이 논문은 나노 구조의 정확한 모델을 생성하기 위해 슈퍼 해상도 현미경 이미지에 단일 입자 분석을 적용 할 수있는 피지 기반의 오픈 소스 소프트웨어 패키지 VirusMapper를 사용합니다.
슈퍼 해상도의 형광 현미경은 현재 세포 생물학 연구에 혁명을 일으키고있다. 그 용량은 나노 생물 단지 및 프로세스의 일상적인 이미징을 허용 내지 300의 해상도 한계를 깰 수 있습니다. 해상도의 증가는 또한 단일 입자 분석 전자 현미경 등의 인기있는 방법은, 용이 초해 형광 현미경에 적용 할 수 있다는 것을 의미한다. 수퍼 – 해상도 광 화상이 분석 방법을 조합함으로써, 준 안정 분자 구조 내의 요소의 구조 맵을 생성하는 형광 현미경의 특정 분자 표지 능력을 활용하는 것이 가능해진다. VirusMapper – – AN, 고성능의 사용하기 쉽고, 높은 처리량 ImageJ에 플러그인으로 패키지이를 위해, 우리는 새로운 알고리즘을 개발했다. 이 문서에서는 생물학적 m에 새로운 구조적 특징을 발견 할 수있는 능력을 보여주는,이 소프트웨어에 대한 깊이있는 가이드를 제공합니다olecular 단지. 여기, 우리는 호환되는 데이터를 조립하고 슈퍼 해상도의 이미지에 단일 입자 분석을 적용하려면이 알고리즘을 사용하는 방법에 대한 단계별 프로토콜을 제공하는 방법을 제시한다.
슈퍼 해상도 (SR) 현미경을 이해하는 중요한 분자 특정 라벨과 함께 이미지 키 분자 처리 할 수있는 기능을 제공함으로써 세포 생물학에 큰 영향을 미쳤습니다. SR은 이제 이미지 살아있는 세포 1, 2에 대한 잠재적으로 광학 현미경의 주요 장점을 유지하면서 전자 현미경 (EM)로 이전에는 달성 할 수있는 해상도 (20 ~ 150 nm의) 접근하는 광학 현미경을 할 수 있습니다. 또한, 나노 레벨에있는 구조적 보전 SR 데이터의 단일 입자 분석 (SPA), 전자 현미경 (3)에서 광범위하게 사용되는 개념의 적용을 허용한다. SPA를 사용하는 구조의 대부분 고도로 보존 사본 묘화 해상도, 정밀도 또는 신호 – 대 – 잡음 가시 오브젝트를 개선하기 위해 함께 평균 될 수있다. SR과 함께 사용하는 경우, SPA 높은-P를위한 강력한 도구로 증명되었다이러한 HIV 7 및 HSV-1 (8)로 핵공 복합체 (4, 5)의 구성 요소, 중심체 (6), 및 바이러스의 recision 매핑.
그러나, SR 및 SPA의 일상 결합 된 응용 프로그램을 사용할 수있는 소프트웨어의 부족에 의해 도전을 받고있다. 이러한 이유로, 우리는 VirusMapper, 인기 이미지 처리 소프트웨어 ImageJ에 / 피지 9 플러그인을 개발했다. 이것은 SR 현미경으로 몇 군데 구조의 빠르고 사용하기 쉬운, 멀티 채널 순진한 평균을 제공하도록 설계 형광 이미지 (10)와 일반화 SPA에 대한 첫 번째 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어 패키지입니다. 바이러스를 설계하지만, 서로 다른 분자 종, 군데 식별 및 지역화 할 수있는 어떤 고분자 복합에 적용 할 수 있습니다.
VirusMapper 고정밀 분자를 생산하는 데 사용될 수 있습니다평균 치수 및 다른 파라미터의 계산을 가능하게 공지 구조의 모델. 알고리즘 설계 구별 방향 또는 다른 형태의 상태 판별에 제공하는 구조의 집단을 분리하는 것이 유용한다. 또한, 멀티 채널 영상은 기본 구조가 공지되어 여기서 참조 구조 기반 검색을 가능 경우 기준 채널을 채용 할 수있다. 소프트웨어를 다운로드하고 설치하기위한 지침을 제공 https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . 예 데이터도 발견 할 수 있으며, 사용자는 자신의에 적용하기 전에 예를 들어 데이터의 소프트웨어를 사용하여 연습하는 것이 좋습니다.
여기서, 원 데이터로부터 SPA 모델을 생성하기 위해 플러그를 사용하는 단계를 설명한다. 소프트웨어는 단일 O를 포함하는 원시 이미지를 얻는입력으로서 멀티 – 표지 구조 r에. 그것은 소프트웨어가 실행으로 조정되는 매개 변수의 수에 따라 반환, 영상화 된 구조 내에서 표시된 구성 요소의 평균 분포를 보여주는 SPA 모델.
이 프로토콜의 목적은 그림 1에 나와있는 파이프 라인에 따라 몇 군데 구조 내에서 구성 요소의 평균 지역화를주는 정확한 SPA 모델을 생산하는 것입니다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 소프트웨어 흐름 유용 3 단계로 분할된다. 첫 번째 단계는 각 채널에 대한 입자의 스택 결과 세그먼트 큰 화상이다. 이 입자들은 모델을 만들 수 및 모델 생성을위한 씨앗을 생산하기 위해 평균됩니다 단위입니다. 두 번째 단계는 최종 단계에서 입자의 전체 세트를 등록하는 데 사용되는 시드 이미지를 생성하는 것이다. 이것은 S에 기여할이 채널에서 입자를 선택 수동 기준 채널을 선택하고 수행한다eeds. 씨앗이 기준 채널로 선정되지만 모든 채널에 대해 생성 될 수있다. 입자는 처음에이 채널에서 2 차원 가우시안 피팅으로 재편된다. 선택 재편성 된 모든 입자는있는 씨앗을 생산하기 위해 평균. 모델링 될 데이터에서 본 각 공통 구조, 입자가 명확하고 정확하게 그 구조를 나타내는 종자로서 선택 될 것이다. 이 단계에서 인터페이스는 또한 이러한 구조에 대한 데이터를 검색하는 데 유용하다.
마지막 단계는 템플릿 매칭을 사용하여 모델을 생성하는 것입니다. 이것은 원래의 상호 상관에 의해 이전 섹션에서 생성 된 종자 이미지 추출 된 입자의 등록을 통해 달성된다. 등록 된 입자의 집합은 평균을, 처리는 또한 원하는 경우, 평균 제곱 에러 모델을 줄이기 위해 반복된다. 이 부분 집합을 만족해야 종자에 대한 최소한의 유사성을 설정에 의해 결정됩니다. 모델을 만들 때여러 개의 채널을 동시에 s가 공동 유사성, 또는 각각의 채널에 대한 유사성의 평균이 사용된다. 이들 기여 얻어진 모델 등록 입자는 추가로 분석 될 수있다.
이 방법으로, 연구진은 바이러스 및 기타 거대 분자 복합체의 단백질 구조의 고정밀, 멀티 채널 2D 모델을 생성하기 위해 SPA와 SR 현미경의 힘을 결합되어 있습니다. 그러나, 몇 가지 중요한 고려 사항이 고려되어야한다.
씨앗은 지속적으로 볼 수있는 구조를 표현하기 위해 선택해야합니다. 따라서 원 데이터는 종자가 선택된다 전에주의 깊게 검사되어야한다. 이 바이어스 모델을 방지하는 것이 중요하다. 선택은 모델에 입자의 특정 번호를 포함하는 데 필요한 최소 유사성 임계 값의 시험에 의해 검증 될 수있다. 분명히, 종자의 선택을 위해, 더 높은이 임계 값은 입자의 특정 번호를 할 필요가, 더 그 구조는 데이터에서 알 수있다.
데이터의 얼룩이있을 때 템플릿 매칭 개념은 특히 유용하다. VI 모든 다른 구조sible이 확인되어야하고, 다른 모델은 각각의 경우에 대해 생성. 하나 개의 채널에서 이종 구조의 분리하지만 동시에 제 2 채널에서 모델을 생성함으로써, 패턴은 즉시 분명하지 않았을 나타날 수있다.
또 다른 고려 사항은이 알고리즘을 사용하여 반복 절차는 확률 적 비대칭 성을 극대화하는 것입니다 때주의해야합니다. 두 개의 대칭 최대치와 구조를 모델링 할 때, 예를 들어, 최대 값 사이의 모든 약간 비대칭은 반복 동안 서로 정렬되며, 최종 모델 따라서 최대한 비대칭 일 것이다. 이 모델링되는 구조에서 알려진 대칭을 반영하지 않는 경우, 다음이 고려되어야한다. VirusMapper 모델 생성 과정에 대칭 축선을 포함하는 잠재적 인 개발 될 것이지만 현재이 극대화를 방지 할 수있는 유일한 방법은, (1) 반복 횟수를 제한하는 것이다. VirusMapper의 모든 새 버전은 avai 것참조 된 웹 사이트에 LABLE (재료 표 참조). 사용자는 어떤 공통 질의 답변을 여기에 질문을 찾을 수 있습니다.
설명이 소프트웨어는 사용자가 모델링하고자하는 기능을 시각화하기에 충분한 해상도로 이미지화 할 수있는 모든 구조에 적용 할 수있다. SPA는 해상도를 향상시킬 수 있지만, 명확하게, 그렇지 않으면 볼 수없는 기능의 가시성이 향상되지 않습니다. 이 프로토콜은 따라서 방법은 데이터의 품질을 향상시킬 수 없습니다. 깨끗한 데이터와 최적의 결과 모델을 제공 할 것입니다 이미징 전략의 기술,주의 샘플 준비 및 최적화와 마찬가지로.
SR 영상 기법의 선택은 일반적으로 손의 샘플에 따라 달라집니다, 또한 중요하다. , VirusMapper는 SIM과 STED (10)와 함께 잘 작동하도록 검증되었습니다, 그것은 또한 고품질의 현지화 현미경 데이터를 사용할 수 있지만주의가이 경우에주의해야한다같은 스파 스 라벨은 비대칭 극대화 유사한 문제가 발생할 수 있습니다.
현재 VirusMapper 형광 이미지의 단일 입자 분석 및 유일한 범용 2D SPA 평균 소프트웨어에 대한 유일한 자유롭게 사용할 알고리즘이다. 같은 원칙 4, 6의 사용을 만들었습니다 다른 연구, 8은 각각의 특정 연구 전문 사용자 정의 소프트웨어를 사용하고 있습니다. 별도의 소프트웨어가 제공되지 않았지만 3D 데이터의 재구성을위한 범용 알고리즘, 5, 18을 발표했다.
이 문서에 설명 된대로 사용하는 경우, VirusMapper는 바이러스 및 기타 단지의 고분자 단백질 구조의 정밀하고 정확하며 강력한 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 모델로, 연구진은 구조체의 평균 치수의 정확한 측정을 할 수 있습니다연구 대상 URES는 잠재적으로 그들이 그렇지 않으면 불가능했을 것입니다 생물학적 결론에 도달 할 수 있도록.
또한,이 기술의 다중 채널 기능, 단지 내 단백질 성분을 무제한 매핑 및 신규 단백질 조직을 발견 할 수있다. 이러한 바이러스 라이프 사이클의 다른 단계와 같은 다른 생물학적으로 관련 조건에서 나노 구조의 변화를 검사, 생물학으로 가치있는 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 가지고있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 VirusMapper의 원래 개발 및 검증에 대한 그들의 공헌 코리나 비어리, 저지 사모리지, 페드로 마토스 페레이라, 크리스토퍼 블렉 및 카트린 쉐러 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 비판적 읽기 아르투르 Yakimovich에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회에서 교부금에 의해 투자되었다 (BB / M022374 / 1) (RH); 분자 세포 생물학에 대한 MRC 연구소의 핵심 자금, 영국 런던 대학 (JM); 유럽 연구위원회 (649101-UbiProPox) (JM); 및 의료 연구위원회 (MR / K015826 / 1) (RH와 JM). RG는 공학 및 물리 과학 연구위원회 (EP / M506448 / 1)에 의해 지원된다.
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |