Dit handschrift maakt gebruik van de Fiji-gebaseerde open-source softwarepakket VirusMapper single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie microscopie afbeeldingen om nauwkeurige modellen van de nanoschaal structuur te genereren.
Super-resolutie fluorescentiemicroscopie is momenteel een revolutie in de celbiologie onderzoek. De capaciteit om de resolutie limiet van ongeveer 300 nm maakt het mogelijk om de routine beeldvorming van nanoschaal biologische complexen en processen te breken. Deze toename in resolutie betekent dat werkwijzen populair in elektronenmicroscopie, zoals alleenstaande-analyse van deeltjes kan gemakkelijk worden toegepast op superresolutie-fluorescentiemicroscopie. Door die analytische benadering superresolutie optische beeldvorming, wordt het mogelijk te profiteren van het molecuul-specifieke labeling vermogen van fluorescentiemicroscopie structurele kaarten van moleculaire elementen genereren binnen een metastabiele structuur. VirusMapper – – verpakt als een eenvoudig te gebruiken, high-performance en high-throughput ImageJ plugin Daartoe hebben we een nieuw algoritme ontwikkeld. Dit artikel geeft een uitgebreide gids voor deze software presentatie van zijn vermogen om nieuwe structurele kenmerken onthullen in biologische mMolecular complexen. Hier presenteren we hoe u compatibele gegevens monteren en zorgen voor een stap-voor-stap protocol over hoe dit algoritme te gebruiken om single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie beelden.
Super-resolutie (SR) microscopie heeft een grote invloed op de celbiologie gehad door het verstrekken van de mogelijkheid om beelden op de belangrijkste moleculaire processen samen met de moleculaire specifieke etikettering van cruciaal belang om ze te begrijpen. SR maakt het nu mogelijk een lichtmicroscoop de resoluties (20-150 nm) voorheen alleen haalbaar met elektronenmicroscopie (EM) met behoud van de grote voordelen van het licht microscopie, zoals de mogelijkheid om de afbeelding levende cellen 1, 2 te benaderen. Verder kan de structurele conservering gevonden op nanoschaal niveau staat de toepassing van enkele deeltjes analyse (SPA) om SR data, een concept uitgebreid in elektronenmicroscopie 3. Gebruik SPA, veel sterk geconserveerde exemplaren van een structuur af te beelden en gemiddeld samen met de resolutie, nauwkeurigheid of signaal-ruis van de gevisualiseerde object verbeteren. Bij gebruik in combinatie met SR, is SPA is aangetoond dat een krachtig hulpmiddel voor de high-precision kaart brengen van onderdelen van de nucleaire porie complex 4, 5, 6 centrosomes en virussen, zoals HIV en HSV-7 1 8.
Toch heeft de routine gecombineerde toepassing van SR en SPA uitgedaagd door een gebrek aan beschikbare software. Daarom ontwikkelden we VirusMapper, een plugin om het populaire beeld processing software ImageJ / Fiji 9. Dit is de eerste vrij beschikbare software pakket voor gegeneraliseerde SPA met fluorescentie beelden 10 ontworpen om snelle, gebruiksvriendelijke, multi-channel naïeve middeling van structuren afgebeeld met SR microscopie te bieden. Hoewel ontworpen virussen, kan worden toegepast op elk macromoleculair complex waarbij verschillende moleculaire species kunnen worden afgebeeld, geïdentificeerd en gelokaliseerd.
VirusMapper kan worden gebruikt voor de productie van hoge precisie moleculairemodellen van elke bekende structuur, waardoor de berekening van gemiddelde afmetingen en andere parameters. Het algoritme ontwerp maakt het bijzonder bruikbaar voor het scheiden van populaties van structuren, betreffende de vaststelling van verschillende oriëntaties of verschillende morfologische toestanden. Bovendien kan multichannel beeldvorming worden gebruikt om een referentiekanaal in gevallen passen wanneer de onderliggende structuur staat bekend, waardoor voor referentie gebaseerde structuur ontdekking. De instructies voor het downloaden en installeren van de software zijn voorzien op https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Voorbeeld gegevens kunnen ook daar te vinden, en gebruikers worden geadviseerd om te oefenen met behulp van de software op het voorbeeld data voordat u probeert toe te passen op hun eigen land.
Hier zijn de stappen voor het gebruik van deze plugin om SPA modellen uit ruwe data produceren, worden beschreven. De software neemt RAW-afbeeldingen met single- or multi-gemerkte structuren als input. Het keert, onder voorbehoud van een aantal parameters die zijn aangepast omdat de software wordt uitgevoerd, SPA modellen die het gemiddelde verdelingen van de gelabelde componenten binnen het afgebeelde structuren.
Het doel van dit protocol is nauwkeurige SPA modellen die de gemiddelde lokalisaties van onderdelen binnen afgebeelde constructies volgens de in figuur 1 pijplijn te produceren. Zoals getoond in figuur 1, is de software workflow nuttige wijze verdeeld in drie fasen. De eerste fase is het segmenteren grote afbeeldingen, waardoor stapels deeltjes per kanaal. Deze deeltjes zijn de eenheden die zullen worden gemiddeld om modellen te maken en om zaden voor de generatie van het model te produceren. De tweede fase is het zaad afbeeldingen, die worden gebruikt om het geheel van de deeltjes te registreren in de slotfase genereren. Dit gebeurt door het kiezen van een referentiekanaal en handmatig te selecteren deeltjes in dit kanaal zal bijdragen aan de seeds. Zaden worden gekozen deze referentiekanaal maar kunnen worden gegenereerd voor alle kanalen. Deeltjes worden initieel uitgelijnd door het aanbrengen van een 2D Gaussische in dit kanaal. Alle deeltjes die zijn geselecteerd en opnieuw uitgelijnd worden vervolgens gemiddeld om een zaad te produceren. Voor elke gemeenschappelijke structuur gezien in de gegevens die moeten worden gemodelleerd dient deeltjes gekozen als zaden die duidelijk en nauwkeurig die structuur geven. De interface in dit stadium ook bruikbaar voor het scannen van de gegevens voor dergelijke structuren.
De laatste fase is om modellen te genereren met behulp van template matching. Dit wordt bereikt door de registratie van de deeltjes aanvankelijk onttrokken aan het zaad gegenereerde beelden in de vorige paragraaf door kruiscorrelatie. Een subset van geregistreerde deeltjes samen gemiddeld, en de werkwijze verder herhaald om model te verminderen gemiddelde gekwadrateerde fout, indien gewenst. Deze subset wordt bepaald door het instellen van een minimum overeenkomst tegen het zaad dat moet worden voldaan. Bij het maken modelTussen gelijktijdig meerdere kanalen, het gewricht gelijkenis of het gemiddelde van de overeenkomsten voor elk kanaal, wordt gebruikt. De resulterende modellen en de geregistreerde deeltjes die bijdragen aan hen kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd.
Met deze methode, zijn onderzoekers uitgerust om de macht van de SPA en SR microscopie te combineren om hoge precisie, multi-channel 2D-modellen van het eiwit architectuur van virussen en andere macromoleculaire complexen te genereren. Er moet echter een aantal belangrijke overwegingen rekening worden gehouden.
Zaden moeten worden gekozen om een structuur die consistent gezien vertegenwoordigen. Daarom moet de ruwe gegevens worden zorgvuldig geïnspecteerd voordat de zaden worden gekozen. Dit is van belang voor het voorkomen van bevooroordeeld modellen. Keuzes kunnen worden gevalideerd door het onderzoek van de minimale gelijkenis drempels nodig is om een bepaald aantal deeltjes in de modellen zijn. Duidelijk voor gekozen zaaizaad, hoe hoger deze drempel moet zijn voor een bepaald aantal deeltjes, hoe meer structuur blijkt uit de gegevens.
De template matching concept is vooral handig wanneer er heterogeniteit in de gegevens. Alle verschillende structuren die vi zijnlijk moeten worden geïdentificeerd en verschillende modellen gemaakt voor elke zaak. Door het scheiden van heterogene structuren uit een kanaal tegelijk maken van modellen in een tweede kanaal, kunnen patronen ontstaan die niet onmiddellijk zichtbaar zijn.
Een andere overweging te nemen bij het gebruik van dit algoritme is dat de procedure iteratie stochastische asymmetrie maximaliseert. Bijvoorbeeld, bij het modelleren van een structuur met twee symmetrische maxima, alle geringe asymmetrie tussen de maxima worden uitgelijnd met elkaar tijdens het iteratie, en het uiteindelijke model zullen dus maximaal asymmetrisch zijn. Als dit geeft niet bekende symmetrie in de structuur te modelleren, dan moet rekening worden gehouden. Momenteel is de enige manier om dit te vermijden is maximalisatie het aantal iteraties beperken tot 1, hoewel een mogelijke ontwikkeling zou zijn VirusMapper aan symmetrieassen nemen in het model generatieproces. Elke nieuwe versies van VirusMapper zal zijn beschiketiket op het gerefereerde website (zie Materials Table). Gebruikers zullen ook een FAQ vinden hier een gemeenschappelijke vragen te beantwoorden.
De software zoals beschreven is toepasbaar op elke structuur die kan worden afgebeeld met voldoende resolutie om de functies die de gebruiker wenst te modelleren visualiseren. Hoewel SPA resolutie kan verbeteren, zal het duidelijk niet het verbeteren van de zichtbaarheid van functies die anders niet zichtbaar zijn. Dit protocol is dus niet een werkwijze om de kwaliteit van de gegevens te verbeteren. Zoals met elke techniek, zorgvuldige monstervoorbereiding en optimalisatie van beeldvormende strategie zal de schoonste gegevens en de beste resulterende modellen bieden.
De keuze van SR beeldvormingstechniek is ook belangrijk en in het algemeen zal afhangen van het monster bij de hand. VirusMapper is gevalideerd voor gebruik met de SIM-kaart en STED 10, en het kan ook gebruikt worden met een hoge kwaliteit localisatie microscopie gegevens, maar zorg moeten worden genomen in dit geval,als luchtige herkenbaarheid kan problemen vergelijkbaar met die van asymmetrie maximalisatie veroorzaken.
Momenteel, VirusMapper de enige vrij beschikbaar algoritme voor de enkelvoudige deeltjes analyse van fluorescentiebeelden en enige algemene doeleinden 2D SPA middeling software. Andere studies die gebruik maken van dezelfde principes 4, 6 hebben gemaakt, hebben 8 aangepaste software gespecialiseerd voor ieder afzonderlijk onderzoek gebruikt. Algemene doeleinden algoritmen voor de reconstructie van 3D data zijn gepubliceerd 5, 18, hoewel er geen software is verstrekt.
Wanneer gebruikt zoals beschreven in dit artikel, kan VirusMapper worden gebruikt om precieze, nauwkeurige en robuuste modellen van de macromoleculaire eiwit architectuur van virussen en andere complexen te produceren. Met deze modellen kunnen onderzoekers nauwkeurige metingen van de gemiddelde afmetingen van de structuur te nemengelen onder studie, mogelijk waardoor ze biologische conclusies die zou hebben anders niet mogelijk geweest te bereiken.
Verder met de meervoudige kanalen van deze techniek is het mogelijk om een ongelimiteerd aantal eiwitten en complexen componenten in kaart te brengen en nieuwe proteïne organisatie ontdekken. Het onderzoeken van veranderingen in de nanoschaal structuur in verschillende biologisch relevante omstandigheden, zoals de verschillende fasen van een levenscyclus van het virus, heeft het potentieel om waardevolle inzichten geven in de biologie.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck en Kathrin Scherer bedanken voor hun bijdragen aan de oorspronkelijke ontwikkeling en validatie van VirusMapper. We willen ook graag Artur Yakimovich bedanken voor zijn kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Biologie en Biotechnologie Sciences Research Council (BB / M022374 / 1) (RH); basisfinanciering van de MRC Laboratorium voor Moleculaire Celbiologie, University College London (JM); de European Research Council (649.101-UbiProPox) (JM); en de Medical Research Council (MR / K015826 / 1) (RH en JM). RG wordt gefinancierd door de Engineering en Exacte Wetenschappen Research Council (EP / M506448 / 1).
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |