Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.
Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to “operational taxonomic units”; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage.
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.
Metagenomics डीएनए के प्रत्यक्ष विश्लेषण पर्यावरण के नमूनों 1 के भीतर पाया जैविक समुदायों से शुद्ध और मूल रूप से unculturable बैक्टीरिया अवसादों 2 में पाया पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Metagenomics व्यापक रूप से, मानव Microbiome 3 की पहचान सागर 4 के भीतर और यहां तक कि बैक्टीरियल समुदायों कि कॉफी मशीन 5 पर विकसित के विश्लेषण के लिए माइक्रोबियल आबादी को वर्गीकृत के रूप में आवेदन के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया गया है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की शुरुआत में अधिक से अधिक अनुक्रमण throughput और उत्पादन में हुई। नतीजतन, डीएनए अनुक्रमण अधिक किफायती 6 बन गया है और अनुक्रमण की गहराई है कि किया जा सकता है बहुत बढ़ गया है, metagenomics सक्षम करने के लिए एक शक्तिशाली, विश्लेषणात्मक उपकरण बन गया है।
Metagenomic अनुक्रमण के व्यावहारिक, आणविक पहलू में "फ्रंट-एंड" संवर्द्धन में के विकास को प्रेरित कियासिलिको जैव सूचना विज्ञान वर्गीकरण 7-9, कार्यात्मक एनोटेशन 10,11 और डीएनए अनुक्रम डेटा के दृश्य प्रतिनिधित्व 12,13 के लिए उपलब्ध उपकरणों। उपलब्ध की बढ़ती संख्या, prokaryotic और यूकेरियोटिक 14 जीनोम अनुक्रम माइक्रोबियल समुदायों, जो सदा ही अनुक्रम जीनोम 15 के एक "वापस अंत" संदर्भ डेटाबेस के खिलाफ प्रदर्शन कर रहे हैं के वर्गीकरण में आगे सटीकता की अनुमति देता है। दो मुख्य दृष्टिकोण metagenomic विश्लेषण के लिए अपनाया जा सकता है।
अधिक परंपरागत विधि -16 rRNA जीन कोडिंग जीवाणु जीनोम के क्षेत्र का विश्लेषण है। -16 RRNA अत्यधिक अकेन्द्रिक प्रजातियों के बीच संरक्षित लेकिन नौ हाइपर-चर क्षेत्रों दर्शाती है (V1 – V9) जो प्रजातियों की पहचान 16 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। अब अनुक्रमण का परिचय (≤ 300 बीपी बनती अंत) विशेष रूप से, दो हाइपर-चर क्षेत्रों में फैले डीएनए दृश्यों के विश्लेषण के लिए अनुमति दीवी 3 – V4 क्षेत्र 17। ऐसे ऑक्सफोर्ड nanopore 18 और 19 PacBIO के रूप में अन्य अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों, के क्षेत्र में अग्रिम पूरे -16 rRNA जीन समीपवर्ती अनुक्रम किया जा करने की अनुमति है।
जबकि -16 rDNA आधारित पुस्तकालयों प्रजातियों की पहचान करने के लिए एक लक्षित दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और कम प्रतिलिपि संख्या डीएनए का पता लगाने कि स्वाभाविक रूप से शुद्ध नमूने के भीतर होता है सक्षम, बन्दूक अनुक्रमण पुस्तकालयों प्रजातियों का पता लगाने कि डीएनए क्षेत्रों है कि या तो -16 से amplifiable नहीं हैं शामिल कर सकते हैं के लिए अनुमति rRNA मार्कर प्राइमर दृश्यों का इस्तेमाल किया, क्योंकि या टेम्पलेट अनुक्रम और amplifying प्राइमर अनुक्रम के बीच मतभेद भी महान 20,21 हैं। इसके अलावा, हालांकि डीएनए पीसीआर डीएनए प्रतिकृति के एक उच्च निष्ठा है, आधार त्रुटियों फिर भी पीसीआर प्रवर्धन के दौरान हो सकता है और इन त्रुटियों को शामिल किया प्रजातियों 22 होने का गलत वर्गीकरण में परिणाम कर सकते हैं। टेम्पलेट seq की पीसीआर प्रवर्धन में पूर्वाग्रहोंuences भी हो सकता है; एक उच्च जीसी सामग्री के साथ डीएनए के दृश्यों 23 और इसी तरह के थाइमिन ग्लाइकोल के रूप में अप्राकृतिक आधार संशोधनों को अंतिम amplicon पूल में प्रतिनिधित्व के तहत हो सकता है, डीएनए पीसीआर डीएनए के प्रवर्धन में विफलताओं के कारण 24 दृश्यों रोक सकते हैं। इसके विपरीत, एक बन्दूक अनुक्रमण डीएनए पुस्तकालय है कि शुद्ध डीएनए कि एक नमूना से निकाला गया है और बाद में अनुक्रमण के लिए तैयार करने से पहले कम डीएनए श्रृंखला लंबाई में खंडित के सभी का उपयोग करके तैयार किया गया है एक डीएनए पुस्तकालय है। बन्दूक अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न डीएनए दृश्यों के वर्गीकरण और अधिक सटीक जब, -16 rRNA amplicon अनुक्रमण 25 की तुलना में हालांकि वित्तीय लागत तक पहुंचने के लिए एक विश्वसनीय अनुक्रमण गहराई amplicon अनुक्रमण 26 की तुलना में अधिक है की आवश्यकता है। बन्दूक अनुक्रमण metagenomics का प्रमुख लाभ यह है कि नमूने में विभिन्न जीनोम अनुक्रम के क्षेत्रों जीन पूर्वेक्षण के लिए उपलब्ध हैं एक बार वे किया गया हैtaxonomically 27 में वर्गीकृत किया गया है।
Metagenomic अनुक्रम डेटा bioinformatic उपकरणों की एक कभी बढ़ती दूरी से विश्लेषण किया है। इन उपकरणों उदाहरण के लिए, आवेदनों की एक विस्तृत विविधता प्रदर्शन करने में सक्षम हैं, कच्चे अनुक्रम डेटा 28 की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण, बनती अंत की ओवरलैपिंग 29 पढ़ता है, नए सिरे से अनुक्रम की विधानसभा contigs और scaffolds 30,31, वर्गीकरण और दृश्य को पढ़ता अनुक्रम पढ़ता है और इकट्ठे दृश्यों 7,12,32,33 और इकट्ठे दृश्यों 34,35 के कार्यात्मक एनोटेशन की।
सिलेज, (Zea mays) इस तरह के मक्का के रूप में किण्वित अनाज से दुनिया भर में किसानों द्वारा उत्पादित, मुख्यतः पशु चारे के रूप में प्रयोग किया जाता है। सिलेज जीवाणु लैक्टोबैसिलस सपा के साथ व्यवहार किया जाता है। किण्वन 36 सहायता करने के लिए लेकिन आज तक, वहाँ सिलेज में पाया अन्य माइक्रोबियल आबादी के सीमित ज्ञान है। fermentation प्रक्रिया अवांछनीय और हानिकारक सूक्ष्म जीवों सिलेज 37 के भीतर प्रचलित होता जा रहा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। Yeasts और नए नए साँचे के अलावा, बैक्टीरिया विशेष रूप से सिलेज fermenting में anaerobic पर्यावरण के लिए अनुकूल हैं और अधिक बार सिलेज 38 की गिरावट के बजाय पशुओं में रोगों के साथ जुड़े रहे हैं। Butyric एसिड बैक्टीरिया अनजाने मिट्टी से जोड़ा जा सकता है रहता है जब सिलेज साइलो भरने और butyric एसिड, लैक्टिक एसिड, anaerobic पाचन का एक उत्पाद परिवर्तित करने के लिए, इस प्रकार सिलेज 39 का पीएच में वृद्धि कर सकते हैं। पीएच में यह वृद्धि नुक़सान बैक्टीरिया में वृद्धि है कि सामान्य रूप से इष्टतम सिलेज किण्वन की स्थिति 38 के तहत विकास को बनाए रखने में असमर्थ हो जाएगा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। क्लोस्ट्रीडियम एसपीपी। , लिस्टेरिया एसपीपी। और बेसिलस एसपीपी। , विशेष रूप से डेयरी पशु चारा के लिए सिलेज में, विशेष रूप से चिंता का विषय हैं बैक्टीरियल बीजाणुओं कि gastr बच गया है के रूप मेंointestinal पथ 40 खाद्य श्रृंखला, दुर्लभ मामलों में, पशु और मानव मौत 37,39,41-44 को दर्ज भोजन नुक़सान के लिए नेतृत्व और, कर सकते हैं। इसके अलावा, जबकि यह पशु चिकित्सा उपचार और सिलेज नुक़सान की वजह से पशुओं के नुकसान का सही आर्थिक प्रभाव का अनुमान लगाना मुश्किल है, यह अगर एक प्रकोप भी हो रहा था एक खेत के लिए हानिकारक होने की संभावना है।
यह धारणा है कि एक metagenomic दृष्टिकोण का उपयोग करके हम माइक्रोबियल आबादी है कि सिलेज नमूने में मौजूद हैं और इसके अलावा वर्गीकृत सिलेज नुक़सान के साथ जुड़े माइक्रोबियल समुदायों कि, बारी में, संभावित पशुधन पर एक हानिकारक प्रभाव होता है की पहचान, उपचारात्मक कार्रवाई को सक्षम करने के लिए हो सकता है सिलेज से पहले लिया एक खाद्य स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है।
सिलिको विश्लेषण में एक माइक्रोबियल समुदायों कि पर्यावरण के नमूनों के भीतर मौजूद हैं के लिए एक उत्कृष्ट अंतर्दृष्टि दे सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि वर्गीकरण वर्गीकरण का प्रदर्शन किया प्रासंगिक नियंत्रण के साथ सहयोग में और उस अनुक्रमण का एक उपयुक्त गहराई पूरे कब्जा करने के लिए हासिल किया गया प्रदर्शन किया जनसंख्या वर्तमान 51।
किसी भी कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के साथ, वहाँ एक समान लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए कई रास्ते हैं। तरीकों कि हम इस अध्ययन में इस्तेमाल किया है उपयुक्त और सरल तरीकों, कि एक साथ लाया गया है सिलेज Microbiome पर विश्लेषण की एक सीमा प्राप्त करने के लिए के उदाहरण हैं। एक विविधता और जैव सूचना विज्ञान उपकरणों और तकनीकों के एक बढ़ती संख्या के उदाहरण Phylosift 8 और MetaPhlAn2 52 के लिए, metagenomic डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध हैं, और इन नमूना करने के लिए उनकी प्रासंगिकता के लिए जांच और विश्लेषण अनुरोध करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए53 uired। Metagenomic विश्लेषण के तरीकों वर्गीकरण, अनुक्रमण गहराई और अनुक्रमण की गुणवत्ता के लिए उपलब्ध के लिए डेटाबेस के द्वारा सीमित हैं।
bioinformatic यहां प्रदर्शन प्रसंस्करण के लिए एक स्थानीय, उच्च स्तरीय मशीन पर प्रदर्शन किया गया था; हालांकि क्लाउड-आधारित सिस्टम भी उपलब्ध हैं। ये क्लाउड-आधारित सेवाओं के लिए एक उपयुक्त शक्तिशाली स्थानीय कार्य केंद्र की उच्च लागत निवेश के लिए बिना आवश्यक कम्प्यूटेशनल शक्ति के किराये के लिए अनुमति देते हैं। इस पद्धति का एक संभावित आवेदन कृषि के क्षेत्र में इसके उपयोग से पहले सिलेज आकलन करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई हानिकारक बैक्टीरिया इसलिए उन्हें खाद्य श्रृंखला में प्रवेश करने से रोकने मौजूद हैं होगा।
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).
FastDNA SPIN Kit for Soil | MP Bio | 116560200 | DNA Extraction |
DNA FastPrep | MP Bio | 116004500 | DNA Extraction |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA Purification |
Elution Buffer | Qiagen | 19806 | DNA Purification |
Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | DNA Quantification |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | DNA Quantification |
Nextera XT DNA Library Prep Kit | Illumina | FC-131-1024 | Library Preparation |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Library Preparation |
TapeStation 2200 | Agilent | G2964AA | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA Quantification |
HS D100 ScreenTape Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA Quantification |
TapeStation Tips | Agilent | 5067-5153 | DNA Quantification |
TapeStation Tubes | Agilent | 401428 and 401425 | DNA Quantification |
HiSeq 2500 | Illumina | DNA Sequencing – provided by a sequencing service | |
High Power Analysis Workstation | Various | Local or cloud based, user preferred system |