This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
, Ksenobiyotiklerin 'sitotoksisite testi virüs enfeksiyonu okuyan ve karaciğer hedefleyen ilaçların geliştirilmesi amacıyla, in vitro hepatosit fonksiyonunu korumak için yeteneği, hücreler uygun biyokimyasal ve mekanik ipuçları aldığınız bir platform gerektirir. Son karaciğer doku mühendisliği sistemleri, yüksek su tutma ve hücreler tarafından ihtiyaç duyulan mekanik uyarıcılara sağlamak için kendi özellikleri göz önüne alındığında, sentetik ya da doğal hidrojeller oluşan üç boyutlu (3D) iskeleleri kullanmışlardır. ters koloidal kristal (ICC) iskele artan bir ilgi olmuştur, yüksek uzaysal organizasyon, homotipik ve heterotypic hücre etkileşimi yanı sıra hücre dışı matriks (ECM) etkileşimi sağlayan bir son gelişme. Burada, poli (etilen glikol) diakrilat (PEGDA) ve partikül ayrıştırma yöntemi kullanılarak ICC iskele imal etmek için bir protokol açıklar. Kısaca, bir örgü mikrosfer parçacıklarından yapıldığı bir ön polimer daha sonraR solüsyonu doğru polimerize ilave edilir ve tanecikler daha sonra organik bir çözücü (ör tetrahidrofuran) kullanılarak kaldırılır veya yıkanarak ekstre edilir. Kontrollü gözenek boyutları ve ortam daha kolay hücrelere ulaşmasına izin interconnectivities ile çok gözenekli iskele kafes sonuçlarının çözünme. Bu benzersiz yapı hücreleri hem de kolay gözenekler arasındaki iletişim ve proteinlerle PEGDA ICC skafold, hücre performansı üzerinde belirgin bir etki gösterir kat yeteneği yapışması için yüksek bir yüzey alanı sağlar. Biz canlılığı açısından iskele morfolojisi yanı sıra hepatokarsinom hücre (Huh-7.5) davranış analiz ve ICC yapısı ve ECM kaplamaların etkisini araştırmak için çalışır. Genel olarak, bu kağıt doku mühendisliği geniş bir uygulama, özellikle karaciğer doku mühendisliği sahip gelişmekte olan bir iskele ayrıntılı bir protokol sağlar.
Karaciğer kan detoksifikasyon, ksenobiyotiklerin metabolizması ve serum proteinlerinin üretimi dahil fonksiyonları çok sayıda, bir çok kanlanan bir organdır. Karaciğer dokusu birden fazla hücre tipleri, safra kanalcıklarının, sinüzoidler ve farklı biyomatris kompozisyon ve farklı oksijen konsantrasyonlarına bölgelerinin içeren karmaşık bir üç boyutlu (3D) mikro-yapıya sahiptir. Bu ayrıntılı yapısı göz önüne alındığında, in vitro 1 uygun bir karaciğer model oluşturmak için zor olmuştur. Ancak, in vitro modellerde fonksiyonel test ilaç toksisitesi 2 platformları gibi insan hepatositleri barındırma ve karaciğer 3 ile ilişkili hastalıkların araştırılması için yükselen bir talep var.
Güncel karaciğer doku mühendisliği platformları zona, biyokimyasal bileşimi bir izole veya karaciğer parametreleri, bir kaç hücrelerinin 4 yani ko-kültür odaklanarak karaciğer karmaşıklığını basitleştirilmiş varl microenvironments 5, akış dinamikleri 6,7 ve biyolojik matris 8 yapılandırma. biyolojik matris konfigürasyonu, iskele malzemeler, hücre dışı matris (ECM) proteinlerin bileşimin, bir matris sertlik ve skafoldun tasarım ve yapı gibi parametreler ayrılabilir. Ayarlamak hidrojelin mekanik özellikler, biyo ve bozulma oranı yeteneği göz önüne alındığında, sentetik hidrojeller, özellikle poli (etilen glikol) (PEG) 9 hidrojeller ile doku mühendisliği çalışmaları bir artış olmuştur. Karaciğer ile ilişkili araştırma ile ilgili, biyouyumlu hidrojel karaciğer hastalığı 3 virüs enfeksiyonu çalışması için uygulanmıştır. Hepatosit platformu tasarım olarak, çok sayıda çalışma in vivo mikroçevresinin taklit etmek için gerekli olan 3D çevre ve hücre-ECM ve hücre-hücre etkileşim sağlamak için bir hidrojel 12,13 içindeki hepatosit sandviç kültürü 10,11 ve hücre kapsülleme kullanmışlardır. However, bu platformlar iskele 14 ile düzgün olmayan özellikleri lider, kontrol ve mekansal organizasyon yüksek derecede sahip değillerdir.
Ters kristal kolloidal (ICC) 14 iskelesi ilk 2000'lerin başında tanıtılan hücre kültürü için son derece organize 3D iskele olduğunu. skafold eşsiz yapısı kolloidal kristal, değişken çap koloidal parçacıkları sıralı kafes kullanarak basit imalat sürecine bağlı olabilir. Kısaca, süreç özetlemek, parçacıklar özenle düzenlenmiş ve bir kafes oluşturacak şekilde ısı kullanılarak tavlanır. Yüksek yüzey alanına sahip, altıgen şeklinde yerleştirilmiş küresel oyuk 15 bir polimerleştirilmiş hidrojel sonuçlarında bir organik çözücü, bu kafesin ayrıştırma,. Bu çok düzenli skafold, daha önce (akrilamid) 16-21, poli (laktik-ko-glikolik asit), poli 15,22-30 sınırlı, sentetik ve doğal malzemeler hem de yapılan da dahil olmak üzere, ancak edilmiştir, Poli (etilen glikol) 31,32, poli (2-hidroksietil metakrilat) 21,33-35 ve çitosan 36-39. Olmayan kirlenme malzemelerden yapılmış ICC iskeleleri boşlukların 14,23,40 içinde hücresel parçacıklarının teşvik etmek eğilimindedir. Çok sayıda hücre türleri başarıyla hücrelerin 43,44, prolifere Bu yapılandırma içinde ayırt ve işlevi, kondrositler 41, kemik iliği stromal hücreleri 42 de dahil olmak üzere, ve sap gösterilmiştir. Hepatosit ile ilgili olarak, çalışmalar, ICC Na 2 SiO 3 ve poli (akrilamid) imal iskeleler, ancak PEG ile gerçekleştirilmiştir. Basit bir bioconjugation stratejileriyle (örneğin, EDC / NHS ile amin birleştirme), ECM proteinleri konjuge edilmiş PEG-bazlı iskeleleri ortamı gibi in vivo olarak daha büyük olabilir ve hepatik fonksiyonu geliştirmek için daha fazla hücre bağlama sitesi ispat ki, imal edilebilir.
Bu yazıda ve ilgili videoda, detay ICC iskele yapımını biz(Huh-7.5), kültür hepatokarsinoma için optimize edilmiş poli (etilen glikol) diakrilat (PEGDA) hidrojel ve bir polistiren mikro-küre kafes kullanılarak. Bu iskele topoloji ve hücre performansı açısından, genel olarak yapışkan olmayan çıplak PEGDA ICC iskeleler ve kolajen kaplı PEGDA ICC iskele arasındaki farkları gösterir. Hücre canlılığı ve fonksiyonu Huh-7.5 hücre davranışını değerlendirmek için kalitatif ve kantitatif olarak ölçülür.
Doku mühendisliği iskeleleri hızla tüm yeniden korumak veya ilaçlar, hastalığın okuyan gelişen organ değiştirme uygulaması için dokuları onarmak için gerekli olan fiziksel ve biyokimyasal ipuçları, ve diğerleri 57 sağlamak için gelişmektedir. karaciğer doku mühendisliği, birincil insan hepatositler hızla kez vücuttan izole onların metabolik fonksiyonları, mühendislik iskeleleri için büyük bir ihtiyaç yaratmak ve karaciğer fonksiyon korumak için platformlar geliştirme kaybed…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Ulusal Araştırma Vakfı Bursu (NRF -NRFF2011-01) ve Rekabet Araştırmaları Programı (NRF-CRP10-2012-07) dan destek için teşekkürlerimizi sunarız.
0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm |
Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3×10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
200 µL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) – Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
APC49‐Huh ‐7.5 Cell Line | Apath | ||
100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37°C, 5% Humidity |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
DAPI | Life Technologies | D3571 | |
Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
Chloroform | VWR | 22706.326 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
Primers (to be chosen) | |||
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |