An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.
Dendrittiske celler (DCS) er viktig for å initiere immunresponser, blant annet gjennom sin evne til å tilegne seg og shuttle antigen til drenering lymfeknute (DLN). Mobilisering av DC til DLN er kompleks og er fortsatt ikke helt klarlagt i løpet av infeksjon. Beskrevet heri er bruken av en innovativ, enkel analyse som er avhengig av fluorokrom 5- og 6-karboksyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) for å spore migrering av DC i løpet av fotputen infeksjon med Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) i C57BL / 6 mus. Denne analysen gjør det mulig for karakterisering av hud DC undergrupper som aktivt flytter til drenering, popliteal LN i respons til BCG. Denne protokollen stammer fra en BCG modell hvor hud trekkende DC ble identifisert ved strømningscytometri. Analysen er elskverdig til studiet og identifisering av DC eller andre celler som hjem til popliteal LN etter inokulering av mikrober, deres metabolitter eller andre betennelsesstimuli i fotbladet, og følgelig for å studere faktorer som regulerer den migrering av disse cellene.
DC lokalisert i kroppsoverflater forstand mikrober eller deres produkter, og dermed mobilisere via lymfekar til drenering LN (DLN) 1,2. Denne flyttingen er nødvendig for transport av mikrobiell antigen til DLN og den påfølgende grunning av immunresponser mot invaderende mikroben. Faktisk, blokade eller svikt i DC for å migrere fra infisert vev til DLN demper T-celle respons 3-5. Følgelig analyser konstruert for å spore migrasjon på enkeltcellenivå er nyttige for å bidra til å tilskrive vandringsfunksjon til en gitt like delsett.
Det er en stor mengde data om mobilisering av hud DC til DLN. Sistnevnte står for mye av kunnskapen om DC migrasjon fra betente eller infiserte områder 2. Dette er ikke overraskende ettersom huden huser en stor bestand av DC og er en svært tilgjengelig overflate for eksperimentering i laboratoriet mus. Flere teknikker har derfor blitt utviklet for å vurderemigrasjon av murine DC fra huden til DLN to. FITC hud maleriet er den desidert mest brukte tilnærmingen. I dette assay den fluorkrom fluorescein-5-isotiocyanat (FITC) ble fremstilt i en blanding med aceton og en kontakt irriterende. Dette cocktail påtrykkes hårfrie eller barbert hud og akkumulering av FITC-merkede celler i sin tur er analysert i DLN. Migrasjon kan også bli studert ved å injisere huden med fluorokrom-merket nano- eller mikropartikler, som muliggjør sporing av fagocytiske celler som har internalisert fluorescerende partikler i huden. Lymfekar kan også cannulated å direkte trekke migrerer DC fra lymfe. Dette er imidlertid teknisk krevende, særlig hos mus. Antallet DC erholdt for påfølgende analyser er også en begrensende faktor.
På tross av mange tidligere studier på huden DC migrasjon, er det fortsatt et sparsomt med informasjon om hud DC mobilisering til DLN følgende vaccinasjon med Bacille Calmette-Guérin (BCG), den levende, svekket stamme av Mycobacterium bovis brukes til å vaksinere mot M. tuberkulose. BCG er vaksinert i huden, forårsaker en begrenset infeksjon som utløser en T hjelpercelle type 1 reaksjon. Både DC sub-populasjoner som mobiliserer til DLN fra BCG-infisert hud og de faktorer som regulerer deres migrasjon under denne prosessen ikke er fullt ut forstått. I lys av det ovenfor, ble en enkel, men ny fremgangsmåte utviklet hvor fluorokrom 5- og 6-karboksyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) injiseres in situ for å spore migrering av DC inn i DLN 3. C57BL / 6 mus injiseres i den bakre fotpute med et inokulum av BCG og dagen før avlivning, ble dyrene injisert i den samme fotputen med en høy konsentrasjon av CFSE. Tjuefire timer senere avlives dyrene og drenering popliteal LN (PLN) fjernet og klargjort for flowcytometri. Denne analysen gjør det mulig for identification av celler som migrerer over natten fra fotputen huden til DLN (figur 1).
Videre kan genet målrettet mus brukes til å identifisere faktorer som kreves for cellene å mobilisere til DLN. Ved hjelp av denne analysen, har forfatterne av denne rapporten tidligere funnet at EpCAM lav CD11b høy trekkfugl hud DCs transport BCG til DLN i en prosess regulert av Interleukin-1 reseptoren og den intracellulære adapter molekyl MyD88 tre. Protokollen for dette CFSE basert migrasjon analyse som stammer fra den ovennevnte rapport fra Bollampalli et al. 3 hvor strømningscytometri ble anvendt for å detektere og analysere trekk hud DC, er beskrevet her. Fordelene og ulempene ved denne analysen blir diskutert.
FBT er spesialiserte antigenpresenterende celler som kan svare på mikrobiell utfordring på kroppsoverflater ved å kjøpe mikrobiell antigen og migrere til DLN via lymfekar. Der DC presentere dette antigenet til T-celler på en måte som driver primære T-celle responser. Prosessen med DC-migrering fra vev til DLN er derfor meget viktig for å forstå hvordan en produktiv T-cellerespons blir initiert. Metoder for å måle DC migrasjon er derfor svært nyttig i utfolder de ovennevnte.
En musemodell ble anvendt for å studere hud DC migrering til DLN etter infeksjon med BCG, en levende vaksine som injiseres klinisk i huden. I tråd, er BCG injiseres i hind fotbladet å etterligne dette kutan ruten for vaksinasjon. En enkel analyse ble utviklet og dermed innlemmet til denne modellen for å undersøke overføringen av hud DC sub-populasjoner fra BCG vaksinen nettstedet i fotbladet huden til drenering PLN. Denne protokollen relies på å injisere fluorokrom CFSE inn i samme fotblad som tidligere har mottatt BCG og deretter isolering av det drenerende PLN 24 timer senere for å analysere tilstedeværelsen av CFSE-merkede celler ved flow cytometri. Selv om det ikke er beskrevet i protokollen, kan LNS fra dette oppsettet også fremstilles for analyse ved konfokal mikroskopi for å undersøke migrasjonsprosesser slik som plassering av trekklegemer i LN 3. Videre har lignende resultater på BCG-utløst huden DC migrasjon er oppnådd ved hjelp av både BCG Pasteur 1173P2 3 og BCG SSI 1331 14.
CFSE er vanlig å merke celler in vitro og for å spore slike merkede celler in vivo etter celle overføringer 15. I dagens protokollen skjønt, ble det brukt til direkte merke hudceller in situ. Den molekylære basis for CFSE merking er lik FITC, som også er en amin-reaktivt fluorescerende fargestoff. CFSE er imidlertid å foretrekke fremfor FITC for konjugering som det CreAtes svært stabile carboxamide obligasjoner 16. Videre er CFSE meget permeabel membran og passivt diffunderer inn i cellene. Når du er inne, danner den intracellulære amin (fluorescerende) konjugater som er beholdt i den merkede cellen 15.
Den CFSE basert migrasjon analyse utviklet av forfatterne gjør identifisering av celler flytting fra huden til DLN innenfor en 24-timers periode i respons til BCG. Den måler dermed akutt migrasjon under en definert tidsramme og gjør det mulig å undersøke muligheten for forskjellige, injisert stimuli for å utløse migrasjon. Denne analysen er forskjellig fra den klassiske teknikken for FITC hud maleri, som måler en kumulativ migrering hendelse utløst av kutan, topisk påføring av en kontakt-sensibiliserende middel. Således kan det CFSE basert migrasjon analysen anvendes for å identifisere trekkende hud DC eller andre celler som huser den PLN etter injeksjonen av mikrober, mikrobielle produkter eller andre inflammatoriske stimuli i footpad. Faktisk, både nøytrofile granulocytter og γ: har S T-celler er vist å flytte fra huden til DLN i respons til BCG 17,18. Faktisk ble analysen nylig brukt i en co-infeksjon innstillingen for å vise at en gut-lokalisert nematode infeksjon kan dempe BCG-utløst huden DC migrasjon til DLN 14.
DC migrasjon ofte vurderes mellom 24-72 timer i FITC hud maleri siden FITC-merket DC er vanskelige å oppdage fire til fem dager etter maleri 19. Tap av CFSE signal på merket DC er ikke et problem i analysen som presenteres her siden analyse av migrasjon var begrenset til 24 timer; Årsaken bak dette er at forfatterne ønsket å spesifikt studere "over natten" migrasjon hendelser. Andre som er interessert i denne analysen er imidlertid oppfordres til å undersøke tidligere eller senere tidspunkter for CFSE-basert sporing. Dessuten, siden CFSE innføres ved injeksjon kan det gis ved en hvilken som helst definert tid. Denne fleksibiliteten tillot enuthors å vurdere DC migrasjon mellom dag 5 og 6 etter BCG-infeksjon (figur 2C) 3. Injisering CFSE kan potensielt begrenser celletypene tilgjengelig in situ for merkingsreaksjonen. For eksempel Langerhans-celler (LCS), som er DCS som befinner seg i topplaget av huden, epidermis, migrere dårlig respons på BCG i CFSE basert migrasjon analysen (figur 3) 3. Men under FITC hud maleri, DC plassert i dermis, laget under overhuden, er lett merket og migrere til DLN raskere enn LCS 20,21. Dette tyder på at cellene kan bli fluorkrom-merket uten nødvendigvis ønsker å lokalisere til det lag av huden hvor merking oppløsningen påføres.
Som modell for BCG-infeksjon, gir musen øret en bona fide intradermal ruten for vaksinasjon som er mer i tråd med den kliniske administrasjonen av BCG som tuberkulose vaksine. footpad injeksjon på den annen side, er sannsynligvis en kombinasjon av de intradermal og subkutant. Når det er sagt, det krever dyktighet og opplæring til riktig og reproduserbart levere BCG til dermis 22, så det kan ikke alltid gis i klinisk praksis virkelig intradermal men heller subkutan eller en kombinasjon av begge. Som en vaksinasjon nettstedet fotbladet har to veldig klare fordeler over øret som fortjener å nevne. Først blir immunresponsen konsentrert til tømme- PLN følgende en footpad injeksjon og dette letter behandlingen av responser. Forfatterne av denne rapporten fant PLN å være den første og viktigste LN drenering fotbladet tre. Andre har foreslått delt drenering mellom knehasen og subiliac LNS etter injeksjon av Evans blue 23. Ikke desto mindre, i forhold til øret, er det mer enn ett øre DLN hos mus, og disse kan ikke være regelmessig til stede eller lett å lokalisere 24. Sistnevnte klart introduserer en Liability i studier som søker å undersøke responser i DLN. For det andre, kan større mengder være podet inn i fotputen (minst 10 – 50 ul) i forhold til øret. Dette i sin tur både reduserer ansvar for å innføre store endringer i lymfatisk flyt og for å måtte jobbe med svært små injeksjonsvolumer, som er i seg selv et problem når det kommer til inoculating store mengder mykobakterier. I øret hvor injeksjonsvolumer må være liten (1-10 ul), kan til og med 5 pl forandre lymfatisk flyt og potensielt tvinge frem en større mengde av det injiserte materiale direkte inn i DLN på en ukontrollert måte. Det er derfor viktig å ta hensyn til injeksjonsvolumer. Dette er spesielt viktig i eksperimenter adressering bidraget av celler i frakte bakterier til LN. I BCG fotpute-modellen, kan noen BCG ha nådd DLN i fravær av cellulær transport. Dette er basert på den observasjon at man likevel kan detektere BCG i DLN av mus hvor cellemigrasjon fra fotenpad ble helt ablated ved lokal injeksjon av kikhoste toksin tre. Hvorvidt dette er en indikasjon på at BCG kan få direkte tilgang lymfekar og nå DLN i en virkelig celle-fri måte gjenstår å fastslå, siden det ikke kan utelukkes at mykobakterier i dette tilfellet der det er gitt adgang til lymfekar med makt av den injiserte volumet.
Et praktisk hensyn til immuniseringer i øret eller fotpute er at dyrene har til å være tilstrekkelig immobilisert for injeksjoner kan utføres på riktig måte, og på en reproduserbar måte. Isofluran gass er beskrevet i den aktuelle protokoll som en metode for å holde dyrene i forberedelse for fotputen injeksjoner. De relativt rask induksjon og gjenvinningstider for isofluran-bedøvelse mediert gjør det til en populær metode, men i likhet med andre anestetika, påvirker fysiologi, som kan interferere med eksperimentelle resultater 25. Ja, både flyktige og injiserbare bedøvelse redusere lymfe flyt ved å avskaffefrivillige muskelbevegelser, redusere muskel tone, og avtagende lymphangion sammentrekning 26. Videre har en 5-fold reduksjon i migrasjon til DLN av DC adoptiv overført i fotbladet blitt rapportert i bedøvede dyr 27. Gitt de ovennevnte, og ettersom håndteringsprosedyrer før bedøvelse vil sannsynligvis føre til mer stress for dyrene enn injeksjonen selv, noe som er både hurtig å administrere og krever ikke en gjenvinningstrinn, muligheten til tilstrekkelig holde dyret uten bedøvelse bør bli vurdert. En mus rainer tilpasset for fotbladet injeksjoner, hvor dyret hurtig kan bringes til en immobilisert stilling og inokulert i fotbladet i løpet av 30 til 40 sekunder ville være ideelt å injisere mus i den bakre fotpute uten å endre andre aspekter av sin fysiologi i prosessen , og vil være svært nyttig i studier adressering celle migrasjon gjennom lymfekar.
Som konklusjon, denne rapportenfremhever en ny protokoll for sporing hud DCs under mobilisering til DLN ved hjelp av en analyse som overvåker migrasjon løpet av en definert 24-timers vindu. Dette CFSE basert migrasjon analysen tillater påvisning og analyse av migrerende celler ved flowcytometri, som angitt her, så vel som ved konfokal mikroskopi tre. Det gir en fleksibel plattform for å studere en rekke injisert stimuli og deres evne til å utløse DC migrasjon, og viktigst av alt, kan brukes til å spore ikke bare DC, men også andre bestander flytter fra huden til DLN under forskjellige eksperimentelle innstillinger.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Karolinska Institutet, a project grant from the Swedish Research Council VR (Dnr 2014-2794) and a KID Doctoral Grant from Karolinska Institutet (All to A.G.R). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
EDTA | In house | ||
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
PBS | In house | ||
Filtered water | In house | ||
BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
6 well plates | TPP | 92006 | |
15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
Univentor 400 anaesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Monojet 3/10ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
Antibody | Clone | Company | |
Antibodies | |||
MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
CD103 | 2E7 | Biolegend | |
CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
CD86 | GL-1 | Biolegend |