这份手稿使用,以便产生纳米级结构的精确模型的单粒子分析应用于超分辨率显微镜图像基于斐济开源软件包VirusMapper。
超分辨率荧光显微镜正在彻底改变细胞生物学研究。其容量打破的周围300的分辨率极限纳米允许纳米生物复合物和方法的常规成像。增加的分辨率也意味着方法电子显微镜流行,如单粒子分析,可以很容易地应用到超分辨率荧光显微镜。通过结合超分辨率光学成像这种分析方法,可以采取荧光显微镜的特定分子标记能力亚稳结构内产生分子元件的构造图的优点。为此,我们已经开发出一种新的算法 – VirusMapper – 打包为一个易于使用的,高性能,高吞吐量ImageJ的插件。本文介绍了深入的指南,该软件,展示其揭示在生物米新颖的结构特征的能力olecular复合物。这里,我们提出如何组装兼容的数据,并提供关于如何使用该算法单粒子分析适用于超分辨率图像的步骤一步协议。
超分辨率(SR)显微镜已经通过与分子特异性标记,以了解他们至关重要一起提供的能力,以图像的关键分子过程中对细胞生物学产生了重大影响。 SR现在使光镜接近,同时保持光学显微镜的主要好处,如潜在图像活细胞1,2中的分辨率(20-150纳米)以前只有用电子显微镜(EM)实现的。另外,在纳米级水平中发现的结构保守允许单粒子分析(SPA),以SR的数据,在电子显微镜3中广泛使用的一个概念的应用。使用SPA,一个结构的许多高度保守的副本可以被成像和一起平均以提高分辨率,精度或信号与噪声的可视化对象的。当与SR组合使用,SPA已被证明是用于高 – 对一个强大的工具核孔复合体4,5的部件,中心体6,和病毒,如HIV 7和HSV-1 8的recision映射。
然而,SR和SPA的常规联合应用已经缺乏可用的软件的挑战。出于这个原因,我们开发VirusMapper,一个插件来流行的图像处理软件ImageJ的/斐济9。这是第一个免费提供的软件包,用于与被设计来提供快速,方便用户,多通道天真与SR显微镜成像结构的平均荧光图像10广义SPA。虽然设计用于病毒,它可以被应用到任何大分子复合物,其中不同的分子种类可以被成像,识别,和本地化。
VirusMapper可用于生产高精度分子任何已知的结构模型,允许平均尺寸和其它参数的计算。该算法的设计使得它用于分离结构的人群中,提供用于不同取向或不同的形态的状态的确定是特别有用的。此外,多通道成像可用于采用在例的参考信道,其中的底层结构是公知的,从而允许基于引用的结构的发现。上提供了下载和安装该软件的说明https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper 。例如数据也可以在那里找到,并建议用户使用上的实例数据的软件试图将其应用到自己之前练习。
在这里,描述了用于使用该插件产生从原始数据SPA模型的步骤。该软件需要包含单ö原始图像ř多重标记的结构作为输入。它返回,受到众多的参数作为软件运行被调整,SPA型号表示成像的结构内的标记的成分的平均分布。
此协议的目标是产生精确SPA模型给出根据图1中所概述的管道成像的结构内的组件的平均本地化。 如图1所示,该软件工作流被有效地划分为三个阶段。第一阶段是将大的图像,从而产生用于每个信道的颗粒堆。这些粒子将被平均,以创建模型和生产用于模型生成种子的单位。第二阶段是产生种子的图像,其被用于记录整个粒子集合中的最后阶段。这是通过选择一个基准信道和手动在该通道中,这将有助于在S中选择的粒子进行电火工品。种子被选择在该参考信道,但可以用于所有信道而产生。颗粒最初由在此通道中安装一个2D高斯重新对准。已被选择和重新排列,所有的颗粒都然后取平均,以产生种子。对于要被建模的数据可以看出每一个公共结构中,颗粒应被选择作为种子,清楚和准确地表示该结构。在这个阶段的接口也用于扫描数据为这样的结构是有用的。
最后一个阶段是通过使用模板匹配,从而生成模型。这是通过最初提取到前面部分由互相关中所产生的晶种图像中的颗粒的登记实现的。注册颗粒的子集一起平均,并且处理被进一步迭代如果需要的话,以减少模型均方误差。该子集是通过设置对种子必须满足一最小相似度来确定。当创建模型同时S IN多个信道,联合相似性,或相似的每个信道的平均,被使用。那对他们作出贡献的所得的模型和注册颗粒然后可进一步分析。
利用这种方法,研究人员都配备SPA和SR显微镜的电源,从而产生的病毒和其他大分子复合物的蛋白质结构的高精度,多通道的二维模型结合起来。然而,一些重要的考虑因素应该被考虑在内。
种子应选择以表示始终可见的结构。因此,原始数据,应检查被选择的种子之前仔细。这是为了防止偏模型非常重要。选择可以通过为包括一定数量的在模型中颗粒的所需的最小相似性阈值的检查来验证。显然,对于种子的选择,这个较高的阈值需要为粒子的给定数量,越该结构是在数据显而易见。
当存在异质性在数据中的模板匹配的概念是特别有用的。所有不同的结构是六锡布尔赫丁应查明并为每种情况创建不同的模型。通过在一个沟道分离异质结构,但同时在第二信道创建模型,图案可以出现,不会一直立即明显。
另一个考虑是知道使用这种算法时是迭代过程将最大限度地随机不对称。例如,建模具有两个对称的最大值的结构的情况下,最大值之间的所有细微的不对称将彼此迭代期间对准,并因此最终模型将是最大程度不对称的。如果这没有反映在结构已知的对称建模,那么这应该加以考虑。目前,为了避免这种最大化的唯一途径是迭代的次数限制为1,虽然发展潜力将是VirusMapper纳入对称轴为模型生成过程。 VirusMapper的任何新版本将是阿瓦伊拉布勒引用的网站上(见材料表 )。用户也将在这里找到一个常见问题回答任何常用查询。
如所描述的软件是适用于能够具有足够分辨率可视化用户希望建模的特征进行成像的任何结构。虽然SPA可以提高分辨率,它显然不会提高在其他方面不可见特征的可见性。这个协议不是,因此,一种方法来提高数据的质量。与任何技术,仔细的样品制备和优化成像策略将提供最干净数据和最佳所得模型。
SR成像模态的选择也很重要,并且在一般情况下,将取决于手边的样品。 VirusMapper已被证实与SIM和STED 10很好地工作,而且还可以提供高品质的定位显微镜数据使用,但应注意在这种情况下服用,稀疏的标签可能会导致类似的不对称性最大化的问题。
目前,VirusMapper为荧光图像的单粒子分析和唯一的通用2D SPA平均软件的唯一免费提供的算法。已经利用了相同的原则4,6其他研究,8使用了专门为每个特定的学习习惯的软件。对于3D数据的重建通用算法已经出版5,18,虽然没有软件提供。
当用作本文中描述所使用的,VirusMapper可用于生产病毒和其它复合物的大分子蛋白质结构的精确,准确和可靠的模型。有了这些模型,研究人员可以利用该结构的平均尺寸的精确测量正在研究数目字,有可能使他们能够达到生物的结论,即否则不会成为可能。
此外,该技术的多通道功能,能够映射络合物内无限数量的蛋白质和部件,并且发现新的蛋白质的组织。检查在纳米结构的变化在不同的生物相关条件,如病毒生命周期的不同阶段,所提供的有价值的见解生物学的潜力。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢科里纳·比尔,耶日·萨莫勒琼,佩德罗·马特斯·佩雷拉,克里斯托弗·布莱克和凯思林·舍雷尔他们对原有的开发和验证VirusMapper的贡献。我们还要感谢阿尔图尔·亚基莫维奇的手稿的批判性阅读。这项工作是由来自生物技术和生物科学研究理事会的资助(BB / M022374 / 1)(RH);核心资金的MRC实验室分子细胞生物学,伦敦大学学院(JM);欧洲研究理事会(649101-UbiProPox)(JM);和医学研究理事会(MR / K015826 / 1)(RH和JM)。 RG是由工程和物理科学研究理事会(EP / M506448 / 1)资助。
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
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