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Bioengineering

Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54331
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

A capacidade para manter a função de hepatócitos in vitro, com a finalidade de testar a citotoxicidade 'xenobióticos, estudar a infecção por vírus e o desenvolvimento de drogas orientadas para o fígado, exige uma plataforma em que as células recebem sinais bioquímicos e mecânicos adequados. sistemas recentes de engenharia de tecidos do fígado têm empregado tridimensionais andaimes (3D) compostas de hidrogéis sintéticas ou naturais, dada a sua alta capacidade de retenção de água e sua capacidade de fornecer os estímulos mecânicos necessários pelas células. Tem havido um interesse crescente no andaime invertida cristal coloidal (ICC), um desenvolvimento recente, que permite alta organização espacial, homot�ica e interação célula heterotípica, bem como matriz (ECM) interação célula-extracelular. Aqui, nós descrevemos um protocolo para fabricar o andaime ICC usando poli diacrilato (etileno glicol) (PEGDA) eo método de partículas de lixiviação. Resumidamente, uma estrutura é feita a partir de partículas de microsferas, após o qual uma pré-polymesolução R é adicionada, adequadamente polimerizadas, e as partículas são, então, removido, ou lixiviado, utilizando um solvente orgânico (por exemplo, tetra-hidrofurano). A dissolução dos resultados grades de um andaime altamente porosa com tamanhos de poro controlado e interconnectivities que permitem que os meios para a obtenção de células mais facilmente. Esta estrutura única permite que a área de superfície elevada para as células a aderir bem como a comunicação fácil entre poros, e a capacidade para revestir o andaime ICC PEGDA com proteínas também mostra um efeito significativo no desempenho da célula. Analisamos a morfologia do suporte, bem como a célula hepatocarcinoma comportamento (Huh-7,5), em termos de viabilidade e função para explorar o efeito da estrutura ICC e revestimentos de ECM. No geral, este artigo fornece um protocolo detalhado de um andaime emergente que tem larga aplicação em engenharia de tecidos, especialmente no fígado engenharia de tecidos.

Introduction

O fígado é um órgão altamente vascularizado com uma multiplicidade de funções, incluindo a desintoxicação do sangue, metabolismo de xenobióticos, e a produção de proteínas séricas. O tecido de fígado tem uma microestrutura complexa tridimensional (3D), que compreende de vários tipos de células, canalículos biliares, sinusóides, e zonas de composição biomatriz diferente e diferentes concentrações de oxigénio. Dada esta estrutura elaborada, tem sido difícil criar um modelo de fígado adequada in vitro 1. No entanto, há uma crescente demanda por funcional em modelos in vitro hospedagem hepatócitos humanos como plataformas para ensaio da toxicidade da droga 2 e estudo de doenças associadas ao fígado 3.

Plataformas de engenharia de tecidos de fígado actual simplificaram a complexidade do fígado através do isolamento de um, ou concentrando-se em alguns, dos parâmetros do fígado, isto é, a co-cultura de células de 4 composição, bioquímica da Zonal microambientes 5, dinâmica de fluxo de 6,7 e a configuração da Biomatriz 8. Configuração da biomatriz pode ser dividida em parâmetros, tais como materiais de andaime, a composição de proteínas da matriz extracelular (ECM), a rigidez da matriz, bem como da concepção e estrutura do andaime. Houve um aumento nos estudos de engenharia de tecidos utilizando hidrogeles sintéticos, especialmente poli (etilenoglicol) (PEG) hidrogéis 9, dada a capacidade de ajustar as propriedades, bioactividade, e taxa de degradação mecânica do hidrogel. Em relação à investigação relacionada com o fígado, o hidrogel biocompatível foi aplicado para estudar a infecção pelo vírus da doença hepática 3. Como um projeto de plataforma de hepatócitos, numerosos estudos têm utilizado hepatócitos sanduíche culturas 10,11 e encapsulamento de células dentro de um hidrogel 12,13 para proporcionar o ambiente 3D e célula-ECM e interação célula-célula, que são essenciais para imitar no microambiente vivo. However, essas plataformas não possuem um alto grau de controle e organização espacial, levando a propriedades não uniformes através do andaime 14.

O coloidal cristal invertido (ICC) 14 scaffold é um arcabouço 3D altamente organizada para cultura de células, que foi introduzido pela primeira vez no início de 2000. estrutura única do andaime pode ser atribuída ao processo de fabricação simples utilizando um cristal coloidal, uma estrutura ordenada de partículas coloidais de diâmetro variável. Resumidamente, para resumir o processo, as partículas são dispostas ordenadamente e recozidos usando o calor para formar uma rede. A lixiviação desta estrutura, por um solvente orgânico, em um polimerizados resultados de hidrogel em cavidades esféricas hexagonal embalados 15 com área de superfície elevada. Este andaime altamente ordenada tenha sido previamente feito com ambos os materiais sintéticos e naturais, incluindo, mas não limitados a poli (acrilamida) 16-21, poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) 15,22-30, Poli (etileno-glicol) 31,32, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) 21,33-35, e quitosano 36-39. Andaimes ICC feitas de materiais não-incrustantes tendem a promover esferóides celulares no interior das cavidades 14,23,40. Vários tipos de células têm sido mostrados para proliferar com sucesso, diferenciação e função dentro desta configuração, incluindo condrócitos 41, células do estroma da medula óssea 42, e as células-tronco 43,44. Em relação hepatócito, estudos têm sido realizados com andaimes ICC feitas de Na 2 SiO 3 e poli (acrilamida), mas não PEG. Com estratégias bioconjugação simples (ou seja, o acoplamento de amina através EDC / NHS), scaffolds à base de PEG ECM proteínas conjugadas podem ser fabricados, que podem revelar-se locais de ligação mais celulares para ser um mais in vivo, como o ambiente e melhorar a função hepática.

Neste manuscrito e o vídeo associado, detalhamos a fabricação do andaime ICCusando poli (etileno-glicol) diacrilato de hidrogel (PEGDA) e um látice de poliestireno microesfera, optimizado para hepatocarcinoma (Huh-7,5) cultura. Nós demonstrar as diferenças entre os nus andaimes ICC PEGDA geralmente não aderentes eo PEGDA ICC andaime revestido de colágeno em termos de topologia de andaime e desempenho celular. viabilidade e função celular são medidos qualitativa e quantitativamente avaliar o comportamento das células Huh-7.5.

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Protocol

1. ICC andaime Fabrication (Figura 1)

  1. Prepare o poliestireno (PS) reticulados (diâmetro = 6 mm; 8-13 camadas de grânulos).
    1. Para preparar o molde, corte as pontas off de 0,2 ml tubos de microcentrífuga à prova de fervura no nível de 40 mL. Aderir ao topo das cut-tubos de 24 x 60 milímetros 2 microscópio lamelas de vidro com cola à prova de água.
    2. Coloque as esferas PS (diâmetro = 140 um) contidos dentro de uma suspensão de água em um frasco de 20 ml, cuidadosamente pipetar a suspensão em água, e adicionar 18 ml de solução a 70% de etanol para dentro do frasco. Coloque a solução esfera em um banho ultra-sônico para soltar esferas agregados. Repetir esta etapa de lavagem várias vezes a fim de remover componentes de água e solúveis em água completamente.
    3. Pipetar 100 l de etanol para dentro dos moldes.
    4. Cortar a parte superior de uma ponta de micropipeta de 200 ul por 4 mm. Pipetar 25 ul das esferas para dentro do molde, duas vezes usando 200 ul micropipeta para atingir umvolume total de 50 ul em cada molde.
    5. Coloque os moldes em um shaker balançando a 120 durante a noite rpm.
    6. Verificar o arranjo das esferas em cada molde sob um microscópio óptico. Se as esferas não são ordenados hexagonal, adicionar 50 ul de etanol a 70% e agitar manualmente na direcção do eixo longitudinal e lateral para corrigir o arranjo.
    7. Deixe a evaporar-se o etanol à temperatura ambiente (RT) durante duas noites. Coloque o molde e complexo grânulo em um forno de 130 ° C durante 6 horas para recozer os grânulos PS.
  2. Preparando andaimes PEGDA nuas e revestidas de ECM.
    1. Sintetizar macr�eros PEGDA usando protocolos estabelecidos 45,46 para acrylating macr�eros PEG lineares (M w = 4,6 kDa).
    2. Prepare a 50% (w / v), solução em PEGDA (DI) de água ionizada-de e permitir que o macrómero para dissolver adequadamente por centrifugação a 4713 xg até que esteja completamente dissolvido.
      1. Para ECM conjugado andaimes ICC, dissolver um adicional10% (w / v) de acriloilo-PEG-NHS (M w = 3,4 kDa) na solução PEGDA 50%.
    3. Prepara-se uma a 20% (w / v) de solução de reserva de 2-hidroxi-4 '- (2-hidroxietoxi) -2-metilpropiofenona (PI) em 70% de etanol.
    4. Adicionar 50 ul de 20% (w / v) de solução de estoque de PI por 1 ml de 50% (w / v) de PEGDA. Ajustar a quantidade necessária de solução-mãe de PI com base no peso molecular de PEGDA.
    5. Vortex da mistura no tubo de centrífuga de 1 min para chegar a uma solução homogénea.
    6. Descasque os moldes da lâmina de vidro (do passo 1.1.7), remover a cola dos moldes, empurre os reticulados cuidadosamente com uma espátula e coloque cada um deles em um tubo de 1,5 ml. Pipetar 300 ul da solução PEGDA e centrifugar a 845 xg durante 5 min para permitir a infiltração de solução PEGDA adequada no reticulado.
    7. Remova a estrutura do tubo, usando uma pinça e secar cuidadosamente solução PEGDA excesso de seca em luvas. Coloque a estrutura em um vidro revestido por uma película de parafina com o cir planasuperfície cular voltado para cima.
    8. Expor a solução PEGDA andaime infiltrado a 365 nm, radiação ultravioleta (UV) (10,84 mW / cm 2) durante 5 min, utilizando uma lâmpada de UV local.
    9. Coloque redes cristalinas PEGDA-polimerizados em novos tubos de ensaio (cerca de 10 reticulados por frasco) e adicionar 20 ml de tetra-hidrofurano (THF). Agitar os frascos num agitador orbital a 300 rpm. Mudar THF, pelo menos, 3 vezes com um intervalo de 1-2 horas.
      Nota: Não remover o THF completamente ao mudar-se o THF, a fim de evitar que as bolhas de entrar nos andaimes, que por sua vez pode causar a remoção incompleta de PS. Deixar solução suficiente para cobrir as treliças e adicionar novo THF.
      Cuidado: THF é tóxico. Usar luvas, jaleco e óculos de proteção. Evitar a inalação, operando sob a coifa.
    10. Verifique se esferas PS são dissolvidos, colocando água na solução THF utilizado e observando a cor da solução. Repita o passo 1.2.9 Se as esferas PS não são devidamente dissolvido.
      Nota: A cor da solução mudará parabranco se existem esferas PS restantes.
  3. Limpe os suportes na cabine de segurança biológica (BSC).
    1. Para esterilizar os andaimes, preparar um tubo de centrífuga de 50 ml com 2 ml de 70% de etanol por andaime e colocar andaimes no tubo usando uma espátula. Permitir que os andaimes para mergulhar em etanol durante 1 hora. A partir deste passo, a todos os procedimentos no BSC.
    2. Cuidadosamente verter a etanol e substituir com tampão de fosfatos salino (PBS) (2 ml por andaime) e centrifugar a 524 xg durante 3 minutos para remover as bolhas. Mantê-lo na geladeira e mudar o PBS algumas vezes com um intervalo de 1-2 horas.
      1. Para o tipo de colágeno andaimes I-revestido, preparar um outro tubo de centrífuga de 50 ml contendo colágeno solução de tipo 1 (1 ml por scaffold), transferir os andaimes esterilizados a este tubo usando uma espátula, e centrifugar a 524 xg por 3 min. Agitar os andaimes a 400 rpm num agitador orbital durante 30 min e manter o tubo na refrigerou durante a noite.
      2. Lavar os andaimes com PBS duas vezes antes de usar, submergindo os andaimes em PBS fresco e, em seguida, aspirar o PBS.
        Nota: Outras proteínas de ECM também pode ser usado em vez de colagénio tipo I, porque a química de NHS requer um grupo amina para formar a ligação (Figura 2).

figura 1
Figura 1. Visão geral da fabricação ICC. Andaimes CCI, sediada em PEG são fabricados usando técnicas de microfabricação com e sem ECM-funcionalização. Andaimes ICC revestidos por ECM requerem PEG-NHS, bem como PEGDA (conforme detalhado na Figura 2). A rede PS tem um diâmetro de 6 mm e uma altura de 8-13 camadas do grânulo. PS, poliestireno; PEGDA, poli (etileno-glicol) diacrilato; UV, ultravioleta; THF, tetra-hidrofurano; ECM, matriz extracelular. Esta figura foi modificada e usada com autorização de Wiley 47. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Caracterização Estrutura 2. ICC

  1. Para analisar a estrutura ICC com ou sem proteínas conjugadas, usar microscopia eletrônica de varredura (SEM) 47.
    1. Corrigir os andaimes com paraformaldeído a 4% (PFA), desidratar em série-los em 25, 50, 75, 95 e 100% de etanol soluções, e armazená-los a -80 ° C até que o etanol evaporar totalmente.
    2. As amostras secas em um secador por congelação durante 48 horas.
    3. Apor a amostra no suporte da amostra usando a fita de carbono e coloque em um revestidor por crepitação.
    4. Após aspiração automática, bata-a com um filme Pt ​​de 10 nm de espessura por pulverização catódica por 60 seg a 20 mA.
    5. Andaimes ICC imagem utilizando SEM a uma voltagem de 5 kV (Figura 3A, a Figura 4A).
  2. Para medir o poro ediâmetro interligação das cavidades, analisar micrografias utilizando imagem software de análise 48 (por exemplo, ImageJ; Figura 3B, C).
  3. Para visualizar o colagénio conjugado com o andaime sem células, marcação por fluorescência do colagénio utilizando anticorpos (1: 100) contra o colagénio tipo I e com imagem de microscopia confocal de varrimento laser 47 (CLSM; Figura 4B).

3. Huh-7.5 Cultura de Células e Sementeira

  1. Cultura Huh-7,5 células a uma densidade de sementeira de 2-2,5 x 10 6 culas / ml em placas de cultura de células de 100 mm com 10 ml de Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 U / ml penicilina-estreptomicina (meio de crescimento) a 37 ° C e 5% de CO 2. Alterar os meios de comunicação a cada três dias no BSC até que tenham atingido 75-80% de confluência.
  2. Prepare os andaimes para a semeadura célula do BSC.
    1. Com cuidado, coloque o scaffidade em uma placa de 24 poços, com a superfície plana virada para cima.
    2. Para lavar o andaime, pipeta de 2 ml PBS a cada poço contendo um andaime. Aspirar o PBS e pipeta de 2 ml de PBS fresco em cada poço.
    3. Aspirar o PBS e pipeta de 2 ml de meio de crescimento (veja o passo 3.1) e deixe por 30 minutos. Aspirar os meios de comunicação e permitir que o andaime a secar durante 1 hora.
  3. Retire confluentes células Huh-7,5 (a partir do passo 3.1) da placa de cultura no BSC utilizando o método de digestão com tripsina.
    1. Aspirar meios de placa, adicionar 4 ml de PBS para lavar as células aderentes e depois aspirar PBS.
    2. Pipeta 0,75-1 ml de 0,25% de tripsina e colocar numa incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 3 min.
    3. Retire a placa da incubadora e pipeta de 5 ml de mídia para parar a reacção tripsina. media Pipeta, células isoladas, e uma mistura de tripsina em um tubo de 15 ml.
    4. Centrifuga-se a 524 xg durante 3 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de meio.
  4. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e calcular o volume da suspensão de células que contém células no número de destino, N 0, por 25 ul (para a experiência padrão, n é 0 1 x 10 6 células).
    O volume de suspensão de células = (número de células alvo) / (concentração de suspensão de células)
  5. Lentamente Pipetar 25 ul de suspensão de células (células contendo N 0) directamente na parte superior de cada escora (a partir do passo 3.1.4). Colocar a placa de 24 poços na incubadora.
  6. Após 12 horas, transferir cuidadosamente os suportes com o uso de uma espátula para uma nova placa de 24 poços e pipeta de 2 ml de meio em cada poço. Colocar a placa de 24 poços na incubadora.
  7. Alterar os meios de comunicação a cada 3 dias ou dependendo quando a mídia é coletada para análise de secreção de proteínas (ver passo 5.1).

Viabilidade 4. celular

  1. Para analisar qualitativamente a viabilidade celular, use vivo kits de coloração fluorescentes / mortas para corar as células e imagem usando CLSM.
    1. Seguindo instruções do kit, preparar uma solução com 4 mm AM calceína e 8 mM de etídio homo-dímero-1 em mídia (veja o passo 3.1.3).
      Nota: Optimizar dependendo do número de células. Use o dobro da quantidade de reagente se as células proliferam e dupla em número (cerca de 2 milhões).
    2. No BSC, meios de aspirado de cada poço com um andaime (passo 3.7) e pipeta 500 uL da solução preparada. Incubar as amostras em uma incubadora a 37 ° C durante 1 h.
    3. Cobrir as placas em papel de alumínio para proteger as amostras da luz ao remover a placa fora da incubadora. amostras de imagem usando CLSM49.
  2. Para avaliar quantitativamente a viabilidade celular, medir a actividade enzimática (em células vivas) utilizando ensaios colorimétricos 50 (isto é, 2- (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) 2H-tetrazólio (reagente monossódico-sal)).
    1. Criar uma curva padrão para a plataforma TPI (isto é, um gráfico da absorvância (OD) versus determinado número de células).
      Nota: sementeira celular não é 100% eficiente em comparação com outras plataformas, uma vez que as células podem passar através das cavidades de andaimes.
      1. Determinar o número de células de sementeira, n 0 que vai ser utilizado para fazer a curva padrão.
        Nota: Escolha um intervalo que inclui o número de células que são estimados no experimento. Por exemplo, se o número de células inicial é de 5 x 10 5 células e há uma estimativa de vezes de aumento ~ 3 até ao último dia da experiência, escolher 2,5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6, e 2 x 10 6 células como N 0.
      2. Realizar a sementeira de células nos andaimes ICC (um N 0 por volume de andaime com sementeira de 25 ul) tal como descrito nos passos 3.1-3.6.
      3. Após 6 horas, transferir os andaimes para outra placa de 24 poços bem. Escolha um tempo que permite aderência celular, mas não proliferação celular.
      4. Realizar contagem de células no cadafalso ICC transferidos.
        1. Diluir 10x monossódico-sal reagente solução (MSR) para 1x com a mídia no BSC e pipeta de 500 mL solução 1x MSR em cada poço com um andaime. Incubar a placa de 24 poços a 37 ° C durante 1 h.
        2. De cada poço, transferência de 100 ul numa placa de 96 poços bem. Como uma peça em bruto, pipeta 100 uL da solução de reagentes 1x monossódico-sal fresco nos diferentes poços da placa de 96 poços. remover manualmente as bolhas existentes usando uma ponteira seca e cobrir a placa de 96 poços em papel alumínio para protegê-lo da luz.
        3. Medida OD a λ = 450 nm utilizando um espectrofotómetro de leitura. Subtrair o OD em branco de outros valores para encontrar a OD precisos 51.
      5. Contar o número de células (N G) remanescente no poço após a transferência do andaime (passo 4.2.1.3), utilizando um hemocitómetro.
        Nota: Use 300 ul de tripsina a trypsinize as células.
      6. Calcular o número de células actual, n a.
        = reaisinicial - saiu-se bem
        Um N = N 0 L -N
      7. Adicione curva padrão através da representação gráfica OD obtido no Passo 4.2.1.4.3 versus o número de células actual (N A) e utilizar isto para estimar o número de células nas experiências.
        Nota: Faça uma nova curva padrão, se nenhum parâmetro ICC (ou seja, o tamanho agente porog�ico, dimensões do andaime, proteína ECM, etc.) são alteradas.

Função 5. celular

  1. Analisar a secreção de proteínas pelas células Huh-7,5 (ou seja, albumina, ureia) a partir dos meios colhidos a partir da etapa (3.7) por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) 52.
    Nota: Dilui-se a meios, dependendo do número de células semeadas e a quantidade de material recolhido. Para 5 x 10 5 células semeadas em ICC, usar um ~ proporção de 1: 25, antes de introduzi-lo aos poços pré-revestidos de anticorpos de.
  2. Para analisar qualitativamente a função celular, imunocoloração proteínas intracelulares específicos(Ou seja, albumina), enzimas (ou seja, do CYP450), componentes estruturais mancha (ou seja, de actina celular), bem como os núcleos e imagem usando CLSM 49.
    1. media aspirado (do passo 3.7) e pipeta de 2 ml PBS para lavar os andaimes ICC células-laden.
    2. Pipete 1 mL de PFA a 4% e incubar durante 5 min à temperatura ambiente, durante a fixação.
    3. Lavar 3x com 2 ml de PBS.
    4. Permeabilizar as membranas por incubação dos andaimes em 1 ml de 0,1% de 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietileno-glicol (agente tensioactivo) durante 30 min.
    5. Lavar 3x com 2 ml de PBS para remover quaisquer proteínas de vazamento.
    6. Pipetar 500 ul 1% de albumina de soro bovino (BSA) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h para bloquear a ligação não específica.
    7. Prepare anticorpo primário diluído (ou seja, albumina, CYP450) solução.
      1. Pipetar 500 l de solução de BSA a 1% em um tubo de 15 mL e adicionar 4,5 mL de 0,1% solução de agente tensioactivo para preparar uma 5 ml de 0,1% de BSA solução total.
      2. Pipetar 98 ul de solução de BSA a 0,1% para um tubo de microcentrífuga de 200 uL e 2 ul do anticorpo primário para produzir um 01:50 (anticorpo primário: 0,1% de BSA) solução de anticorpo primário.
    8. Pipetar 40 ul de solução de anticorpo primário sobre o andaime e cobrir o substrato com a película de parafina. Envolva a placa de 24 poços com folha de alumínio e armazenar o prato a 4 ° C durante a noite.
    9. Lavar 3x com 2 ml PBS e agitar a placa suavemente no meio de lavagem.
    10. Prepare anticorpo secundário biotinilado diluído (ou seja, anticorpo anti-ratinho) solução estoque.
      1. Pipeta solução de BSA a 198 ul de 0,1% e 2 ul segundo anticorpo para produzir uma mistura 1: (anticorpo secundário: 0,1% de BSA) 100 A solução de anticorpo secundário.
      2. Prepara-se uma solução de estoque de 0,1% de rodamina faloidina marcada com fluoresceína ou (para corar os filamentos de actina celular) em solução de BSA a 0,1%.
      3. Pipetar 25 ul de cada solução num tubo e misturar Well.
    11. Pipetar 50 ul de solução-mãe de anticorpo secundário sobre o andaime. Cobrir o andaime com película de parafina, enrole o prato com folha de alumínio e armazenar a temperatura ambiente por 2 horas.
    12. Lavar 3x com 2 ml de PBS.
    13. Pipete 200 pi de 0,2% 4'-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; uma mancha núcleo) solução no andaime e manter à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Cubra o prato com papel alumínio.
    14. Lavar 2x com 2 ml de PBS.
    15. Usando um conta-gotas, colocar uma gota de meio de montagem sobre o substrato.
    16. Cuidadosamente coloque o andaime numa lâmina de vidro e imagem usando CLSM 47.
  3. Avaliar a expressão do gene por reacção em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR). Use kits padrão para PCR transcriptase reversa (RT-PCR) 53 e qPCR 54, conforme as instruções do fabricante. Extrai-se a ARN a partir das células, tal como descrito abaixo.
    1. Colocar o andaime (a partir do passo 3,7) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Pipetar 200 mL de clorofórmio em cada tubo de microcentrífuga e agitar o tubo vigorosamente na mão por 15-20 seg. Manter os tubos à temperatura ambiente durante ~ 3 min, até à separação das fases.
    3. Centrifugar a amostra a 13000 xg, a 4 ° C durante 15 min e remover os tubos com cuidado de modo que as fases não se misturam.
    4. Cuidadosamente pipetar 500-600 ul da fase aquosa superior a partir do primeiro tubo num segundo tubo de microcentrífuga.
    5. Adicionar um volume equivalente (500-600 uL) de isopropanol para este segundo tubo.
    6. Inverter o tubo 3-5 vezes e deixar o tubo que está à temperatura ambiente durante 10 min.
    7. Centrifugar a amostra a 13000 xg, a 4 ° C durante 15 min.
      1. Se uma pastilha não é visível na parte inferior do tubo, de centrifugação novamente durante 5 min.
        Nota: Se ainda não existe sedimento visível, a quantidade de RNA pode ser insuficiente.
    8. Eutubos nvert com a tampa aberta para descartar o sobrenadante e pipeta de 1 ml de etanol a 70% diluído em água com DEPC para dentro do tubo.
    9. Ligeiramente vortex o tubo de modo que o sedimento se desprende da parede do tubo e deixe o ar seco tubo.
    10. Adicionar 50 ul de água DPEC para ressuspender o sedimento.
    11. Mantenha pipetagem até dissolver o pellet.
    12. Manter durante 10 min a 55 ° C, de modo a desnaturar o ARN de cadeia dupla em RNA de cadeia simples.
    13. Levemente tambor dedos sobre o fundo do tubo e, em seguida, centrifugar os tubos momentaneamente (7500 xg, 4 min, 4 ° C).
    14. Manter os tubos em gelo até à realização da transcriptase inversa 55 e PCR em tempo real, tal como descrito em 56.

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Representative Results

Os resultados representativos para a caracterização estrutural do andaime ICC ea comparação da eficácia de cada condição de andaime ICC em cultura de hepatócitos são mostrados e explicados abaixo. As condições ICC andaime utilizados nestes resultados são revestimentos de colagénio de 0 ug / ml (sem isolamento), 20 ug / ml (colágeno 20), 200 ug / ml (colágeno 200), e 400 ug / ml (colágeno 400) e o inicial huh-7.5 número de semeadura de células é 1x10 6.

Caracterização de interconexões de poros ICC e topologia andaime.

imagens SEM, após fixação e liofilização dos andaimes ICC, foi usado pela primeira vez para determinar se as interligações adequadas entre poros ICC foram formados e ver o efeito da conjugação de concentrações de colágeno variados sobre a topologia andaime. A análise quantitativa dos dois-dICC imagens SEM imensional nus (Figura 3A) utilizando o software ImageJ, revelou um diâmetro de poro médio de 102,3 ± 9,3 ^ m e um diâmetro médio de interligação de 38,6 ± 4,3 uM (Figura 3B, C). Esta interligação entre poros desempenha um papel significativo na difusão adequada de nutrientes para as células, bem como a interacção célula-célula ao longo do andaime. O revestimento de colagénio resultou em uma rede de malha de fibra que foi definido mais em concentrações mais elevadas de conjugação de colagénio (Figura 4A). Imagens confocais revelar ainda camadas de colagénio sobre as superfícies da cavidade e maior cobertura de área de superfície com aumentos na concentração de colagénio (Figura 4B).

Efeito das condições de plataformas ICC sobre a viabilidade celular Huh-7.5 e função.

células Huh-7.5 foram sujeitos a mancha fluorescente inoperante Live /ção de ensaio (4 uM calceína AM e 8 uM EthD-1) e fotografada usando CLSM, como mostrado na Figura 5. As células semeadas em andaimes nua, ICC não adesiva tende a agregar-se no centro do poro e célula-célula interligação entre poros foi visto nos últimos tempos (dias 7 e 10). A presença de um revestimento de colagénio nos andaimes ICC permitido células a aderir à superfície do andaime, bem como uma interacção célula-célula inter-poros tão cedo como o dia 1. A viabilidade celular, indicado pela mancha verde, aumentou com o tempo e foi geralmente mais elevada em suportes revestidos com colagénio, tal como indicado pelo aumento de fluorescência verde. a Figura 6 mostra os resultados quantitativos MSR para posterior investigação do efeito da concentração de proteína e estrutura 3D ICC sobre a viabilidade celular. Um ensaio de viabilidade celular colorimétrico foi realizado em células cultivadas em condições de andaime ICC, bem como sobre uma placa de cultura de poliestireno de dados de absorvância e 2D (medido a 450 nm) foi normalizado para tele controle (Dia 1). As células cultivadas em placas de 2D mantido a viabilidade das células, mas não foi observado aumento na proliferação celular. 3D andaime ICC nua grandemente aumentada da proliferação celular em comparação com a condição 2D, indicando a importância da matriz 3D. Com a adição do revestimento de colagénio, a proliferação de células aumentou com o tempo em todas as concentrações de colagénio e na proliferação máxima foi encontrada em 200 ug / ml de andaime ICC revestido no dia 14. Isto confirma as observações qualitativas na Figura 5.

Função dos hepatócitos foi avaliada pela monitorização das alterações na secreção de albumina assim o perfil de três proteínas de adesão nas diferentes condições ICC andaime a expressão do gene. A Figura 7 ilustra a correlação positiva entre a albumina de soro secretada, tal como quantificado por albumina de ELISA, e a concentração de colagénio conjugado com andaime. No dia 14, Huh-7.5 células cultivadas na400 ug / ml andaimes ICC revestidos secretado mais de três vezes a quantidade de albumina como aqueles cultivados na andaime nua. Os resultados para os perfis de E-caderina, N-caderina, e proteínas de integrina b1 nas diferentes condições de expressão do gene TPI de andaime aparecem na Figura 8. A taxa de expressão de ARNm da E-caderina em 400 ug / ml de andaimes ICC revestido ter aumentado para mais de 4 dobras, em comparação com as outras condições de revestimento (Figura 8A). A mudança vezes na expressão do gene N-caderina foi maior nas concentrações mais elevadas de revestimento de colagénio. No entanto, a integrina β1 expressão do gene permaneceu relativamente constante ou diminuiu em todas as condições de andaimes ICC, exceto 200 ug / ml andaimes ICC revestidos.

Figura 32
Figura 2. Conjugação de colágeno para o cadafalso PEGDA via NHS química. andaimes bioactivos utilizar PEG-NHS que tem um éster de succinimidilo reactivo com amina (NHS), que reage com o grupo amina em colagénio que permite a conjugação com o andaime. PEG, poli (etileno-glicol); NHS, N-hidroxisuccinimida; UV, ultravioleta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Análise do tamanho das cavidades e ICC interligações. (A) micrografias de andaime TPI (barra de escala = 100 pm) foram analisados ​​utilizando o software ImageJ e quantitativamente representados como histogramas de (B) diâmetro dos poros e (C) diâmetro de interconexão. Esta figura foi modificada e usada com permissão de Wiley 47."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Influência do revestimento de colagénio em topologia ICC andaime. (A) e imagens de SEM (B) imagens confocais foram levados para avaliar qualitativamente a topologia de superfície de andaimes revestidas com 20 ug / ml, 200 ug / ml, e 400 ug / ml de colagénio. Caixas vermelhas cercam a cavidade mostrada na ampliação das imagens mais elevados abaixo. As barras de escala são: (a) 5 ^ M, (B) a 200 uM e 100 uM (maior ampliação). Esta figura foi modificada e usada com permissão de Wiley 47. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 5. Efeito das condições de plataformas ICC sobre a viabilidade e morfologia celular utilizando o ensaio Live / Morto qualitativa. Imagens confocal de células vivas / mortas coradas Huh-7.5 semeadas em andaimes ICC com diferentes revestimentos de concentração de colágeno (0, 20, 200 e 400 ng / ml) foram tomadas 1, 4, 7 e 10 dias após a semeadura. mancha verde (calceína) indica células vivas e mancha vermelha (Ethidium homodímero-1) indica morte celular. As barras de escala indicam a 200 uM. [Este valor foi modificado e utilizado com permissão de Wiley 47] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Efeitode condições do tipo plataforma e plataforma ICC sobre a viabilidade celular utilizando um ensaio de viabilidade celular colorimétrico quantitativo. Huh-7,5 células semeadas numa placa de cultura de poliestireno 2D e em andaimes ICC com diferentes revestimentos de concentração de colagénio (0, 20, 200, e 400 ug / ml ) foram submetidos ao ensaio colorimétrico de viabilidade MSR 1, 4, 7, 10, e 14 dias após a semeadura. A absorvância foi medida a 450 nm e os dados foram normalizados para o Dia 1 valores de absorvância. (n = 3, a média ± SD; ***: P <0,001 em comparação com MSR solução de leitura de absorvência para o dia 1 de cada grupo.) [Este valor foi modificado e utilizado com permissão de Wiley 47] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. Efeito de CCI Pcondição latform em Huh-7.5 função usando concentração análise ELISA de albumina segregada. Albumina ELISA foi utilizado para quantificar a secreção de albumina sérica em meios recolhidos a partir de andaimes ICC celulares carregados com diferentes revestimentos de concentração de colágeno (0, 20, 200 e 400 ug / ml) nos dias 1, 4, 7, 10 e 14 após a semeadura. Cada ponto de dados representa uma média de 3 amostras e é normalizada para o número de células encontrado usando o ensaio de viabilidade celular colorimétrico MSR e a curva padrão criada (n = 3, média ± DP). [Este valor foi modificado e utilizado com permissão de Wiley 47] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8. Efeito da condição de plataforma de ICC em Huh-7.5função usando análise da expressão do gene.-PCR em tempo real quantitativo foi usado para o perfil de expressão de genes de células cultivadas em andaimes ICC com diferentes revestimentos de concentração de colagénio (0, 20, 200, e 400 ug / ml) nos dias 1, 4 e 7 depois semeadura. Três proteínas de junção foram escolhidos, nomeadamente (A) a E-caderina, (B) N-caderina, e (C) integrina beta 1. O mARN Os níveis de expressão foram normalizados por GAPDH. (n = 3, a média ± SD *:. P <0,05 **:.. P <0,01 em comparação com a expressão do gene do Dia 1 de cada grupo) [Esta figura foi modificada e usada com permissão de Wiley 47] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Andaimes de engenharia de tecidos estão a evoluir rapidamente para fornecer todas as pistas físicas e bioquímicas necessárias para regenerar, manter ou reparar tecidos para a aplicação da substituição de órgãos, estudando a doença, o desenvolvimento de drogas, e muitos outros 57. Na engenharia de tecidos do fígado, os hepatócitos primários humanos rapidamente perdem suas funções metabólicas uma vez isolados do corpo, criando uma grande necessidade de andaimes de engenharia e desenvolvimento de plataformas para manter a função hepática. A corrente em plataformas de cultura de hepatócitos in vitro têm utilizado diferentes biomateriais. A investigação nesta área tem sido centrada na imitando várias características do microambiente hepático in vivo, como configuração de proteína ECM 58,59, co-cultura 60,61, e micropatterning 62. No entanto, tem havido uma falta de andaimes com porosidade controlada e organização espacial elevada. A este respeito, a cultura de células platf ICC descritoORM, com as suas propriedades isotrópicas e alta organização, aborda este vazio. Nós demonstramos o cadafalso ICC PEGDA é uma plataforma adequada para a cultura de células de carcinoma hepatocelular, um tipo de célula modelo para hepatócitos, e que mais de revestimento de colágeno aumenta o comportamento das células 47.

Na prática, o tamanho da cavidade do andaime ICC pode ser sintonizada com o tamanho de microesferas PS. Além disso, o tamanho interligado do andaime pode ser controlado pelo tempo e temperatura do processo de recozimento; temperatura de recozimento mais elevada ou mais tempo de recozimento resulta em diâmetros maiores de interligação. Por isso, estes parâmetros devem ser seleccionados cuidadosamente quanto maiores diâmetros de interligação irão comprometer a estabilidade mecânica do andaime. Neste trabalho, esferas PS de diâmetro 140 um foram escolhidas para a cultura de células de hepatócitos para limitar o tamanho das hepatospheres resultantes nos andaimes ICC nus a fim de prevenir a necrose de células no centro do elepatocyte esferóide. 63 Como mostrado na resultados representativos, a arquitetura 3D do andaime ICC permite maior proliferação de células Huh-7.5 em comparação com cultura de células de placa de poliestireno 2D. Os resultados sugerem que as cavidades interconectadas uniformes do andaime ICC permitir a interacção célula-célula e eficiente diafonia entre as cavidades.

A concentração de colagénio do tipo I revestindo a morfologia das células afectadas, viabilidade e função. Colágeno tipo I é uma proteína ECM importante encontrada no espaço de Disse, uma área adjacente aos hepatócitos 64. Não adesiva, nus andaimes ICC PEGDA promovido hepatócitos formação esferóide que, um revestimento de colagénio rendeu o andaime bioactivo e Huh-7,5 células aderiram à superfície do andaime, utilizando a grande área de superfície presentes. O ECM andaimes ICC revestidos por proteína melhorada tanto a interacção célula-célula, bem como a interacção célula-ECM, como indicado pela regulada positivamente E-caderina, N-cadheexpressão dos genes b1 rin e integrinas, que desempenham um papel na regulação do comportamento celular. colágeno tipo I concentrações de 200 ug / ml e 400 ug / ml foram adequados para Huh-7.5 cultura, melhorando a proliferação celular e secreção de albumina.

A principal limitação representada pela fabricação ICC é o controle sobre o alinhamento esfera PS e número ao fazer as treliças. A evaporação rápida de etanol ao carregar as esferas para dentro dos moldes podem causar diferentes densidades esfera, resultando em um número diferente de camadas de esferas em reticulados. No entanto, a utilização de uma solução menos voláteis como a água também tem desvantagens. É levar a CCs menos ordenadas no sistema de montagem flutuante 65, e existe uma elevada possibilidade de uma superfície altamente andaime-curvada devido à formação de meniscos. Outra limitação é o alinhamento adequado das esferas nos moldes para garantir a máxima eficiência das interconexões. A etapa de agitação (passo 1.1.5 e 1.1.6) é, portanto, critical para a técnica de fabricação de ICC. Se um bom arranjo não é observado por microscopia, repita o passo 1.1.6.

No geral, o andaime ICC PEGDA, com o seu protocolo de fabricação simples, pode ser usado convenientemente como uma plataforma para aplicações de cultura de células em 3D. Bioativação do andaime nua com proteínas aumenta ainda mais as suas características funcionais 14. Neste artigo, fazemos sob medida o protocolo de fabricação para e escolheu ensaios de avaliação de células para aplicação em engenharia de tecidos do fígado. No entanto, uma gama de tipos de células podem ser cultivadas dentro deste andaime único e cada tipo de célula pode exigir a alteração de certos parâmetros. Também camadas de complexidade em termos de múltiplos tipos de proteínas ECM, co-cultura e cultura dinâmica utilizando um biorreator podem ser adicionados para melhorar o desempenho da célula ainda mais. Esta plataforma tem o potencial para ajudar na regeneração de tecidos e de desenvolvimento de medicamentos, para o estudo de doenças de fígado, e a ser utilizado para transplante.

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Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer o apoio de um Research Foundation Fellowship Nacional (NRF -NRFF2011-01) e Competitiva Programa de Pesquisa (NRF-CRP10-2012-07).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR tube Axygen Scientific PCR-02D-C Boil-proof
Gorilla Glue Gorilla Glue, Inc. Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides VWR 631-1575 Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres Fisher Scientific TSS#4314A Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol Merck 1.00983.1011 absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath Elma S10H Equiment
Furnace Nabertherm N7/H Equipment
200 µl pipette tip Axygen Scientific T-210-Y-R-S
Rocking shaker VWR 444-0142
Polyethylene Glycol (PEG) Merck 1.09727.0100 Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge Beckman Coulter 392932 Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate Laysan Bio ACRL-PEG-SVA-3400-1g Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma Aldrich 410896
Vortex VWR 58816-123 Equipment
Microcentrifuge Eppendorf 5404 000.413
Paraffin Film Parafilm M  #PM996 Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight Blaze Technology  120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF) Merck 107025
Orbital shaker Heidolph 543-123120-00-5
Collagen Type I Sigma Aldrich C3867-1VL From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 20012-027 16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde VWR 43368.9M Equipment
Freezone 4.5 freeze drier Labconco 7750020 Equipment
Sputter coater Jeol Ltd. JFC-1600 Equipment
Scanning Electron Microscope Jeol Ltd. JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Life Technologies A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)  Bio-Rev PTE LTD 3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		 Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S) Life Tchnologies 15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes Sigma Aldrich CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators Thermofisher Scientific 371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer Thermofisher Scientific 02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Life Technologies L3224 
CCK-8 Assay Dojindo Laboratories CK04-11 Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader  Tecan
Albumin Human ELISA kit Abcam ab108788
Triton X-100 Bio-Rad #1610407
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) Santa Cruz Biotechnology sc-53850; sc-271605
DAPI Life Technologies D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin Life Technologies A34055
Trizol Life Technologies 15596-026
Chloroform VWR 22706.326
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
DPEC water Thermofisher Scientific AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer Thermofisher Scientific ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix  Bio-Rad Laboratories 1708840
SYBR select Master Mix for CFX Life Technology 4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH 

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