この原稿は、ナノスケールの構造の正確なモデルを生成するために、超解像顕微鏡画像に単一粒子の分析を適用するVirusMapperフィジーベースのオープン・ソース・ソフトウェア・パッケージを使用しています。
超解像蛍光顕微鏡は、現在、細胞生物学の研究に革命を起こしています。約300ナノメートルの分解能の限界を打破する能力は、ナノスケールの生物学的複合体およびプロセスの日常イメージングが可能になります。解像度の増加はまた、単一粒子分析のような電子顕微鏡において一般的な方法は、容易に超解像蛍光顕微鏡に適用することができることを意味します。超解像光の撮像と、この分析手法を組み合わせることにより、準安定構造内の分子素子の構造のマップを生成するために、蛍光顕微鏡の分子に特異的な標識能力を活用することが可能となります。この目的のために、我々は新しいアルゴリズムを開発した – VirusMapper – 使いやすい、高性能、および高スループットのImageJのプラグインとしてパッケージ化。この記事では、生物学的メートル新規な構造的特徴を発見する能力を披露し、このソフトウェアへの綿密なガイドを提示しますolecular複合体。ここでは、互換性のあるデータをアセンブルし、超解像画像に単一粒子分析を適用するには、このアルゴリズムを使用する方法のステップバイステップのプロトコルを提供する方法を提示します。
超解像(SR)顕微鏡は、それらを理解するのに重要な分子特異的な標識と一緒に画像のキー分子プロセスに能力を提供することにより、細胞生物学に大きな影響を与えています。 SRは、現在、このような画像生細胞1、2の電位としての光学顕微鏡の主要な利点を保持しつつ、電子顕微鏡(EM)により以前にのみ達成可能解像度(20〜150 nm)を接近する光学顕微鏡を可能にします。さらに、ナノスケールレベルで見出される構造的保存は、SRデータの単一粒子分析(SPA)、電子顕微鏡3で広く使用される概念の応用を可能にします。 SPAを使用して、構造体の多くの高度に保存されたコピーは、画像化され、解像度、精度、または信号対ノイズ可視化オブジェクトのを改善するために一緒に平均化することができます。 SRと組み合わせて使用すると、SPAは、高Pのための強力なツールであることが実証されています核膜孔複合体4,5の構成要素、中心体6、及びそのようなHIV 7及びHSV-1~8などのウイルスのrecisionマッピング。
しかし、SRおよびSPAのルーチンを組み合わせたアプリケーションは、利用可能なソフトウェアの欠如によって挑戦されています。このような理由から、我々はVirusMapper、人気の画像処理ソフトImageJを/フィジー9のプラグインを開発しました。これは、SR顕微鏡で画像化された構造の速い、ユーザーフレンドリーな、マルチチャンネルナイーブ平均を提供するために設計された蛍光画像10と一般SPAの最初の自由に利用可能なソフトウェアパッケージです。ウイルスのために設計されているが、それは、異なる分子種が、撮像された識別され、そして局在化することができる任意の高分子複合体にも適用することができます。
VirusMapperは、高精度の分子を生成するために使用することができます平均寸法および他のパラメータの計算を可能にする任意の既知の構造モデル。アルゴリズム設計は、明確な方向性や異なる形態学的状態の決意を提供する、構造体の集団を分離するために特に有用なものにします。また、マルチチャネルイメージングは、これにより参照ベース構造の発見を可能にする、基礎となる構造はよく知られている場合には、基準チャネルを使用するために使用することができます。ソフトウェアをダウンロードし、インストールするための命令が上に設けられているhttps://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper 。例データもあり見つけることができ、ユーザーは自分のに適用しようとする前に、例えば、データ上のソフトウェアを使用して練習することをお勧めします。
ここでは、生データからのSPAモデルを生成するために、このプラグインを使用するための手順が説明されています。ソフトウェアは、シングルOを含むRAW画像を取ります入力としてマルチ標識構造はRとなります。これは、ソフトウェアが実行されるように調整されるパラメータの数、撮像された構造内の標識された成分の平均分布を示すSPAモデルの対象返します。
このプロトコルの目的は、図1に概説パイプラインに係る撮像された構造内の構成要素の平均局在を与える正確なSPAモデルを生成することです。 図1に示すように、ソフトウェア・ワークフローは有用3つの段階に分けられます。第一段階は、各チャンネルの粒子の積み重ね、その結果、セグメントの拡大イメージです。これらの粒子は、モデルを作成し、モデル生成のためのシードを生成するために平均化される単位です。第二段階は、最終段階での粒子のセット全体を登録するために使用されるシード画像を生成することです。これは、基準チャネルを選択し、手動のに貢献するこのチャネル内の粒子を選択することによって行われますEEDS。種子は、この基準チャネルに選択されるが、全てのチャンネルのために生成することができます。粒子は、最初にこのチャネルで2次元ガウシアンをフィットさせることによって再調整されます。選択及び再整列されたすべての粒子は、次いで、種子を生産するために平均化されます。モデル化されるデータに見られる各共通構造のために、粒子は、明確かつ正確にその構造を表すシードとして選択されるべきです。この段階でのインタフェースはまた、そのような構造のためのデータをスキャンするために有用です。
最終段階は、テンプレートマッチングを用いてモデルを生成することです。これは、本来相互相関によって、前のセクションで生成されたシード画像に抽出した粒子の登録によって達成されます。登録された粒子のサブセットが一緒に平均化され、そしてプロセスはさらに、所望であれば、平均二乗誤差モデルを減少させるために繰り返されます。このサブセットは、満たされなければならない種子に対して最小の類似度を設定することによって決定されます。モデルを作成する場合複数のチャンネルで同時にsは、関節の類似性、又は各チャネルの類似度の平均値が用いられます。それらに貢献し、得られたモデルと登録された粒子は、その後、さらに分析することができます。
この方法で、研究者は、ウイルスおよび他の高分子複合体のタンパク質構造の高精度、多チャンネルの2次元モデルを生成するために、SPA及びSR顕微鏡の力を結合するために装備されています。しかし、いくつかの重要な考慮事項が考慮されるべきです。
種子は、一貫して見られる構造を表現するために選択されるべきです。種子が選択される前にこのように、生のデータを慎重に検査しなければなりません。これは、バイアスされたモデルを防止するために重要です。選択肢は、モデル中の粒子の特定の数を含むのに必要な最小の類似性閾値の検査によって検証することができます。明らかに、シードの選択のために、より高いこのしきい値は、粒子の所与の数、構造データには明らかであることがよりためする必要があります。
データの不均一がある場合には、テンプレートマッチングのコンセプトは特に便利です。 viのあるすべての異なる構造sibleが特定されなければならないと異なったモデルは、それぞれの場合のために作成します。一つのチャンネルでの異種構造を分離するが、同時に第二のチャネルでモデルを作成することにより、パターンがそれはすぐに明らかにされていませんでし出現することがあります。
このアルゴリズムを使用する際に注意すべきもう1つの考慮事項は、反復手順が確率的非対称性を最大化することです。 2つの対称の最大値を有する構造をモデル化する場合、例えば、最大値の間のすべてのわずかな非対称性は、反復中に互いに整列され、最終的なモデルは、このように最大限に非対称です。これは、モデル化された構造で知られている対称性を反映していない場合、これは考慮すべきです。現在、この最大化を回避するための唯一の方法は、VirusMapperは、モデル生成プロセスに対称軸を組み込むことのために潜在的な開発が可能だろうが、1回の反復の数を制限することです。 VirusMapperのすべての新しいバージョンでは、のAvaIになります参照ウェブサイト上でlable( 材料表を参照してください)。また、ユーザーは任意の一般的なクエリに答えるために、ここでよくある質問を検索します。
説明したようにソフトウェアにより、ユーザは、モデル化することを望む特徴を視覚化するために十分な解像度で画像化することができる任意の構造に適用可能です。 SPAは、分解能を向上させることができるが、それは明らかにそうでないと見えない特徴の視認性を改善しないであろう。このプロトコルは、従って、データの品質を向上させる方法ではありません。任意の技術と同様に、イメージング戦略の慎重なサンプル調製および最適化は、クリーンデータと最良の結果のモデルを提供します。
SRイメージングモダリティの選択は、一般的には、手元にあるサンプルに依存し、また重要であると。 、VirusMapperはSIMとSTED 10でうまく動作することが確認されており、それはまた、高品質な局在化顕微鏡のデータを使用することができますが、注意が、この場合には注意が必要ですスパースとして標識は非対称性の最大化と同様の問題を引き起こす可能性があります。
現在、VirusMapperは、蛍光画像の単一粒子分析のみ汎用2D SPA平均化ソフトウェアのための唯一の自由に利用可能なアルゴリズムです。同じ原則4、6の使用をした他の研究では、8は、それぞれ特定の研究に特化したカスタムソフトウェアを使用していました。何のソフトウェアが提供されなかったが、3Dデータの再構築のための汎用アルゴリズムは、5、18を発表されています。
この記事に記載されているように使用される場合、VirusMapperは、ウイルスやその他の複合体の高分子タンパク質構造の、正確な正確、かつ堅牢なモデルを生成するために使用することができます。これらのモデルでは、研究者は、構造体の平均寸法の正確な測定を行うことができます検討中のURESは、潜在的に彼らがそうでなければ不可能でした生物学的な結論に到達することを可能にします。
また、この技術のマルチチャネル機能では、複合体中のタンパク質および成分を無制限にマッピングし、新規タンパク質組織を発見することが可能です。そのようなウイルスのライフサイクルの各段階として、異なる生物学的に関連する条件、ナノスケール構造の変化を調べると、生物学に貴重な洞察を提供する可能性を秘めています。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、VirusMapperのオリジナルの開発と検証への貢献のためコリーナ・ビアリ、ジェジー・サモールジ、ペドロ・マトス・ペレイラ、クリストファー・ブレック、とカトリン・シーラー感謝したいと思います。また、原稿の彼の重要な読書のためアルトゥール・ヤカムービック感謝したいと思います。この作品は、バイオテクノロジー・生物科学研究会議(BB / M022374 / 1)(RH)からの助成金によって賄われていました。分子細胞生物学のためのMRC研究所のコア資金、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン(JM)。欧州研究評議会(649101-UbiProPox)(JM)。医療研究評議会(MR / K015826 / 1)(RHとJM)。 RGは、工学・物理科学研究会議(EP / M506448 / 1)によって運営されています。
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |