This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Способность поддерживать функцию гепатоцитов в пробирке, для целей тестирования цитотоксичности ксенобиотиков, изучение вирусной инфекции и разработки лекарств , нацеленных на печень, требует платформу , в которой клетки получают соответствующие биохимические и механические сигналы. Последние ткани печени инженерные системы использовали трехмерные (3D) каркасы, состоящие из синтетических или натуральных гидрогели, учитывая их высокую задержку воды и их способность обеспечивать механические стимулы, необходимые клетками. Там было растущий интерес к перевернутой коллоидный кристалл (ICC) эшафот, новейшая разработка, которая обеспечивает высокую пространственную организацию, однотипны и взаимодействие гетеротипичной клеток, а также матрицу взаимодействия (ECM) клеточно-внеклеточный. В данном случае мы опишем протокол для изготовления строительных лесов ICC с использованием поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA) и метод выщелачивания частиц. Если коротко, то решетка изготовлена из частиц микросфер, после чего предварительно polymeR раствор добавляют, правильно полимеризуется, а частицы затем удаляются, или выщелоченные, с использованием органического растворителя (например, тетрагидрофуран). Растворение результатов решетки в сильно пористом помост с контролируемым размером пор и interconnectivities, которые позволяют медиа достичь клетки более легко. Эта уникальная структура позволяет большую площадь поверхности для клеток придерживаться, а также легкой связи между порами, а также возможность покрыть ICC эшафот PEGDA с белками также показывает заметное влияние на производительность клеток. Мы анализируем морфологии эшафот, а также гепатокарциномой клетки поведения (Хух-7,5) с точки зрения жизнеспособности и функции для изучения влияния структуры ICC и ECM покрытий. В целом, этот документ содержит подробный протокол формирующейся строительных лесов, который имеет широкое применение в тканевой инженерии, особенно печени тканевой инженерии.
Печень является насыщена сосудами орган с множеством функций, в том числе детоксикацию крови, метаболизма ксенобиотиков, а также при производстве сывороточных белков. Ткань печени имеет сложную трехмерную (3D) микроструктуру, состоящий из нескольких типов клеток, желчные канальцы, синусоиды и зон различного состава BIOMATRIX и различных концентраций кислорода. Учитывая эту сложную структуру, было трудно создать правильную модель печени в пробирке 1. Тем не менее, существует растущий спрос на функционал в моделях пробирке хостинг гепатоцитов человека в качестве платформ для тестирования лекарственной токсичности 2 и изучение заболеваний , связанных с печенью 3.
Текущий ткани печени инженерные платформы упростили сложность печени путем выделения одного или сосредоточив внимание на некоторые из них, параметров печени, а именно совместное культивирование клеток 4, биохимический состав гопал микросреды 5, динамика 6,7 потока и конфигурация биоматрицы 8. Конфигурация биоматрицы можно разбить на такие параметры, как каркасные материалы, состав внеклеточного матрикса (ЕСМ) белки, матрица жесткости, а также конструкции и структуры строительных лесов. Там было увеличение инженерных исследований тканей с использованием синтетических гидрогели, особенно поли (этиленгликоль) (ПЭГ) гидрогели 9, принимая во внимание возможность настраивать механические свойства, биологическая активность и скорость разложения гидрогеля в. Что касается печени исследований , связанных, биосовместимый гидрогель был применен для исследования вирусной инфекции заболевания печени 3. В конструкции платформы гепатоцитов, многочисленные исследования использовали гепатоцитов сэндвич культур 10,11 и клеток герметизацию в гидрогель 12,13 , чтобы обеспечить 3D окружающей среды и клеток-ECM и взаимодействия клетка-клетка , которые имеют важное значение , чтобы имитировать в естественных условиях микросреды. ХауВер, эти платформы не обладают высокой степенью контроля и пространственной организации, что приводит к неравномерной свойств через строительные леса 14.
Перевернутый кристалл коллоидный (ICC) 14 строительных лесов является высоко организованной 3D эшафот для культивирования клеток , которая была впервые введена в начале 2000 – х годов. уникальная структура эшафот можно отнести к простому процессу изготовления с использованием коллоидного кристалл, упорядоченную решетку коллоидных частиц переменного диаметра. В кратком изложении, чтобы подвести итог процесса, частицы аккуратно уложенные и отжигают с использованием тепла, образуя решетку. Выщелачивание этой решетки, органическим растворителем, в полимеризованной приводит гидрогелевых в шестиугольника упакованная сферических полостей 15 с высокой площадью поверхности. Это высокоупорядоченную подмости были ранее с обеих синтетических и натуральных материалов, в том числе , но не ограничиваясь ими поли (акриламид) , 16-21, поли (молочной-гликолевой кислоты) 15,22-30, Поли (этиленгликоль) , 31,32, поли (2-гидроксиэтилметакрилат) 21,33-35, и хитозан 36-39. Каркасы из ICC не обрастания материалов , как правило, способствуют клеточные сфероидов внутри полостей 14,23,40. Несколько типов клеток было показано , что успешно пролиферировать, дифференцироваться и функционировать в рамках этой конфигурации, в том числе хондроцитами 41, костный мозг стромальные клетки 42, и стволовые клетки 43,44. Что касается гепатоцитов, были проведены исследования с МТП каркасах из Na 2 SiO 3 и поли (акриламид), но не PEG. С помощью простых стратегий биоконъюгации (т.е. амин связи через EDC / NHS), ECM белки-сопряженными каркасы ПЭГ-основе могут быть изготовлены, которые могут доказать , сайты связывания более клеток , чтобы быть более в естественных условиях , как окружающая среда и улучшать функцию печени.
В этой рукописи и связанной с ним видео, мы подробно изготовление эшафот ICCс использованием поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA) гидрогеля и полистирольных микросфер решетку, оптимизированный для гепатокарциномой (Хух-7,5) культуры. Показано, различия между голыми в целом неадгезивных каркасы ICC PEGDA и коллагеновой покрытием PEGDA МТП эшафот с точки зрения топологии строительных лесов и производительности клеток. Жизнеспособность клеток и функции измеряются качественно и количественно оценить поведение клеток Huh-7.5.
Тканевая инженерия каркасы быстро развиваются , чтобы обеспечить все физические и биохимические сигналы , необходимые для восстановления, поддержания или ремонта тканей для применения замены органов, изучение болезней, разработки лекарств, и многие другие 57. В печени тканевой и?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность поддержку от Национального исследовательского фонда стипендий (NRF -NRFF2011-01) и конкурентоспособных исследований программы (СРН-CRP10-2012-07).
0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
DAPI | Life Technologies | D3571 | |
Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
Chloroform | VWR | 22706.326 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
Primers (to be chosen) | |||
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |