La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado
Summary
This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
Abstract
La capacidad para mantener la función de los hepatocitos in vitro, para el propósito de probar la citotoxicidad xenobióticos ', el estudio de la infección por virus y el desarrollo de fármacos dirigidos en el hígado, requiere una plataforma en la que las células reciben señales bioquímicas y mecánicas adecuadas. sistemas recientes de ingeniería de tejidos de hígado han empleado andamios tridimensionales (3D) compuestas de hidrogeles sintéticos o naturales, dado su alta retención de agua y su capacidad de proporcionar los estímulos mecánicos necesarios por las células. Ha habido un creciente interés en el andamio invertida cristal coloidal (ICC), un desarrollo reciente, que permite a la organización espacial alta, homotipica e interacción celular heterotıpica, así como la matriz de interacción célula extracelular (ECM). En este documento, se describe un protocolo para fabricar el andamio ICC utilizando poli diacrilato (etilenglicol) (PEGDA) y el método de lixiviación de partículas. En pocas palabras, una celosía está hecho de partículas de microesferas, después de lo cual un pre-de poSe añade solución r, adecuadamente polimeriza, y las partículas se retiran, o lixiviado, usando un disolvente orgánico (por ejemplo, tetrahidrofurano). La disolución de los resultados de celosía en un andamio altamente poroso con tamaños y interconectividades que permiten los medios de comunicación para llegar a las células más fácilmente de poros controlados. Esta estructura única permite a área de superficie alta para que las células se adhieren a, así como fácil la comunicación entre los poros, y la capacidad de recubrir el andamio ICC PEGDA con proteínas también muestra un efecto marcado en el rendimiento de la célula. Se analiza la morfología del esqueleto, así como el hepatocarcinoma celular (Huh-7.5) el comportamiento en términos de viabilidad y la función de explorar el efecto de la estructura de la CPI y revestimientos de ECM. En general, este documento proporciona un protocolo detallado de un andamio emergente que tiene amplias aplicaciones en la ingeniería de tejidos, especialmente la ingeniería de tejidos del hígado.
Introduction
El hígado es un órgano altamente vascularizado con una multitud de funciones, incluyendo la desintoxicación de la sangre, el metabolismo de xenobióticos, y la producción de proteínas séricas. El tejido del hígado tiene una microestructura tridimensional compleja (3D), que consta de múltiples tipos de células, canalículos biliares, sinusoides, y zonas de diferente composición biomatriz y diferentes concentraciones de oxígeno. Dada esta estructura elaborada, ha sido difícil crear un modelo de hígado adecuado in vitro 1. Sin embargo, hay una creciente demanda de funcional en modelos in vitro de alojamiento hepatocitos humanos como plataformas para la toxicidad del fármaco de prueba 2 y el estudio de enfermedades asociadas con el hígado 3.
Plataformas de ingeniería de tejido hepático actual han simplificado la complejidad del hígado mediante el aislamiento de uno, o concentrarse en unos pocos, de los parámetros del hígado, es decir, co-cultivo de células 4, la composición bioquímica de la zonal microambientes 5, la dinámica de flujo de 6,7 y la configuración de la biomatriz 8. La configuración de la biomatriz se puede dividir en parámetros tales como materiales de andamiaje, la composición de proteínas de la matriz extracelular (ECM), la rigidez de la matriz, así como el diseño y la estructura del andamio. Ha habido un aumento en los estudios de ingeniería de tejidos utilizando hidrogeles sintéticos, especialmente poli (etilenglicol) (PEG) hidrogeles 9, dada la capacidad de sintonizar propiedades mecánicas, bioactividad, y la velocidad de degradación del hidrogel. En cuanto a la investigación relacionada con el hígado, se aplicó el hidrogel biocompatible para estudiar la infección por virus de la enfermedad hepática 3. Como diseño de la plataforma de hepatocitos, numerosos estudios han utilizado cultivos sándwich de hepatocitos 10,11 y encapsulación de células dentro de un hidrogel 12,13 para proporcionar el entorno 3D y célula-ECM y la interacción célula-célula que son esenciales para imitar en el microambiente vivo. Howeembargo, estas plataformas no poseen un alto grado de control y organización espacial, que conduce a propiedades no uniformes a través del andamio 14.
El cristal coloidal invertida (CPI) 14 andamio es un andamio 3D altamente organizada para el cultivo celular que se introdujo por primera vez en la década de 2000. estructura única del andamio se puede atribuir al proceso de fabricación sencillo que utiliza un cristal coloidal, un enrejado ordenado de partículas coloidales de diámetro variable. En pocas palabras, para resumir el proceso, las partículas están bien ordenados y recocidas utilizando calor para formar un enrejado. La lixiviación de esta celosía, por un disolvente orgánico, en un polimerizados resultados de hidrogel en cavidades esféricas hexagonal empaquetados 15 con alta área superficial. Este andamio altamente ordenada se ha hecho previamente con ambos materiales sintéticos y naturales, incluyendo, pero no limitado a, poli (acrilamida) 16-21, poli (láctico-co-ácido glicólico) 15,22-30, Poli (etileno glicol) 31,32, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) 21,33-35, y quitosano 36-39. Andamios ICC hechos de materiales no-incrustantes tienden a promover esferoides celulares dentro de las cavidades 14,23,40. Múltiples tipos de células se ha demostrado que la proliferación de éxito, diferenciar y función dentro de esta configuración, incluyendo condrocitos 41, células estromales de médula ósea 42, y células madre 43,44. En cuanto a los hepatocitos, se han realizado estudios con andamios ICC hechos de Na 2 SiO 3 y poli (acrilamida), pero no PEG. Con las estrategias bioconjugation simples (es decir, a través de acoplamiento de aminas EDC / NHS), andamios a base de PEG ECM proteínas conjugadas se pueden fabricar, que puede resultar más sitios de unión de células a ser más in vivo como el medio ambiente y mejorar la función hepática.
En este manuscrito y el vídeo asociado, detallamos la fabricación del andamio CPIutilizando poli diacrilato de hidrogel (etilenglicol) (PEGDA) y una celosía de poliestireno de microesferas, optimizado para hepatocarcinoma (Huh-7.5) cultura. Se demuestra las diferencias entre los andamios ICC en general no adhesivos desnudos PEGDA y la PEGDA andamio ICC revestido con colágeno en términos de topología de andamio y rendimiento de la célula. La viabilidad celular y la función se miden cualitativa y cuantitativamente para evaluar el comportamiento de células Huh-7.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Andamios de ingeniería de tejidos están evolucionando rápidamente para proporcionar todas las señales físicas y bioquímicas necesarias para regenerar, mantener o reparar los tejidos para la aplicación de la sustitución de órganos, el estudio de la enfermedad, el desarrollo de fármacos, y muchos otros 57. En la ingeniería de tejidos de hígado, los hepatocitos primarios humanos pierden rápidamente sus funciones metabólicas una vez aislados del cuerpo, creando una gran necesidad de andamios de inge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo de una beca de la Fundación de Investigación Nacional (NRF -NRFF2011-01) y el Programa de Investigación Competitiva (NRF-CRP10-2012-07).
Materials
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
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