपित आईसीसी scaffolds, के रूप में अच्छी तरह से दोनों सेल सेल बातचीत में सुधार सेल ईसीएम बातचीत के रूप में के रूप में upregulated ई cadherin, एन cadhe ने संकेतरिन और Integrin β1 जीन भाव है, जो सेल व्यवहार को विनियमित करने में एक भूमिका निभाते हैं। कोलेजन प्रकार मैं 200 माइक्रोग्राम / एमएल और 400 माइक्रोग्राम / एमएल की सांद्रता हं-7.5 संस्कृति के लिए उपयुक्त थे, दोनों सेल प्रसार और एल्बुमिन स्राव में सुधार।

मुख्य आईसीसी निर्माण से उत्पन्न सीमा पी एस क्षेत्र के संरेखण और संख्या जब lattices बनाने पर नियंत्रण है। इथेनॉल के त्वरित वाष्पीकरण सांचों में लोड हो रहा है क्षेत्रों में lattices क्षेत्रों की परतों का एक अलग संख्या में जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न क्षेत्र घनत्व पैदा कर सकता है, जबकि। हालांकि, पानी की तरह कम अस्थिर समाधान का उपयोग भी नुकसान है। यह अस्थायी विधानसभा प्रणाली 65 में कम आदेश दिया सीसीएस के लिए नेतृत्व, और वहाँ meniscus गठन की वजह से एक अत्यधिक घुमावदार पाड़ की सतह का एक उच्च संभावना है। एक और सीमा नए नए साँचे में क्षेत्रों के उचित संरेखण interconnections के उच्चतम दक्षता सुनिश्चित करने के लिए है। मिलाते कदम (कदम 1.1.5 और 1.1.6) इसलिए गआईसीसी निर्माण तकनीक को ritical। एक अच्छी व्यवस्था माइक्रोस्कोपी द्वारा नहीं मनाया जाता है, कदम 1.1.6 दोहराएँ।

कुल मिलाकर, आईसीसी PEGDA पाड़, अपनी सरल निर्माण प्रोटोकॉल के साथ, आसानी से 3 डी सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटीन के साथ नंगे पाड़ की Bioactivation आगे अपनी कार्यात्मक विशेषताओं 14 को बढ़ाता है। इस पांडुलिपि में, हम करने के लिए निर्माण प्रोटोकॉल रुझान और जिगर ऊतक इंजीनियरिंग आवेदन के लिए सेल आकलन assays के लिए चुना है। हालांकि, सेल प्रकार की एक सीमा के भीतर इस अनूठी पाड़ संवर्धित किया जा सकता है और प्रत्येक कोशिका प्रकार निश्चित मापदंडों के परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा कई ईसीएम प्रोटीन प्रकार, सह संस्कृति, और गतिशील संस्कृति एक बायोरिएक्टर का उपयोग कर के मामले में जटिलता की परतों के सभी सेल के प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए आगे भी जोड़ा जा सकता है। इस मंच संभावित ऊतक उत्थान और नशीली दवाओं के विकास में सहायता करने के लिए, यकृत रोगों का अध्ययन करने के लिए, और प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है।

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Acknowledgments

लेखकों को एक राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन फैलोशिप (एनआरएफ -NRFF2011-01) और प्रतिस्पर्धी अनुसंधान कार्यक्रम (एनआरएफ-CRP10-2012-07) से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR tube Axygen Scientific PCR-02D-C Boil-proof
Gorilla Glue Gorilla Glue, Inc. Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides VWR 631-1575 Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres Fisher Scientific TSS#4314A Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol Merck 1.00983.1011 absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath Elma S10H Equiment
Furnace Nabertherm N7/H Equipment
200 µl pipette tip Axygen Scientific T-210-Y-R-S
Rocking shaker VWR 444-0142
Polyethylene Glycol (PEG) Merck 1.09727.0100 Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge Beckman Coulter 392932 Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate Laysan Bio ACRL-PEG-SVA-3400-1g Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma Aldrich 410896
Vortex VWR 58816-123 Equipment
Microcentrifuge Eppendorf 5404 000.413
Paraffin Film Parafilm M  #PM996 Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight Blaze Technology  120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF) Merck 107025
Orbital shaker Heidolph 543-123120-00-5
Collagen Type I Sigma Aldrich C3867-1VL From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 20012-027 16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde VWR 43368.9M Equipment
Freezone 4.5 freeze drier Labconco 7750020 Equipment
Sputter coater Jeol Ltd. JFC-1600 Equipment
Scanning Electron Microscope Jeol Ltd. JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Life Technologies A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)  Bio-Rev PTE LTD 3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		 Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S) Life Tchnologies 15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes Sigma Aldrich CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators Thermofisher Scientific 371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer Thermofisher Scientific 02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Life Technologies L3224 
CCK-8 Assay Dojindo Laboratories CK04-11 Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader  Tecan
Albumin Human ELISA kit Abcam ab108788
Triton X-100 Bio-Rad #1610407
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) Santa Cruz Biotechnology sc-53850; sc-271605
DAPI Life Technologies D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin Life Technologies A34055
Trizol Life Technologies 15596-026
Chloroform VWR 22706.326
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
DPEC water Thermofisher Scientific AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer Thermofisher Scientific ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix  Bio-Rad Laboratories 1708840
SYBR select Master Mix for CFX Life Technology 4472937
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CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH 

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जैव अभियांत्रिकी अंक 114 जिगर ऊतक इंजीनियरिंग पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) हाइड्रोजेल उल्टे कोलाइडयन क्रिस्टल hepatocyte सेल संस्कृति biofunctionalization
उल्टे कोलाइडयन क्रिस्टल पाली (ethylene glycol) पाड़ के निर्माण: जिगर ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक तीन आयामी सेल संस्कृति मंच
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Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon,… More

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon, W. Y., Kim, M. H., Lee, J. H., Ng, S. S., Tabaei, S. R., Cho, N. J. Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (114), e54331, doi:10.3791/54331 (2016).

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