Dette manuskriptet bruker Fiji-basert open-source programvarepakke VirusMapper å anvende enkeltpartikkelanalyse til super-oppløsning mikroskopi bilder for å generere nøyaktige modeller av nanoskala struktur.
Super-oppløsning fluorescens mikroskopi for tiden revolusjonerer cellebiologi forskning. Dens evne til å bryte grensen oppløsningen på rundt 300 nm gjør det mulig for den rutinemessige avbildning av nanoskala biologiske komplekser og prosesser. Denne økningen i oppløsning betyr også at metoder populære i elektronmikroskopi, for eksempel enkeltpartikkelanalyse, kan lett anvendes på super oppløsning fluorescens mikroskopi. Ved å kombinere denne analytiske metode med super-oppløsning optisk avbildning, blir det mulig å dra nytte av molekylet-spesifikke merking kapasitet av fluorescens mikroskopi for å generere strukturelle kartene over molekylære elementer i en metastabil struktur. For å oppnå dette, har vi utviklet en ny algoritme – VirusMapper – pakkes som en lett-å-bruke, høy ytelse og høy gjennomstrømming ImageJ plugin. Denne artikkelen presenterer en grundig guide til denne programvare, som viser dens evne til å avdekke nye konstruktive trekk i biologisk molecular komplekser. Her presenterer vi hvordan man skal sette sammen data som er kompatible og gi en trinn-for-trinn-protokollen på hvordan man skal bruke denne algoritmen for å anvende enkeltpartikkelanalyse til super-oppløsning.
Super-oppløsning (SR) Mikroskopi har hatt en stor innvirkning på cellebiologi å oppnå en mulighet til å bilde viktige molekylære prosesser sammen med den molekylære spesifikk merking avgjørende for forståelsen dem. SR muliggjør nå lysmikroskopi for å nærme seg de oppløsninger (20-150 nm) som tidligere bare oppnås med elektronmikroskopi (EM) ved opprettholdelse av de store fordelene med lysmikroskopi, slik som potensialet for bilde levende celler 1, 2. Videre, den strukturelle bevaring funnet på nanoskala nivå tillater anvendelsen av enkeltpartikkelanalyse (SPA) til SR data, et begrep som brukes i stor utstrekning i elektronmikros 3. Ved hjelp av SPA, kan mange høykonserverte kopier av en struktur skal avbildes, og i gjennomsnitt sammen for å forbedre oppløsning, nøyaktighet, eller signal-til-støy av visualisert objektet. Når den brukes i kombinasjon med SR har SPA blitt vist å være et kraftig verktøy for høy-precision kartlegging av komponenter av det nukleære pore-komplekset 4, 5, 6, centrosomer og virus, så som HIV 7 og HSV-1 8.
Imidlertid har rutinen kombinert anvendelse av SR og SPA blitt utfordret ved en mangel på tilgjengelig programvare. Av denne grunn har vi utviklet VirusMapper, en plugin til det populære bildebehandlingsprogram ImageJ / Fiji 9. Dette er den første fritt tilgjengelig programvarepakke for generalisert SPA med fluorescens bilder 10 utformet for å gi rask, brukervennlige, flerkanals naive midling av strukturer bilde av med SR mikroskopi. Selv om utformet for virus, kan det brukes et hvilket som helst makromolekylært kompleks i hvilket forskjellige molekylarter kan avbildes, identifisert, og lokalisert.
VirusMapper kan brukes til å produsere høy presisjon molekylmodeller av hvilken som helst kjent konstruksjon, slik at for beregning av midlere dimensjoner og andre parametere. Algoritmen utforming gjør den særlig egnet for separering av populasjoner av strukturer, som gir for bestemmelse av forskjellige orienteringer eller ulike morfologiske tilstander. Dessuten kan flerkanals avbildning benyttes til å anvende en referansekanal i tilfeller hvor den underliggende konstruksjon er velkjent, for derved å mulig referanse basert struktur oppdagelse. Instruksjonene for å laste ned og installere programvaren er gitt på https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Eksempel data kan også bli funnet der, og brukerne oppfordres til å øve på å bruke programvaren på eksempel data før du prøver å bruke den til sin egen.
Her er fremgangsmåten for å bruke denne plugin for å produsere SPA modeller fra rådata beskrevet. Programmet tar rå bilder som inneholder enkelt- or multi-merkede konstruksjoner som inndata. Den returnerer, i henhold til et antall parametre som er justert som programmet kjøres, SPA modeller som viser de gjennomsnittlige fordelingen av de merkede komponentene i den avbildede strukturer.
Målet med denne protokollen er å frembringe presise SPA-modeller som gir de gjennomsnittlige lokaliseringer av komponenter innenfor avbildede strukturer i henhold til rørledningen skissert i figur 1. Som vist i figur 1, er programvaren arbeidsflyt med fordel deles inn i tre faser. Det første trinn er å dele opp store bilder, noe som resulterer i stabler av partikler for hver kanal. Disse partikler er enhetene som skal gjennomsnitt av for å lage modeller og for å produsere frø for modellgenereringen. Det andre trinnet er å generere frø bilder, som brukes til å registrere hele settet av partikler i det siste trinn. Dette gjøres ved å velge en referansekanal og ved manuelt valg av partiklene i denne kanalen som vil bidra til den seeds. Frø er valgt i denne referansen kanal, men kan bli generert for alle kanaler. Partikler blir først gjeninnrettet ved å tilpasse en 2D-gaussisk i denne kanalen. Alle partikler som har blitt valgt og realigned er så tatt gjennomsnitt av for å produsere et kim. For hver felles struktur sees i dataene som skal modelleres, bør partiklene velges som frø som klart og nøyaktig representerer den struktur. Grensesnittet på dette stadiet er også nyttig for å skanne data for slike strukturer.
Det siste trinnet er å generere modeller ved bruk av mal tilpasning. Dette oppnås ved registrering av partiklene som opprinnelig utvunnet til frøet bildene som genereres i det foregående avsnitt ved krysskorrelasjon. En undergruppe av registrerte partikler blir midlet sammen, og fremgangsmåten er videre iterert for å redusere modell gjennomsnittlig kvadratisk feil, om ønskelig. Dette undersett bestemmes ved å sette et minimums likhet mot frø som må være oppfylt. Ved oppretting av modellens samtidig i flere kanaler, felles likhet, eller gjennomsnittet av likhetene for hver kanal, blir brukt. De resulterende modeller og de registrerte partikler som bidro til dem kan deretter bli ytterligere analysert.
Med denne metoden er utstyrt forskere til å kombinere effekten av SPA og SR mikroskopi for å generere høy presisjon, flerkanals 2D modeller av proteinet arkitekturen av virus og andre makromolekylære komplekser. Imidlertid bør noen viktige hensyn tas i betraktning.
Frø bør velges for å representere en struktur som er konsekvent sett. Således skal de rå data kontrolleres nøye før frøene er valgt. Dette er viktig for å forebygge forspente modeller. Valgene kan bekreftes ved undersøkelsen av minste Likhetene terskler for å omfatte et visst antall partikler i modellene. Det er klart for et utvalg av frø, jo høyere denne terskelen må være for et gitt antall av partikler, er det mer at strukturen synlig i dataene.
Malen samsvar Konseptet er spesielt nyttig når det er heterogenitet i dataene. Alle ulike strukturer som er VISible bør identifiseres og ulike modeller opprettet for hvert tilfelle. Ved å skille heterogene strukturer i en kanal, men samtidig skape modeller i en andre kanal, kan det vise seg at mønstrene ville ikke ha vært umiddelbart innlysende.
En annen vurdering å være klar over når du bruker denne algoritmen er at gjentakelse prosedyren vil maksimere stokastisk asymmetri. For eksempel, ved modellering av en struktur med to symmetrisk maksima, alle små asymmetrier mellom maksima vil være på linje med hverandre under iterasjonen, og den endelige modell vil derfor være maksimalt asymmetrisk. Hvis dette ikke reflekterer en kjent symmetri i konstruksjonen som blir modellert, bør dette tas i betraktning. For tiden er den eneste måten å unngå dette på maksimering er å begrense antallet iterasjoner til en, selv om en eventuell utbygging ville være for VirusMapper å innlemme symmetriaksene til modellen genereringsprosessen. Eventuelle nye versjoner av VirusMapper vil være tilgjengelig på felleslable på den refererte nettsted (se Materialer tabell). Brukerne vil også finne en FAQ her for å svare på eventuelle vanligste spørsmålene.
Programvaren som beskrevet er anvendbar for en hvilken som helst struktur som kan avbildes med tilstrekkelig oppløsning for å visualisere de funksjonene som brukeren ønsker å modellere. Selv SPA kan forbedre oppløsning, er det helt klart ikke vil bedre synligheten av egenskaper som ellers ikke er synlige. Denne protokollen er derfor ikke en fremgangsmåte for å forbedre kvaliteten på dataene. Som med en hvilken som helst teknikk, forsiktig prøvepreparering og optimalisering av avbildnings strategi vil gi de reneste data og de beste resulterende modeller.
Valget av SR avbildningsmetoden er også viktig, og, generelt, vil avhenge av prøven for hånden. VirusMapper har blitt validert for å fungere godt sammen med SIM og STED 10, og det kan også brukes med høy kvalitet lokalisering mikroskopi data, men forsiktighet bør utvises i dette tilfellet,så sparsom merking kan føre til problemer som ligner på de av asymmetri maksimering.
For tiden, er den eneste VirusMapper fritt tilgjengelig algoritme for enkeltpartikkelanalyse av fluorescensbilder og den eneste generell 2D SPA midling programvare. Andre studier som har gjort bruk av de samme prinsippene 4, 6, 8 har brukt tilpasset programvare spesialisert for hvert enkelt studium. Generelle algoritmer for gjenoppbyggingen av 3D-data har blitt publisert 5, 18, selv om ingen programvare ble gitt.
Når den brukes som beskrevet i denne artikkelen, kan VirusMapper brukes til å produsere presise, nøyaktige, robuste og modeller av den makromolekylære proteinet arkitekturen av virus og andre komplekser. Med disse modellene, kan forskere ta nøyaktige målinger av de gjennomsnittlige dimensjoner av structmed figurene som studeres, potensielt gi dem muligheten til å nå biologiske konklusjoner som ikke ellers ville ha vært mulig.
Videre, med de flerkanals egenskapene til denne teknikk, er det mulig å kartlegge et ubegrenset antall av proteiner og komponenter i komplekser og for å oppdage nytt protein organisasjon. Undersøke endringer i nanoskala struktur i ulike biologisk relevante forhold, for eksempel ulike stadier av et virus livssyklus, har potensial til å gi verdifull innsikt i biologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck, og Kathrin Scherer for deres bidrag til den opprinnelige utvikling og validering av VirusMapper. Vi vil også gjerne takke Artur Yakimovich for hans kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeid ble støttet med tilskudd fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB / M022374 / 1) (RH); kjernefinansiering til MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London (JM); European Research Council (649101-UbiProPox) (JM); og Medical Research Council (MR / K015826 / 1) (RH og JM). RG er finansiert av Engineering og Fysisk Sciences Research Council (EP / M506448 / 1).
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |