Detta manuskript använder Fiji-baserade open-source mjukvara VirusMapper att tillämpa en enda partikelanalys till super-upplösning mikroskopi bilder för att generera exakta modeller av nanostruktur.
Super-upplösning fluorescensmikroskopi närvarande revolutionera cellbiologisk forskning. Dess förmåga att bryta upplösningsgränsen på ca 300 nm möjliggör rutin avbildning av nanoskala biologiska komplex och processer. Denna ökning i upplösning innebär också att metoder populära i elektronmikroskopi, såsom enkelpartikelanalys, lätt kan tillämpas på super upplösning fluorescensmikroskopi. Genom att kombinera denna analytisk metod med superupplösning optisk avbildning, blir det möjligt att dra fördel av molekylen specifika märkning kapacitet fluorescensmikroskopi för att generera strukturella kartor över molekylära element inom en metastabil struktur. För detta ändamål har vi utvecklat en ny algoritm – VirusMapper – paketeras som en enkel att använda, hög prestanda och hög genomströmning ImageJ plugin. Den här artikeln presenterar en fördjupad guide till detta program, visa upp sin förmåga att upptäcka nya strukturella egenskaper i biologisk molecular komplex. Här presenterar vi hur man monterar kompatibla data och ger en steg-för-steg-protokollet om hur man använder denna algoritm för att tillämpa en enda partikelanalys till super-upplösning.
Super upplösning (SR) mikroskopi har haft en stor inverkan på cellbiologi genom förmågan att bilden viktiga molekylära processer tillsammans med molekyl särskild märkning avgörande för att förstå dem. SR möjliggör nu Ijusmikroskopi att närma de resolutioner (20-150 nm) som tidigare endast kan uppnås med elektronmikroskopi (EM) under bibehållande av de stora fördelarna med Ijusmikroskopi, såsom potentialen att bild levande celler 1, 2. Vidare, den strukturella bevarande finns på nanonivå nivå tillåter applicering av en enda partikelanalys (SPA) till SR uppgifter, ett begrepp som används i stor utsträckning i elektronmikroskopi 3. Med användning av SPA, kan många mycket konserverade kopior av en struktur skall avbildas och medelvärdesbildas tillsammans för att förbättra upplösningen, precision, eller signal-till-brus hos den visualiserade objektet. Vid användning i kombination med SR har SPA visat sig vara ett kraftfullt verktyg för hög precision kartläggning av komponenterna i den kärnpor komplex 4, 5, centrosomer 6, och virus, såsom HIV 7 och HSV-1 8.
Dock har rutinen kombinerad tillämpning av SR och SPA ifrågasatts av en brist på tillgänglig programvara. Av den anledningen har vi utvecklat VirusMapper, en plugin till den populära bildbehandlingsprogram ImageJ / Fiji 9. Detta är den första fritt tillgängliga mjukvarupaket för generaliserad SPA med fluorescens bilder 10 utformade för att ge snabb, användarvänlig, flerkanaligt naiva medelvärdes av strukturer avbildas med SR mikroskopi. Fastän utformad för virus, kan det tillämpas på alla makromolekylära komplex i vilka olika molekylslag kan avbildas, identifieras och lokaliseras.
VirusMapper kan användas för att producera hög precision molekylmodeller av vilken som helst känd konstruktion, vilket möjliggör beräkning av de genomsnittliga dimensioner och andra parametrar. Algoritmen design gör den särskilt användbar för att separera populationer av strukturer, som ger för bestämning av distinkta orienteringar eller olika morfologiska tillstånd. Dessutom kan flerkanalig avbildning användas för att utnyttja en referenskanal i de fall där den underliggande strukturen är välkänd, vilket möjliggör för referens baserad struktur upptäckt. Instruktionerna för att hämta och installera programvaran finns på https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Exempeldata kan också hittas där, och användare uppmanas att öva använda programvaran på exempeldata innan du försöker tillämpa den på egen hand.
Här är stegen för att använda denna plugin för att producera SPA modeller från rådata som beskrivs. Programvaran tar RAW-bilder som innehåller en- or multi-märkta strukturer som indata. Den återvänder, under förutsättning att ett antal parametrar som är placerad programmet körs, SPA-modeller som visar den genomsnittliga fördelningarna av de märkta komponenterna inom avbildade strukturer.
Målet med detta protokoll är att producera exakta SPA modeller som ger de genomsnittliga lokaliseringar av komponenter inom avbildade strukturer enligt rörledningen skisseras i figur 1. Såsom visas i fig 1, är programvaran arbetsflöde med fördel uppdelad i tre steg. Det första steget är att segment stora bilder, vilket resulterar i travar av partiklar för varje kanal. Dessa partiklar är de enheter som kommer att medelvärdes att skapa modeller och producera frön för modellgenerering. Det andra steget är att generera utsädes bilder, som används för att registrera hela uppsättningen partiklar i slutskedet. Detta görs genom att välja en referenskanal och manuellt välja partiklar i denna kanal som kommer att bidra till sEEDS. Frön väljs i detta referenskanalen men kan genereras för alla kanaler. Partiklarna initialt uträtad genom att anpassa en 2D gaussisk i denna kanal. Alla partiklar som har valts och omgrupperade sedan i genomsnitt för att producera ett frö. För varje gemensam struktur ses i de data som skall modelleras, bör partiklarna väljas som frön som tydligt och korrekt representerar den strukturen. Gränssnittet i detta skede är också användbar för avsökning av data för sådana strukturer.
Det sista steget är att generera modeller med hjälp av mallmatchning. Detta uppnås genom registrering av partiklarna som ursprungligen extraherats till utsädes bilder som genereras i föregående avsnitt av korskorrelation. En delmängd av registrerade partiklar medelvärdes tillsammans, och processen vidare itereras för att minska modell medelkvadratfelet, om så önskas. Denna delmängd bestäms genom att sätta en minimi likhet mot frö som måste uppfyllas. När du skapar modellens samtidigt i flera kanaler, det gemensamma likheten, eller genomsnittet av likhet för varje kanal, används. De resulterande modellerna och de registrerade partiklar som bidrog till dem kan sedan analyseras ytterligare.
Med denna metod är forskare utrustade för att kombinera kraften av SPA och SR mikroskopi för att generera hög precision, flerkana 2D modeller av proteinarkitekturen av virus och andra makromolekylära komplex. Dock bör vissa viktiga överväganden beaktas.
Frön bör väljas för att representera en struktur som konsekvent ses. Därför bör de rådata kontrolleras noggrant innan fröna väljs. Detta är viktigt för att förhindra partiska modeller. Valen kan valideras av granskningen av minimilikhetströsklar som krävs för att inkludera ett visst antal partiklar i modellerna. Tydligt, för ett urval av utsäde, ju högre denna tröskel måste vara för ett givet antal partiklar, är det mer att strukturen uppenbara i data.
Mallen matchande konceptet är särskilt användbart när det finns heterogenitet i data. Alla olika strukturer som är viligt bör identifieras och olika modeller skapas för varje enskilt fall. Genom att separera heterogena strukturer i en kanal men samtidigt skapa modeller i en andra kanal, kan mönster växa fram som skulle inte ha varit omedelbart uppenbart.
En annan faktor att vara medveten om när man använder denna algoritm är att iteration förfarandet kommer att maximera stokastisk asymmetri. Till exempel, när modellering av en struktur med två symmetriska maxima, alla små asymmetrier mellan maxima kommer att anpassas till varandra under iterationen, och den slutliga modellen kommer således att vara maximalt asymmetriskt. Om detta inte återspeglar en känd symmetri i strukturen som modelleras, då detta bör beaktas. För närvarande är det enda sättet att undvika detta maxime är att begränsa antalet iterationer till 1, även om en potentiell utveckling skulle vara för VirusMapper att införliva symmetriaxlarna i modellen genereringen. Alla nya versioner av VirusMapper blir Avaletiketten på den refererade webbplats (se Material tabell). Användarna kommer också att hitta en FAQ här för att svara på några vanliga frågor.
Programvaran enligt beskrivningen är tillämpbar på vilken som helst struktur som kan avbildas med tillräcklig upplösning för att visualisera de funktioner som användaren önskar att modellera. Även SPA kan förbättra upplösningen, det uppenbarligen inte kommer att förbättra synligheten av funktioner som annars inte syns. Detta protokoll är därför inte en metod för att förbättra kvaliteten på data. Som med någon teknik, noggrann provberedning och optimering av bild strategi kommer att ge de renaste data och de bästa resulterande modellerna.
Valet av SR imaging modalitet är också viktigt och i allmänhet kommer att bero på provet till hands. VirusMapper har validerats för att fungera bra med SIM och STED 10, och det kan även användas med högkvalitativa lokalisering mikroskopi data, men försiktighet bör iakttas i detta fall,som gles märkning kan orsaka problem som liknar asymmetri maximering.
För närvarande är VirusMapper den enda fritt tillgängliga algoritm för analys enda partikel av fluorescensbilder och den enda allmänt ändamål 2D SPA medelvärdes programvara. Andra studier som har använt sig av samma principer 4, 6, 8 har använt anpassad mjukvara specialiserad för varje enskild studie. Generella algoritmer för återuppbyggnaden av 3D-data har publicerats 5, 18, även om ingen programvara tillhandahölls.
När den används som beskrivs i denna artikel, kan VirusMapper användas för att producera exakta, noggranna, och robusta modeller av den makromolekylära proteinarkitekturen av virus och andra komplex. Med dessa modeller kan forskarna ta exakta mätningar av den genomsnittliga dimensioner structgärder som studeras, potentiellt ger dem möjlighet att nå biologiska slutsatser som inte annars skulle ha varit möjligt.
Vidare är det med de flerkana funktionerna i denna teknik möjligt att kart ett obegränsat antal proteiner och komponenter inom komplex och att upptäcka ny proteinorganisation. Att undersöka förändringar i nanostrukturen i olika biologiskt relevanta förhållanden, såsom olika skeden av ett virus livscykel, har potential att erbjuda värdefulla insikter i biologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck och Kathrin Scherer för deras bidrag till den ursprungliga utveckling och validering av VirusMapper. Vi vill också tacka Artur Yakimovich för hans kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från bioteknik och Biological Sciences Research Council (BB / M022374 / 1) (RH); basfinansiering till MRC Laboratory för molekylär cellbiologi, University College London (JM); Europeiska forskningsrådet (649.101-UbiProPox) (JM); och Medical Research Council (MR / K015826 / 1) (RH och JM). RG finansieras av Engineering and Physical Sciences Research Council (EP / M506448 / 1).
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |