Dette håndskrift bruger Fiji-baserede open source software-pakke VirusMapper at anvende enkelt-partikel analyse til super-opløsning mikroskopi billeder for at generere præcise modeller af nanoskala struktur.
Super-opløsning fluorescensmikroskopi øjeblikket revolutionere cellebiologi forskning. Dens evne til at bryde den grænse opløsning på omkring 300 nm muliggør rutinemæssig billeddannelse af nanoskala biologiske komplekser og processer. Denne stigning i opløsning betyder også, at metoder populære i elektronmikroskopi, såsom enkelt-partikel analyse kan let anvendes til super-beslutning fluorescensmikroskopi. Ved at kombinere denne analytiske fremgangsmåde med super-opløsning optisk billeddannelse, bliver det muligt at drage fordel af molekylet-specifikke kapacitet af fluorescensmikroskopi mærkning for at frembringe strukturelle kort af molekylære elementer inden en metastabil struktur. Til dette formål har vi udviklet en ny algoritme – VirusMapper – pakket som en nem-at-bruge, høj ydeevne, og high-throughput ImageJ plugin. Denne artikel præsenterer en grundig guide til denne software, fremvisning dens evne til at afdække hidtil ukendte strukturelle træk i biologisk molecular komplekser. Her præsenterer vi, hvordan man samler kompatible data og give en trin-for-trin-protokollen om, hvordan man bruger denne algoritme til at anvende enkelt-partikel analyse til super-opløsning.
Super-opløsning (SR) mikroskopi har haft en stor indflydelse på cellebiologi ved at give mulighed for at billedet centrale molekylære processer sammen med den molekylære særlig mærkning afgørende for at forstå dem. SR nu gør det muligt lysmikroskopi at nærme de beslutninger (20-150 nm) tidligere kun opnåelige med elektronmikroskopi (EM) og beholde de store fordele ved lysmikroskopi, såsom potentialet til at afbilde levende celler 1, 2. Endvidere er den strukturelle bevarelse fundet i nanoskala niveau tillader anvendelsen af enkelt-partikel-analyse (SPA) til SR data, et begreb udbredt i elektronmikroskopi 3. Anvendelse SPA, kan mange højt konserverede kopier af en struktur afbildes og midles sammen for at forbedre opløsningen, præcision, eller signal-til-støj af det visualiserede objekt. Ved anvendelse i kombination med SR, er SPA vist sig at være et stærkt værktøj til high-precision kortlægning af komponenter i kerneporen kompleks 4, 5, centrosomer 6, og vira, såsom HIV 7 og HSV-1 8.
Imidlertid har den rutine kombineret anvendelse af SR og SPA blevet udfordret af en mangel på tilgængelig software. Derfor udviklede vi VirusMapper, et plugin til den populære billedbehandling software ImageJ / Fiji 9. Dette er den første frit tilgængelig software pakke til generaliseret SPA med fluorescensafbildninger 10 designet til at give hurtig, brugervenlig, multi-kanal naive gennemsnitsberegning af strukturer afbildet med SR mikroskopi. Selvom designet for virus, kan den anvendes på ethvert makromolekylære kompleks, hvor forskellige molekylspecies kan afbildes, der er konstateret, og lokaliseret.
VirusMapper kan anvendes til fremstilling af høj præcision molekylæremodeller af enhver kendt struktur, der giver mulighed for beregning af den gennemsnitlige dimensioner og andre parametre. Algoritmen design gør den særligt anvendelig til separation af populationer af strukturer, der giver til bestemmelse af definerede orientering eller forskellige morfologiske tilstande. Yderligere kan multikanal billeddannelse anvendes til at anvende en referencekanal i tilfælde, hvor den underliggende struktur er velkendt, hvilket tillader henvisning-baserede struktur opdagelse. Instruktionerne for at downloade og installere softwaren leveres på https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Eksempel data kan også findes der, og brugerne rådes til at øve bruge softwaren på eksemplet data, inden du forsøger at anvende den til deres egen.
Her beskrives de trin for at bruge dette plugin til at producere SPA modeller fra rådata. Softwaren tager RAW-billeder, der indeholder enkelt- or multi-mærkede strukturer som input. Den returnerer, med forbehold af en række parametre, der er indstillet som softwaren kører, SPA-modeller, der viser de gennemsnitlige fordelinger af de mærkede komponenter inden for de afbildede strukturer.
Målet med denne protokol er at producere præcise SPA modeller giver de gennemsnitlige lokaliseringer af komponenter inden afbildede strukturer ifølge rørledningen skitseret i figur 1. Som vist i figur 1, er softwaren workflow fordel opdeles i tre faser. Den første fase er at segmentere store billeder, hvilket resulterer i stakke af partikler til hver kanal. Disse partikler er de enheder, der skal midles til at skabe modeller og til at producere frø til model generation. Det andet trin er at generere seed billeder, som anvendes til at registrere det samlede sæt af partikler i den afsluttende fase. Dette gøres ved at vælge et referencekanalen og manuel udvælgelse partikler i denne kanal, der vil bidrage til seeds. Frø er valgt i denne reference kanal, men kan genereres for alle kanaler. Partikler indledningsvis udrettet ved at tilpasse en 2D Gauss i denne kanal. Alle partikler, der er blevet udvalgt og udrettet derpå midlet for at frembringe et frø. For hver fælles struktur set i de data, der skal modelleres, bør partikler udvælges som frø der klart og tydeligt repræsenterer denne struktur. Grænsefladen på dette stadium er også nyttig til scanning data for sådanne strukturer.
Den sidste fase er at generere modeller ved hjælp af skabelon matchning. Dette opnås gennem registrering af partiklerne oprindeligt ekstraheret til frøet billeder, der dannes i det foregående afsnit ved krydskorrelation. En undergruppe af registrerede partikler midles sammen, og fremgangsmåden er yderligere gentages for at reducere model betyde kvadrerede fejl, hvis det ønskes. Denne undergruppe bestemmes af minimumsspecifikationerne lighed mod frøet, der skal være opfyldt. Når du opretter models samtidigt i flere kanaler, fælles lighed, eller gennemsnittet af lighederne for hver kanal, anvendes. kan derefter analyseres yderligere de resulterende modeller og de registrerede partikler, der bidrog til dem.
Med denne metode er forskere udstyret til at kombinere de kraftfulde SPA og SR mikroskopi for at generere høj præcision, multi-kanal 2D modeller af proteinet arkitektur virus og andre makromolekylære komplekser. Der bør dog tages hensyn til nogle vigtige overvejelser.
Frø bør vælges til at repræsentere en struktur, der ses konsekvent. Således bør de rå data efterses grundigt, inden frøene er valgt. Dette er vigtigt for at forhindre partiske modeller. Valg kan valideres ved gennemgangen af de minimumskrav lighed tærskler, der er nødvendige for at omfatte et vist antal af partikler i modellerne. Klart, for et udvalg af frø, jo højere denne tærskel skal være for et givet antal partikler, jo mere denne struktur fremgår i dataene.
Skabelonen matchende konceptet er især nyttig, når der er heterogenitet i dataene. Alle de forskellige strukturer, der er viligt bør identificeres og forskellige modeller skabt for hver enkelt sag. Ved at adskille heterogene strukturer i en kanal, men samtidig skabe modeller i en anden kanal, kan mønstre vise sig, at ikke ville have været umiddelbart indlysende.
En anden overvejelse at være opmærksom på, når du bruger denne algoritme er, at proceduren for iteration vil maksimere stokastisk asymmetri. For eksempel, når modellering en struktur med to symmetrisk maksima, alle små asymmetrier mellem maksima vil være på linie med hinanden under iteration, og den endelige model vil således være maksimalt asymmetrisk. Hvis dette ikke afspejler en kendt symmetri i strukturen, der modelleres, så dette bør tages i betragtning. I øjeblikket er den eneste måde at undgå dette maksimering er at begrænse antallet af iterationer til 1, skønt en udviklingspotentiale ville være for VirusMapper at inkorporere symmetriakser i modellen generation proces. Eventuelle nye versioner af VirusMapper vil være available på den refererede hjemmeside (se Materialer tabel). Brugerne vil også finde en FAQ her for at besvare eventuelle fælles forespørgsler.
Softwaren som beskrevet kan anvendes på en hvilken som helst struktur, der kan afbildes med tilstrækkelig opløsning til at visualisere de funktioner, som brugeren ønsker at modellere. Selvom SPA kan forbedre opløsningen, det klart vil ikke forbedre synligheden af funktioner, der ellers ikke er synlige. Denne protokol er derfor ikke en metode til at forbedre kvaliteten af data. Som med enhver teknik, omhyggelig forberedelse prøve og optimering af imaging strategi vil give de reneste data og de bedste deraf følgende modeller.
Valget af SR imaging modalitet er også vigtig, og generelt, vil afhænge af prøven ved hånden. VirusMapper er blevet valideret til at fungere godt sammen med SIM og STED 10, og det kan også bruges med høj kvalitet lokalisering mikroskopi data, men der bør udvises forsigtighed i denne sag,som sparsomme mærkning kan forårsage problemer svarende til dem af asymmetri maksimering.
I øjeblikket VirusMapper er den eneste frit tilgængelige algoritme for enkelt-partikel analyse af fluorescens billeder, og det eneste generelle formål 2D SPA gennemsnitsberegning software. Andre undersøgelser, der har gjort brug af de samme principper 4, 6, 8 har brugt brugerdefinerede software specialiseret for hver enkelt undersøgelse. Generelt-purpose algoritmer til genopbygning af 3D-data er blevet publiceret 5, 18, selv om ingen software blev leveret.
Når det anvendes som beskrevet i denne artikel, kan VirusMapper anvendes til fremstilling af præcise, nøjagtige og robuste modeller af makromolekylære protein arkitektur vira og andre komplekser. Med disse modeller, kan forskerne tage præcise målinger af de gennemsnitlige dimensioner af structstaltninger, der undersøges, potentielt giver dem mulighed for at nå frem til de biologiske konklusioner, som ikke ville have ellers været muligt.
Desuden vil der med de flere kanaler kapaciteter af denne teknik er det muligt at kortlægge et ubegrænset antal proteiner og komponenter inden komplekser og at opdage hidtil ukendte protein organisation. Undersøgelse ændringer i nanoskala struktur i de forskellige biologisk relevante forhold, såsom forskellige stadier af en virus livscyklus, har potentiale til at tilbyde værdifuld indsigt i biologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck, og Kathrin Scherer for deres bidrag til den oprindelige udvikling og validering af VirusMapper. Vi vil også gerne takke Artur Yakimovich for hans kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BB / M022374 / 1) (RH); grundfinansiering til MRC Laboratoriet for Molekylær cellebiologi, University College London (JM); Det Europæiske Forskningsråd (649.101-UbiProPox) (JM); og Medical Research Council (MR / K015826 / 1) (RH og JM). RG er finansieret af Teknik og Physical Sciences Research Council (EP / M506448 / 1).
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |