Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.
Regenerativ medisin som mål å konstruere materialer for å erstatte eller gjenopprette skadede eller syke organer. De mekaniske egenskapene til slike materialer bør etterligner de humane vev de tar sikte på å erstatte; for å tilveiebringe den nødvendige anatomisk form, må materialene være i stand til å tåle de mekaniske krefter som de vil oppleve når implantert på det defekte område. Selv om de mekaniske egenskapene til vev-konstruerte stillaser er av stor betydning, mange menneskelige vev med restaurering med konstruerte materialer har ikke vært fullt biomekanisk karakterisert. Flere trykk- og strekk-protokoller er rapportert for evaluering av materialene, men med store variabiliteten er det vanskelig å sammenligne resultater mellom studier. Ytterligere komp studiene er ofte ødeleggende natur mekanisk testing. Mens en forståelse av vev svikt er viktig, er det også viktig å ha kjennskap til de elastiske og viskoelastiske egenskaper under mer Physiological lasteforhold.
Denne rapporten tar sikte på å tilveiebringe en minimal ødeleggende protokoll for å evaluere de trykk- og strekkegenskaper av humane bløtvev. Som eksempler på denne teknikk blir den strekkprøving av hud og trykktesting av brusk rives. Protokollene kan også være direkte påført på syntetiske materialer for å sikre at de mekaniske egenskaper er lik den opprinnelige vev. Protokoller for å vurdere de mekaniske egenskapene til menneskets opprinnelige vev vil tillate en benchmark ved å skape egnede vev-konstruert substitutter.
Pasientene er stadig venter på ulike organtransplantasjoner å behandle sviktende eller skadde organer. Men med mangel på egnede donor organer, er regenerativ medisin som mål å skape alternative løsninger for pasienter med sluttstadiet organsvikt. Regenerativ medisin mål å møte denne kliniske behovet ved tekniske materialer for å fungere som vev erstatninger, inkludert myke vev, for eksempel brusk og hud. For å skape en vellykket materiale for å gjenopprette ødelagte vev, bør erstatningen materialet etterligne egenskapene til den opprinnelige vev det kommer til å erstatte 1-2. Når implantert, vil materialet må gi anatomiske formen til vevet defekten og således de mekaniske egenskapene til materialet er avgjørende en. For eksempel bør et materiale erstatte aurikulær brusk har de nødvendige mekaniske egenskaper for å hindre kompresjon av den overliggende huden 2. På samme måte, til et materiale erstatte nasal biltilage må ha tilstrekkelige mekaniske egenskaper for å hindre kollaps under pusting tre. Men til tross for viktigheten av mekaniske egenskaper ved fremstilling av materialer for implantering, har lite bevis for fokusert på å karakterisere de mekaniske egenskaper for forskjellige humane vev.
Mekanisk testing regimer kan brukes til å etablere trykk, strekk, bøyning eller skjær-egenskaper av en vev. Skin er en svært anisotropisk, viskoelastisk, og nesten inkompressibel materiale 4-9. Vanligvis spaltet hud blir testet ved hjelp av uniaksiale strekk metoder, hvor en passende formet strimmel av hud blir grepet ved begge ender og strukket mens belastningen og forlengelsen er ført 4-9.
Siden hovedkomponenten i alle myke vev er porevann, den mekaniske responsen av brusk er sterkt knyttet til fluidstrømmen gjennom vev 10-11. Myke vev, slik som brusk have tradisjonelt blitt testet ved hjelp av kompresjon testing. Metodene for testing i kompresjon er ganske variert, med begrenset, trangt, og innrykk som er den mest fremherskende (figur 1). Innenfor begrenset kompresjon, er en brusk prøve plassert i en ugjennomtrengelig, væskefylt brønn og lastet gjennom en porøs plate. Siden brønnen er ikke-porøs, strømnings skjønt brusk er i vertikalretningen 12-13. I unconfined kompresjon, blir brusk lastet ved hjelp av en ikke-porøs plate på et ikke-porøst kammer, tvinge fluidstrømmen til å være overveiende radial 12-13. Innrykk er den mest brukte metoden for å vurdere biomekaniske egenskapene til brusk 12-13. Den består av en inntrenger, som er mindre enn overflaten av prøven som blir testet, som er brakt ned på prøven. Innrykk har mange fordeler fremfor andre metoder for komprimering, inkludert det faktum at innrykk kan utføres in situ, enabling test for å være mer fysiologisk (figur 1) 12-13.
For å forstå de trykk- og strekkegenskapene til et vev, er Youngs elastisitetsmodul vanligvis beregnet ved å analysere den lineære delen av stress-belastningskurve, som viser den elastiske motstand mot kompresjon eller spenning, uavhengig av prøvestørrelse 12. Både strekk- og trykktesting regimer kan variere alt etter den belastning eller deformering anvendt og frekvensen av begge disse parametre. I dag er det mange forskjellige testprotokoller for å vurdere vev mekanikere, noe som gjør det ekstremt vanskelig å tolke eller sammenligne resultater fra ulike studier 6-13. Videre er mange mekaniske metoder for tiden fokusere på å karakterisere de mekaniske egenskapene til vevet ved å teste prøven for ødeleggelse. Vi tar sikte på å demonstrere et innrykk og strekk protokoll som gir direkte, ikke-destruktiv sammenligning av menneskeligmykt vev og vev-konstruert konstruksjoner.
Vi viser en metode som begrenser de mekaniske tester for påkjenninger, men likevel oppnår en Youngs elastisitetsmodul i kompresjon og strekk. Prøven understrekes enten i strekk eller kompresjon til en viss verdi, og når den valgte spenning verdi er nådd, blir prøven lov til å slappe mens alle dataene er registrert. Denne metoden registrerer både de viskoelastiske og avslapping egenskaper av vev innenfor den samme test, som kan brukes direkte til det syntetiske materiale. Vi har brukt innrykk protokollen for å evaluere human myke vev, inkludert hud og brusk 14-16. Brusk er vurdert ved hjelp av innrykk testing og huden er evaluert ved hjelp av spenning teste 14-16. Forskere tar sikte på å konstruere materialer med tilsvarende egenskaper til menneskelig bløtvev kan vurdere å gjennomføre disse protokollene.
Flere strekk og innrykks protokoller er publisert for å karakterisere menneske bløtvev. Vi har gitt en annen metode, som tar sikte på å være mer diagnostisk og ikke-destruktiv. Prøvene som gjennomgår mekanisk testing i denne protokollen er begrenset av last i stedet for ved forskyvning, som svingere er mer følsomme enn å laste til forskyvning. Derfor kan reproduksjoner av forsøket være mer nøyaktig på tvers av vev og syntetiske materialer. Ved hjelp av denne teknikk, har vi vist en strekk protokoll for evaluering av hudvev, og en fordypning protokoll for å analysere bruskvev. Begge protokollene er lett og enkelt å implementere og kan anses for karakterisering av menneskelig mykt vev og vev-konstruert konstruksjoner.
Ett av de viktige trinnene i metoden for å oppnå en stress-relaksasjonskurve egnet for analyse er for å sikre at prøven ikke glir under testing. Tilstrekkelig fiksering er required, men dette må balanseres mot å forårsake noen belastning på prøvene og sikre at den inntrenger er vinkelrett på overflaten for å forhindre enhver skjærbelastning. Det er viktig at preparatet i tillegg til størrelse og form av vevet er lik mellom prøver. For brusk, er det viktig å benytte en repeterbar disseksjon protokoll og prøve dimensjoner. For hudprøver, er det viktig å fjerne alt det subkutane vev for å oppnå en repeterbar prøve. Det er også viktig å sikre at for alle prøver, de prøvebetingelser er identiske, inkludert fuktighet, romtemperatur, og tineprosessen, hvis det er hensiktsmessig.
Det er noen begrensninger i protokollene som presenteres. Studier har antydet at deformasjonskarakteristikker av hud og brusk er avhengig av prøveorientering 13. Huden ble anerkjent for å være anisotropisk så langt tilbake som det 19. århundre, med Langer viser i 1861 at huden har naturlige linjerav spenning, omtalt som Langer linjer 4. Således, ved karakterisering av hudprøver, er det viktig å orientere alle prøver parallelt med eller vinkelrett i forhold til de Langer linjer for å unngå innføring av en metode skjevhet 4. Brusk viser også anisotropiske egenskaper, og inneholder Hultkrantz linjer, som er ekvivalent med Langer linjer, slik at brusken kan deformere seg på en annen måte ifølge den retning i hvilken den er lastet 12, 19. Derfor er det viktig å øke prøvestørrelse for å tillate testing av brusk i forskjellige retninger. Som biomekaniske egenskapene til vevet også varierer med alder og kjønn, bør studier utføres med en representant pasient kohort å opprettholde gyldigheten til klinisk setting. Videre er noen mekaniske protokoller argumentere for forkondisjonering, hvor vevet gjennomgår syklisk belastning for å sikre at vevet er i en stabil tilstand for etterfølgende mekanisk testing 20. Men den nøyaktige mekanisme for prekondisjonering er uklar og det nøyaktige antallet sykluser som trengs for å produsere en konsistent og repeterbare respons varierer i ulike studier 20. Forskeren bør vurdere om ikke å inkludere preconditioning etter vurdering av årsaken til å utføre bestemte biomekaniske test 20.
Huden er et komplekst, flerlags materiale, delt inn i tre hoved lag: epidermis, dermis og hypodermis 4. De mekaniske egenskapene til hudvevet har nylig blitt evaluert ved hjelp av in vivo-vurdering 4. Imidlertid kan protokollene av strekk testing brukes til å forstå huden biomekanikk skåret hud fire. Slike tester kan gi informasjon til modellen stressbelastningsforhold, siden grensebetingelsene kan defineres fire. Typisk, in vitro testregime bruke høye belastninger for å karakterisere materialet til svikt, in vivo systemer bruk menslav belastning varierer 4. Når man sammenligner biomekaniske verdier for spaltet hud under strekk, er det en stor variasjon mellom forskjellige studier, som strekker seg 2,9 til 150 MPa 4. Store forskjeller mellom fagene er forventet på grunn av naturlig biologisk variasjon, men forskjeller i protokollen regimer kan også forverre disse naturlige biologiske forskjeller. For eksempel, vil forskjeller i lasterater mellom protokoller forårsake variasjon, som større lasterater føre til mindre tid til å strømme ut, noe som resulterer i en høyere stivhet. Tilberedning, excision, og håndtering av protokoller i huden vev vil også føre til forskjeller i de mekaniske egenskapene 4. Denne protokollen for testing demonstrert hud tilveiebringer en alternativ metode for forskere å karakterisere hud vev. Det gir noen fordeler, inkludert muligheten til å identifisere de elastiske og viskoelastiske egenskaper av huden vev i en mekanisk test, noe som åpner for en større forståelse av hudeni løpet av kort tid. Videre kan den samme test anvendes på vev-erstatninger konstruert for å fremstille konstruksjoner med tilsvarende biomekaniske egenskaper som naturlig hud.
Innrykk testing gir et attraktivt alternativ i forhold til begrenset kompresjon testing for å forstå biomekanikk av brusk 21. Skår har evnen til å bevare den fysiologiske struktur av brusk og således gir verdier som etterligner de i en klinisk sammenheng. Ved hjelp av hakk, er det også mulig å teste brusk mens det fremdeles er festet til det underliggende ben. Innrykk gir også mulighet for fysiologisk testing av brusk som in vivo. Når to brusk overflater nærmer seg hverandre, at kantene som omgir området for kontakt "bule" på grunn av vann under kontaktområdet forskyves sideveis etter trykk deformasjon oppstår 17, 21. Brusk innrykk må utføres med en inDTast med en mindre radius enn den brusken prøven for å tillate tilsvarende utbuling. Størrelsen på indenter bør også være minst 8 ganger prøvestørrelsen for å sikre at brusken reagerer som om den var en del av en ubestemt prøve 22. Ved hjelp av en inntrenger mye mindre enn radius av prøve diameter eliminerer eventuelle kanteffekter som er tilstede i prøven oppretting. I tillegg unngår skår eventuelle eksperimentelle feil forårsaket ved å teste bruskdefekter skadet av prøven ekstraksjon. Innrykk heller ikke innebære dyp prøvepreparering, så som begrenset kompresjon, slik at små, tynne stykker av brusk som skal testes, 17, 21. Videre er ikke-destruktiv metode for innrykk betyr at den har en potensiell anvendelse i klinisk setting som et diagnostisk verktøy etter validering og verifisering studier er blitt utført.
Det er viktige forutsetninger med innrykk at brukeren må sørge for hensiktsmessig resultater. En kritisk grense tilstand i fordypningen lasting krever konstant kontakt mellom indenter og brusken overflate (dvs. at overflaten ikke skal deformeres bort fra indenter) 23, 24. Skår lasting omfatter også den antatte grensebetingelsen at kontakten mellom bruskoverflaten og inntrenger er ikke-destruktiv (dvs. at indenter er i kontakt med overflaten, men går ikke gjennom overflaten, brusk overflate må ikke svikte under indenter) 25-26. Studier har vist at denne grensebetingelse kan verifiseres ved bruk av India blekk, som vil farge skadede områder når de påføres på brusk flate 25, 26. En ytterligere grensebetingelse forutsetter at den inntrenger komprimerer brusken vinkelrett på overflaten av prøven. Den vinkelrett orientering av kompresjon er en viktig grense dirigentition fordi sammenpressing i en vinkel, spesielt ved bruk av syklisk belastning, kan forårsake glidning, som kan indusere skjærkomponenter og endre mekanisk belastning. Denne tilstanden kan sikres gjennom forsiktig testutstyr satt opp.
Etter oppsummert protokollene har blitt optimalisert for det myke vevet av interesse, vil det være nyttig for forskere å se på dynamisk testing av vevet av interesse. Passende syklisk lasting av prøver skal etterligne normale fysiologiske grenser og atferd, som for eksempel etterligne gange eller andre repetitive bevegelser 27. Oppsummert viser denne rapporten enkle mekanisk testing protokoller for å vurdere menneskelig vev. Implementering av disse protokollene vil gi viktig informasjon om de biomekaniske egenskapene til vev, slik at vev-utviklet konstruksjoner for å bedre etterligne den opprinnelige vev.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the funding from Medical Research Council and Action Medical Research, which provided MG with a clinical fellowship, GN 2339, to conduct this work.
Digitial Vernier Calipers | Machine Mart | 40218046 | Digitial vernier caliper is used to measure sample thickness. |
Water Bath | Cole Parmer | UY-12504-94 | StableTemp Digital Water Bath Flask Holder used to defrost tissues samples if they are frozen. |
Mach-1 Material Testing Machine | Biomomentum | V500c | Mechanical Testing Machine used to test the mechancial properties of the tissues. |
Scalpel Blade | VWR | 233-5335 | Scalpel blades using to cut and dissect the tissues. |
Forceps | VWR | 470007-554 | Forceps used to dissect the tissues. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.2 | Life Technologies | 20012019 | PBS is used to hydate the tissue samples |