تستخدم هذه المخطوطة ومقرها فيجي المفتوحة المصدر حزمة البرامج VirusMapper لتطبيق تحليل جسيم واحد إلى صور مجهرية فائقة الدقة من أجل توليد نماذج دقيقة للبنية النانو.
فائقة الدقة مضان المجهر هو ثورة حاليا البحث بيولوجيا الخلية. قدرتها على كسر الحد قرار من حوالي 300 نانومتر يسمح التصوير الروتيني للمجمعات والعمليات البيولوجية النانوية. هذه الزيادة في القرار يعني أيضا أن أساليب شعبية في المجهر الإلكتروني، مثل تحليل جسيم واحد، ويمكن بسهولة أن تطبق على فائقة الدقة مضان المجهر. من خلال الجمع بين هذا النهج التحليلي مع فائقة الدقة التصوير الضوئي، يصبح من الممكن الاستفادة من جزيء محدد قدرة وسم المجهر مضان لتوليد الخرائط الهيكلية للعناصر الجزيئية ضمن هيكل متبدل الاستقرار. ولهذه الغاية، قمنا بتطوير خوارزمية جديدة – VirusMapper – تعبئتها بوصفه المساعد يماغيج سهلة الاستخدام وعالية الأداء، والإنتاجية العالية. تقدم هذه المقالة دليل متعمقة لهذا البرنامج، وعرض قدرتها على الكشف عن السمات الهيكلية الجديدة في م البيولوجيالمجمعات olecular. هنا، نقدم كيفية تجميع البيانات متوافقة ونقدم بروتوكول خطوة بخطوة حول كيفية استخدام هذه الخوارزمية لتطبيق تحليل جسيم واحد إلى صور فائقة الدقة.
تمت زيارتها فائقة الدقة (SR) المجهري لها تأثير كبير على بيولوجيا الخلية من خلال توفير القدرة على صورة العمليات الجزيئية الأساسية جنبا إلى جنب مع وضع العلامات المحددة الجزيئي بالغ الأهمية لفهم لهم. SR يمكن الآن المجهر الضوئي من الاقتراب من قرارات (20-150 نانومتر) سابقا فقط للتحقيق مع المجهر الإلكتروني (EM) مع الحفاظ على الفوائد الرئيسية من المجهر الضوئي، مثل القدرة على صورة الخلايا الحية 1 و 2. وعلاوة على ذلك، وحفظ الهيكلي وجدت على مستوى النانو يسمح تطبيق تحليل جسيم واحد (SPA) لبيانات ريال، مفهوم يستخدم على نطاق واسع في المجهر الإلكتروني 3. باستخدام SPA، نسخا كثيرة للغاية الحفظ هيكل يمكن تصوير وبلغ متوسط معا لتحسين دقة، والدقة، أو الإشارة إلى الضجيج الكائن تصور. عندما تستخدم بالاقتران مع SR، وقد ثبت SPA ليكون أداة قوية لارتفاع فرسم الخرائط recision مكونات المجمع المسام النووي 4، 5، 6 جسيم مركزي، والفيروسات، مثل فيروس نقص المناعة البشرية 7 و HSV-1 8.
ومع ذلك، فقد تحدى التطبيق الروتيني المشترك لSPA ريال وبسبب عدم وجود البرامج المتاحة. لهذا السبب، قمنا بتطوير VirusMapper، وهو البرنامج المساعد لبرنامج معالجة الصور الشهير يماغيج / فيجي 9. وهذه هي أول مجموعة من البرامج المتاحة بحرية لSPA المعمم مع الصور مضان 10 مصممة لتوفير سريع، سهل الاستعمال، المتوسط السذاجة متعدد القنوات هياكل المصورة مع المجهر ريال. وعلى الرغم من تصميمه للبحث عن الفيروسات، ويمكن تطبيقها على أي مجمع الجزيئات التي الأنواع الجزيئية مختلفة يمكن تصويرها، التي تم تحديدها، والمترجمة.
VirusMapper يمكن استخدامها لإنتاج عالية الدقة الجزيئيةنماذج من أي بنية المعروفة، مما يسمح لحساب متوسط الأبعاد وغيرها من المعالم. تصميم خوارزمية يجعلها مفيدة بشكل خاص لفصل السكان من الهياكل، وتوفير لتحديد توجهات واضحة أو الدول الصرفية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، والتصوير متعددة يمكن استخدامها لتوظيف قناة المرجعية في الحالات التي تكون فيها البنية الأساسية غير معروفة، مما يسمح لاكتشاف هيكل قائم على المرجعية. وتقدم الإرشادات للبرمجيات تحميل وتثبيت على https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . كما يمكن العثور على بيانات سبيل المثال هناك، وينصح المستخدمين لممارسة استخدام البرنامج على البيانات سبيل المثال قبل محاولة تطبيقه لبلدهم.
هنا، يتم وصف الخطوات لاستخدام هذا البرنامج المساعد لإنتاج نماذج SPA من البيانات الخام. البرنامج يأخذ الصور الخام التي تحتوي على س أحاديةص الهياكل المسمى متعددة كإدخال. وتعود، وفقا لعدد من المعايير التي يتم تعديلها كما هو تشغيل البرنامج، ونماذج SPA تبين متوسط توزيع مكونات المسمى داخل هياكل تصوير.
والهدف من هذا البروتوكول هو لإنتاج نماذج SPA دقيقة إعطاء متوسط تعريب مكونات داخل هياكل تصوير وفقا لخطوط الأنابيب المبين في الشكل (1). كما هو مبين في الشكل رقم 1، ينقسم سير العمل البرمجيات مفيد في ثلاث مراحل. المرحلة الأولى هي شريحة صور كبيرة، مما أدى إلى أكوام من جسيمات لكل قناة. هذه الجسيمات هي الوحدات التي سيتم المتوسط لخلق نماذج ولإنتاج البذور لتوليد نموذج. المرحلة الثانية هي لتوليد صور البذور، والتي تستخدم لتسجيل مجموعة كاملة من الجزيئات في المرحلة النهائية. ويتم ذلك عن طريق اختيار قناة المرجعية واختيار الجسيمات في هذه القناة التي من شأنها أن تساهم في الصورة يدوياeeds. ويتم اختيار البذور في هذه القناة المرجعية ولكن يمكن أن تتولد لجميع القنوات. وإعادة ترتيب الجزيئات في البداية عن طريق تركيب و2D التمويه في هذه القناة. جميع الجزيئات التي تم اختيارها وتكييفها ثم يتم متوسط لإنتاج البذور. لكل هيكل موحد ينظر في البيانات التي سيتم على غرار، يجب أن يتم تحديد الجزيئات البذور التي تمثل بوضوح ودقة هذا الهيكل. واجهة في هذه المرحلة هي أيضا مفيدة لمسح البيانات عن مثل هذه الهياكل.
المرحلة الأخيرة هي لتوليد نماذج باستخدام مطابقة القالب. ويتحقق ذلك من خلال تسجيل الجزيئات المستخرجة أصلا إلى صور البذور ولدت في القسم السابق من قبل عبر الارتباط. وبلغ متوسط مجموعة فرعية من الجسيمات المسجلة معا، وهذه العملية التكرارية مبادرة جديدة لخفض نموذج يعني خطأ التربيعية، إذا رغبت في ذلك. يتم تحديد هذه المجموعة الفرعية من خلال وضع حد أدنى للتشابه ضد البذور التي يجب الوفاء بها. عند إنشاء نموذجق في وقت واحد في عدة قنوات، والتشابه المشترك، أو متوسط أوجه التشابه لكل قناة، يتم استخدام. النماذج الناتجة والجسيمات المسجلة التي ساهموا فيها ويمكن بعد ذلك إجراء المزيد من التحليل.
مع هذا الأسلوب، وقد تم تجهيز الباحثون إلى الجمع بين قوة SPA والفحص المجهري ريال من أجل توليد عالية الدقة، ونماذج 2D متعددة القنوات للبنية البروتين من الفيروسات وغيرها من المجمعات الجزيئات. ومع ذلك، ينبغي اتخاذ بعض الاعتبارات الهامة في الاعتبار.
وينبغي اختيار البذور لتمثيل هيكل والتي ينظر اليها على الدوام. وبالتالي، يجب فحص البيانات الخام بعناية قبل أن يتم اختيار البذور. وهذا أمر مهم للوقاية من نماذج متحيزة. الخيارات يمكن التصديق عليها من قبل دراسة الحد الأدنى للعتبات التشابه حاجة لتشمل عددا من الجزيئات في النماذج. بوضوح، لاختيار البذور، وأعلى هذه العتبة يجب أن يكون لعدد معين من الجسيمات، وأكثر أن هيكل هو واضح في البيانات.
مفهوم قالب مطابق مفيد بشكل خاص عندما يكون هناك تجانس في البيانات. جميع الهياكل المختلفة التي السادسينبغي تحديد sible ونماذج مختلفة خلق لكل حالة. خلال فصل هياكل غير المتجانسة في قناة واحدة ولكن في نفس الوقت خلق نماذج في القناة الثانية، قد تظهر أنماط من شأنها أن لم يكن واضحا على الفور.
وهناك اعتبار آخر أن تكون على علم عند استخدام هذه الخوارزمية هو أن الإجراء التكرار سوف يضاعف التماثل العشوائية. على سبيل المثال، عندما النمذجة هيكل مع اثنين من ماكسيما متماثل، سيتم محاذاة كافة التباينات الطفيفة بين ماكسيما مع بعضها البعض خلال التكرار، وبالتالي فإن النموذج النهائي يكون غير المتماثلة الحد الأقصى. إذا كان هذا لا يعكس التماثل المعروفة في البنية التي يتم تصميمها، ثم وهذا ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. حاليا، الطريقة الوحيدة لتجنب هذه تعظيم هي للحد من عدد التكرارات إلى 1، على الرغم من التطور المحتمل أن يكون لVirusMapper لدمج محاور التناظر في عملية توليد نموذج. فإن أي إصدارات جديدة من VirusMapper تكون افاعيlable على الموقع الإلكتروني المشار إليها (انظر المواد الجدول). وسيكون للمستخدمين أيضا العثور على التعليمات هنا للإجابة على أية استفسارات المشتركة.
البرنامج كما هو موضح ينطبق على أي هيكل التي يمكن تصويرها لقرار كاف لتصور الميزات التي يرغب المستخدم في تصميم نموذج. وعلى الرغم SPA يمكن أن تحسن القرار، وبشكل واضح لن تحسين الرؤية من الميزات التي عادة ما تكون غير مرئية. هذا البروتوكول لا، لذلك، وسيلة لتحسين نوعية البيانات. كما هو الحال مع أي تقنية، وإعداد العينات بعناية والاستفادة المثلى من استراتيجية التصوير سيوفر أنظف البيانات وأفضل النماذج الناتجة.
اختيار طريقة التصوير ريال مهم أيضا، وبصفة عامة، وسوف تعتمد على العينة في متناول اليد. تم التحقق من صحة VirusMapper للعمل بشكل جيد مع SIM وSTED 10، ويمكن أن تستخدم أيضا مع بيانات توطين المجهر ذات جودة عالية، ولكن يجب توخي الحذر في هذه الحالة،كما وضع العلامات متفرق يمكن أن يسبب مشاكل مماثلة لتلك التي تعظيم التماثل.
حاليا، VirusMapper هو خوارزمية فقط متاحة بحرية للتحليل جسيم واحد من الصور مضان وللأغراض العامة 2D SPA البرمجيات المتوسط الوحيد. الدراسات الأخرى التي استفادت من نفس المبادئ 4، 6، 8 استخدمت برامج مخصصة المتخصصة لكل دراسة معينة. وقد نشرت خوارزميات للأغراض العامة لإعادة إعمار بيانات 3D 5، 18، على الرغم من عدم تقديم البرامج.
عندما تستخدم على النحو الموضح في هذه المقالة، VirusMapper يمكن استخدامها لإنتاج نماذج محددة ودقيقة، وقوية للبنية البروتين الجزيئات من الفيروسات والمجمعات الأخرى. مع هذه النماذج، يمكن للباحثين أخذ القياسات الدقيقة للمتوسط أبعاد البنيةالقوام قيد الدراسة، وربما السماح لهم للوصول استنتاجات البيولوجية التي لن يكون الأمر خلاف ذلك ممكن.
وعلاوة على ذلك، مع قدرات متعددة القنوات من هذه التقنية، فمن الممكن لتعيين عدد غير محدود من البروتينات والمكونات داخل المجمعات واكتشاف بروتين منظمة جديدة. دراسة التغيرات في بنية النانو في مختلف الظروف ذات الصلة بيولوجيا، مثل مراحل مختلفة من دورة حياة الفيروس، لديه القدرة على تقديم رؤى قيمة حول علم الأحياء.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر كورينا بيرلي، جيرزي ساموليج، بيدرو ماتوس بيريرا، كريستوفر بليك، وكاترين شيرر لمساهماتها في تطوير الأصلي والتحقق من VirusMapper. كما نود أن نشكر أرتور ياكيموفيتش لله قراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BB / M022374 / 1) (RH)؛ التمويل الأساسي لمختبر MRC لبيولوجيا الخلية الجزيئية، جامعة لندن (JM)؛ المجلس الأوروبي للبحوث (649101-UbiProPox) (JM)؛ ومجلس البحوث الطبية (MR / K015826 / 1) (RH وJM). ويتم تمويل RG من الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EP / M506448 / 1).
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |