Ce manuscrit utilise le logiciel open-source basée à Fidji VirusMapper d'appliquer une analyse unique particule aux images de microscopie de super-résolution afin de générer des modèles précis de la structure à l'échelle nanométrique.
La microscopie de fluorescence super-résolution est en train de révolutionner la recherche en biologie cellulaire. Sa capacité à briser la limite de résolution de l'ordre de 300 nm permet l'imagerie de routine des complexes biologiques à l'échelle nanométrique et des processus. Cette augmentation de la résolution signifie également que les méthodes populaires en microscopie électronique, telles que l'analyse seule particule, peuvent facilement être appliquées à la microscopie de fluorescence super-résolution. En combinant cette approche analytique avec l'imagerie optique à super-résolution, il devient possible de tirer parti de la capacité d'étiquetage spécifique à la molécule de la microscopie à fluorescence pour générer des cartes d'éléments de structure moléculaire dans une structure métastable. À cette fin, nous avons développé un nouvel algorithme – VirusMapper – emballé comme un outil facile à utiliser, de haute performance et plugin ImageJ haut débit. Cet article présente un guide détaillé à ce logiciel, mettant en valeur sa capacité à découvrir de nouvelles caractéristiques structurelles biologiques mcomplexes. Molecular Nous présentons ici comment assembler des données compatibles et de fournir un protocole étape par étape sur la façon d'utiliser cet algorithme pour appliquer une analyse unique particule images à haute résolution.
Super-résolution (SR) La microscopie a eu un impact majeur sur la biologie cellulaire en offrant la possibilité d'images clés processus moléculaires ainsi que le marquage spécifique moléculaire crucial pour les comprendre. SR permet maintenant la microscopie optique à approcher les résolutions (20-150 nm) jusqu'ici réalisables avec la microscopie électronique (EM) tout en conservant les principaux avantages de la microscopie optique, tels que le potentiel de l' image des cellules vivantes 1, 2. En outre, la conservation de la structure trouvée à l'échelle nanométrique permet l'application d' une analyse unique de particules (SPA) à des données de RS, un concept largement utilisé en microscopie électronique 3. En utilisant SPA, de copies hautement conservées d'une structure peut être imagée et moyenne ensemble pour améliorer la résolution, la précision ou signal bruit de l'objet visualisé. Lorsqu'il est utilisé en combinaison avec SR, SPA a été démontré être un outil puissant pour le haut-pla cartographie recision des composants du complexe du pore nucléaire 4, 5, 6, centrosomes et des virus tels que le VIH 7 et 8 HSV-1.
Cependant, l'application combinée de routine SR et SPA a été contestée par un manque de logiciels disponibles. Pour cette raison, nous avons développé VirusMapper, un plug – in pour le logiciel de traitement d'image populaire ImageJ / Fidji 9. Ceci est le premier logiciel librement disponible pour SPA généralisée avec des images de fluorescence 10 conçues pour fournir une moyenne rapide, naïve, multi-canal convivial des structures imagées par microscopie SR. Bien que conçu pour les virus, il peut être appliqué à tout complexe macromoléculaire dans lequel les différentes espèces moléculaires peuvent être imagés, identifiés et localisés.
VirusMapper peut être utilisé pour produire moléculaire de haute précisionles modèles de toute structure connue, permettant le calcul des dimensions moyennes et d'autres paramètres. La conception de l'algorithme rend particulièrement utile pour séparer les populations de structures, prévoyant la détermination des orientations distinctes ou différents états morphologiques. En outre, l'imagerie multi-canaux peut être utilisé pour utiliser un canal de référence dans le cas où la structure sous-jacente est bien connu, permettant ainsi la découverte de la structure à base de référence. Les instructions pour le téléchargement et l' installation du logiciel sont fournis sur https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Exemple de données peuvent également être trouvées ici, et les utilisateurs sont invités à pratiquer l'utilisation du logiciel sur l'exemple des données avant de tenter de l'appliquer à eux-mêmes.
Ici, les étapes pour utiliser ce plugin pour produire des modèles de SPA à partir de données brutes sont décrites. Le logiciel prend des images brutes contenant o uniquer structures à étiquettes multiples en entrée. Il revient, sous réserve d'un certain nombre de paramètres sont ajustés comme le logiciel est exécuté, les modèles SPA montrant les distributions moyennes des composants marqués dans les structures imagées.
Le but de ce protocole est de produire des modèles de SPA précises donnant les localisations moyennes de composants au sein des structures imagées selon l'pipeline présenté sur la figure 1. Comme le montre la Figure 1, le flux de travail de logiciel est utilement divisé en trois étapes. La première étape consiste à segmenter des images de taille, ce qui entraîne des piles de particules pour chaque canal. Ces particules sont les unités qui seront moyennées pour créer des modèles et de produire des semences pour la production de modèles. La deuxième étape consiste à générer des images de semences, qui sont utilisés pour enregistrer l'ensemble des particules dans la phase finale. Cela se fait en choisissant un canal de référence et la sélection manuelle des particules dans ce canal qui contribuera à la seeds. Les graines sont choisies dans ce canal de référence, mais peuvent être générés pour tous les canaux. Les particules sont initialement réalignés en ajustant une gaussienne 2D dans ce canal. Toutes les particules qui ont été sélectionnés et réalignés sont ensuite moyennées pour produire une graine. Pour chaque structure commune vu dans les données à modéliser, les particules doivent être choisies comme des graines qui représentent de façon claire et précise que la structure. L'interface à ce stade est également utile pour la numérisation des données pour de telles structures.
La dernière étape consiste à générer des modèles en utilisant la correspondance de modèle. Ceci est obtenu grâce à l'enregistrement des particules extraites à l'origine pour les images de semences produites dans la section précédente par corrélation croisée. Un sous-ensemble de particules moyenne est enregistré en même temps, et le procédé est en outre itérée afin de réduire l'erreur quadratique moyenne modèle, si on le souhaite. Ce sous-ensemble est déterminée en définissant une similitude minimale contre la graine qui doit être satisfaite. Lors de la création modèles simultanément dans plusieurs canaux, la similitude commune, ou la moyenne des similarités pour chaque canal, est utilisé. Les modèles résultants et les particules enregistrées qui les ont contribué à peuvent ensuite être analysées.
Avec cette méthode, les chercheurs disposent de combiner la puissance de la microscopie SPA et SR afin de générer de haute précision, les modèles 2D multi-canal de l'architecture des protéines de virus et d'autres complexes macromoléculaires. Cependant, il faut prendre quelques considérations importantes en compte.
Les graines doivent être choisis pour représenter une structure qui est toujours vu. Ainsi, les données brutes doivent être soigneusement inspectés avant que les graines sont choisies. Ceci est important pour la prévention des modèles biaisées. Les choix peuvent être validés par l'examen des seuils de similarité minimale requise pour inclure un certain nombre de particules dans les modèles. Il est clair que, pour un choix de semences, plus ce seuil doit être pour un nombre donné de particules, plus cette structure est apparente dans les données.
Le concept de correspondance de modèle est particulièrement utile quand il existe une hétérogénéité dans les données. Toutes les différentes structures qui sont vible doivent être identifiés et différents modèles créés pour chaque cas. En séparant les structures hétérogènes dans un canal, mais en créant simultanément des modèles dans un second canal, les modèles peuvent émerger qui n'auraient pas été immédiatement évidente.
Une autre considération à prendre en compte lors de l'utilisation de cet algorithme est que la procédure d'itération permettra de maximiser l'asymétrie stochastique. Par exemple, lors de la modélisation d'une structure avec deux maxima symétrique, toutes les légères dissymétries entre les maxima sont alignés les uns avec les autres lors de l'itération, et le modèle final seront donc au maximum asymétrique. Si cela ne reflète pas une symétrie connue dans la structure en cours de modélisation, alors cela devrait être pris en compte. À l'heure actuelle, la seule façon d'éviter cette maximisation est de limiter le nombre d'itérations à 1, bien qu'un potentiel de développement serait pour VirusMapper d'incorporer des axes de symétrie dans le processus de génération de modèle. Toutes les nouvelles versions de VirusMapper seront avaiD spon sur le site Web référencé (voir tableau des matériaux). Les utilisateurs trouveront également une FAQ ici pour répondre à toutes les questions communes.
Le logiciel tel que décrit est applicable à toute structure qui peut être imagée avec une résolution suffisante pour visualiser les caractéristiques que l'utilisateur souhaite modéliser. Bien que SPA peut améliorer la résolution, il ne sera pas clairement améliorer la visibilité des caractéristiques qui sont par ailleurs pas visibles. Ce protocole est donc pas une méthode pour améliorer la qualité des données. Comme toute technique, une préparation minutieuse de l'échantillon et l'optimisation de la stratégie d'imagerie fournira les plus propres données et les meilleurs modèles résultants.
Le choix de la modalité d'imagerie SR est également important et, en général, dépendra de l'échantillon à portée de main. VirusMapper a été validé pour fonctionner avec la carte SIM et STED 10, et il peut également être utilisé avec des données de microscopie de localisation de haute qualité, mais il faut prendre soin , dans ce cas,que l'étiquetage clairsemés pourrait causer des problèmes similaires à ceux de la maximisation de l'asymétrie.
À l'heure actuelle, VirusMapper est l'algorithme que librement disponible pour l'analyse unique particule d'images de fluorescence et le seul usage général logiciel de calcul de la moyenne 2D SPA. D' autres études qui ont fait usage des mêmes principes 4, 6, 8 ont utilisé un logiciel personnalisé spécialisé pour chaque étude. Algorithmes à usage général pour la reconstruction des données 3D ont été publiées 5, 18, même si aucun logiciel n'a été fourni.
Lorsqu'il est utilisé comme décrit dans cet article, VirusMapper peut être utilisé pour produire des modèles précis, précis et robuste de l'architecture des protéines macromoléculaire de virus et d'autres complexes. Avec ces modèles, les chercheurs peuvent prendre des mesures précises des dimensions moyennes des structUres à l'étude, ce qui pourrait leur permettre d'atteindre des conclusions biologiques qui n'auraient pas été autrement possible.
En outre, les capacités multi-canaux de cette technique, il est possible de mapper un nombre illimité de protéines et de composants au sein de complexes et de découvrir l'organisation de nouvelles protéines. Examiner les changements dans la structure nanométrique dans différentes conditions biologiquement pertinentes, telles que différentes étapes d'un cycle de vie du virus, a le potentiel d'offrir des indications précieuses sur la biologie.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Pereira Matos, Christopher Bleck, et Kathrin Scherer pour leur contribution au développement initial et la validation des VirusMapper. Nous tenons également à remercier Artur Yakimovich pour sa lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions de la biotechnologie et du Conseil de recherches en sciences biologiques (BB / M022374 / 1) (RH); financement de base au Laboratoire MRC de biologie cellulaire et moléculaire, University College London (JM); le Conseil européen de la recherche (649101-UbiProPox) (JM); et le Conseil de recherches médicales (MR / K015826 / 1) (RH et JM). RG est financé par le Conseil ingénierie et sciences physiques de la recherche (EP / M506448 / 1).
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |