यह पांडुलिपि फिजी आधारित खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज VirusMapper आदेश नैनो पैमाने संरचना का सटीक मॉडल उत्पन्न करने के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी छवियों एकल कण विश्लेषण लागू करने के लिए उपयोग करता है।
सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वर्तमान में कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान क्रांति ला रहा है। इसकी क्षमता एनएम नैनो पैमाने जैविक परिसरों और प्रक्रियाओं की दिनचर्या इमेजिंग के लिए अनुमति देता है लगभग 300 के संकल्प सीमा को तोड़ने के लिए। संकल्प में यह वृद्धि भी मतलब है कि इस तरह के एकल कण विश्लेषण के रूप में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में लोकप्रिय तरीकों, आसानी से सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लागू किया जा सकता है। सुपर संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ इस विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के संयोजन से, यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अणु-विशिष्ट लेबलिंग क्षमता एक metastable ढांचे के भीतर आणविक तत्वों की संरचनात्मक नक्शे उत्पन्न करने के लिए का लाभ लेने के लिए संभव हो जाता है। VirusMapper – – एक आसान से उपयोग, उच्च प्रदर्शन, और उच्च throughput ImageJ प्लगइन के रूप में पैक यह अंत करने के लिए, हम एक उपन्यास एल्गोरिथ्म विकसित किया है। इस आलेख में इस सॉफ्टवेयर के लिए एक में गहराई से गाइड प्रस्तुत करता है, जैविक मीटर में उपन्यास संरचनात्मक विशेषताओं को उजागर करने की क्षमता का प्रदर्शनolecular परिसरों। यहाँ, हम संगत डेटा इकट्ठा और कैसे इस एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के सुपर संकल्प छवियों एकल कण विश्लेषण लागू करने के लिए पर एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए कैसे प्रस्तुत करते हैं।
सुपर संकल्प (एसआर) माइक्रोस्कोपी आणविक विशिष्ट लेबलिंग उन्हें समझने के लिए महत्वपूर्ण के साथ छवि कुंजी आणविक प्रक्रियाओं करने की क्षमता प्रदान करके कोशिका जीव विज्ञान पर एक बड़ा असर पड़ा है। एसआर अब प्रस्तावों (20-150 एनएम) पहले से ही इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के साथ प्राप्त है, जबकि इस तरह के चित्र को जीवित कोशिकाओं 1, 2 की क्षमता के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का प्रमुख लाभ, बनाए रखने के दृष्टिकोण प्रकाश माइक्रोस्कोपी सक्षम बनाता है। इसके अलावा, संरचनात्मक संरक्षण नैनो पैमाने स्तर पर पाया एकल कण विश्लेषण (SPA) एसआर आंकड़ों के, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल एक अवधारणा के आवेदन की अनुमति देता है। एसपीए का उपयोग करना, एक संरचना के कई उच्च संरक्षित प्रतियां ली गई और यह एक साथ औसतन से शोर संकेत संकल्प, शुद्धता, या कल्पना वस्तु का सुधार करने के लिए किया जा सकता है। जब एसआर साथ संयोजन में उपयोग, स्पा उच्च पी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए प्रदर्शन किया गया हैइस तरह के एचआईवी 7 और एचएसवी -1 8 के रूप में परमाणु ध्यान में लीन होना जटिल 4, 5 के घटकों, तारक काय 6, और वायरस, के recision मानचित्रण।
हालांकि, एसआर और स्पा की दिनचर्या संयुक्त आवेदन उपलब्ध सॉफ्टवेयर की कमी से चुनौती दी गई है। इस कारण से, हम VirusMapper, लोकप्रिय छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर ImageJ / फिजी 9 करने के लिए एक प्लगइन का विकास किया। यह प्रतिदीप्ति छवियों 10 तेज, उपयोगकर्ता के अनुकूल, मल्टी चैनल भोली एसआर माइक्रोस्कोपी के साथ imaged संरचनाओं की औसत प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया के साथ सामान्यीकृत एसपीए के लिए पहले स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज है। हालांकि वायरस के लिए तैयार किया गया है, यह किसी भी macromolecular जटिल है, जिसमें विभिन्न आणविक प्रजातियों, imaged किया जा सकता है की पहचान की है, और स्थानीय के लिए लागू किया जा सकता है।
VirusMapper उच्च परिशुद्धता आणविक निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताकिसी भी ज्ञात संरचना के मॉडल, औसत आयाम और अन्य पैरामीटर की गणना के लिए अनुमति देता है। एल्गोरिथ्म डिजाइन यह विशेष रूप से संरचनाओं की आबादी को अलग करने, अलग झुकाव या अलग रूपात्मक राज्यों के निर्धारण के लिए उपलब्ध कराने के लिए लाभदायक होती है। साथ ही, मल्टीचैनल इमेजिंग मामलों में एक संदर्भ चैनल रोजगार जहां अंतर्निहित संरचना में जाना जाता है, जिससे संदर्भ-आधारित संरचना की खोज की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। डाउनलोड करने और सॉफ्टवेयर इंस्टॉल करने के निर्देश पर प्रदान की जाती हैं https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper । उदाहरण डेटा भी पाया जा सकता है, और उपयोगकर्ताओं को अपने स्वयं पर लागू करने का प्रयास करने से पहले उदाहरण डेटा पर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अभ्यास करने के लिए सलाह दी जाती है।
इधर, इस प्लगइन का उपयोग कर एसपीए मॉडल कच्चे डेटा से निर्माण करने के लिए के लिए चरणों का वर्णन किया गया है। सॉफ्टवेयर एकल ओ युक्त कच्चे चित्र लेताr इनपुट के रूप में बहु लेबल संरचनाओं। यह देता है, अनेक मानदंड के रूप में सॉफ्टवेयर चलाया जाता है समायोजित कर रहे हैं कि करने के लिए विषय, imaged संरचनाओं का नाम दिया घटकों की औसत वितरण दिखा एसपीए मॉडल।
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य पाइपलाइन चित्रा 1 में उल्लिखित के अनुसार imaged संरचनाओं के भीतर घटकों की औसत स्थानीयकरणों दे सटीक एसपीए मॉडलों का उत्पादन करने के लिए है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया, सॉफ्टवेयर कार्यप्रवाह उपयोगी तीन चरणों में बांटा गया है। पहले चरण प्रत्येक चैनल के लिए कणों के ढेर में जिसके परिणामस्वरूप, खंड बड़ी छवियों के लिए है। इन कणों इकाइयों कि मॉडल बनाने के लिए और मॉडल पीढ़ी के लिए बीज का उत्पादन करने के लिए औसत कर लिया जाएगा। दूसरे चरण बीज छवियों, जो अंतिम चरण में कणों के पूरे सेट रजिस्टर करने के लिए उपयोग किया जाता है उत्पन्न करने के लिए है। यह एक संदर्भ चैनल चुनने और मैन्युअल रूप से इस चैनल कि रों के लिए योगदान देगा में कणों का चयन करके किया जाता हैeeds। बीज इस संदर्भ चैनल में चुना जाता है लेकिन सभी चैनलों के लिए उत्पन्न किया जा सकता। कण शुरू में इस चैनल में एक 2D गाऊसी फिटिंग द्वारा पुनः संगठित कर रहे हैं। सभी कणों कि चयनित किया गया है और पुनः संगठित तो कर रहे हैं एक बीज का उत्पादन करने के लिए औसत। प्रत्येक सामान्य संरचना डेटा है कि मॉडल किए जाने में देखा के लिए, कणों बीज जो स्पष्ट और सटीक है कि संरचना का प्रतिनिधित्व के रूप में चुना जाना चाहिए। इस स्तर पर भी इस तरह के इंटरफेस संरचनाओं के लिए डेटा को स्कैन करने के लिए उपयोगी है।
अंतिम चरण टेम्पलेट मिलान का उपयोग कर मॉडल उत्पन्न करने के लिए है। यह कणों मूल रूप से पार से संबंध द्वारा पिछले अनुभाग में उत्पन्न बीज छवियों निकाले के पंजीकरण के माध्यम से हासिल की है। पंजीकृत कणों के एक उप समूह एक साथ औसत निकाला जाता है, और इस प्रक्रिया को और अधिक मॉडल कम करने के लिए वर्ग त्रुटि मतलब है, अगर वांछित दोहराया है। इस उपसमुच्चय बीज कि संतुष्ट होना चाहिए के खिलाफ कम से कम समानता की स्थापना द्वारा निर्धारित किया जाता है। जब मॉडल बनानेकई चैनलों में एक साथ है, संयुक्त समानता, या प्रत्येक चैनल के लिए समानता की औसत, प्रयोग किया जाता है। परिणामी मॉडल और पंजीकृत कणों है कि उन्हें करने के लिए योगदान तो आगे का विश्लेषण किया जा सकता है।
इस पद्धति से, शोधकर्ताओं ने आदेश उच्च परिशुद्धता, वायरस और अन्य macromolecular परिसर के प्रोटीन वास्तुकला का मल्टी चैनल 2 डी मॉडल उत्पन्न करने के लिए स्पा और एसआर माइक्रोस्कोपी की शक्ति गठबंधन करने के लिए सुसज्जित हैं। हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
बीज एक संरचना है कि लगातार देखा जा रहा है प्रतिनिधित्व करने के लिए चुना जाना चाहिए। इस प्रकार, कच्चे डेटा का निरीक्षण किया जाना चाहिए ध्यान से पहले बीज चुना जाता है। यह पक्षपातपूर्ण मॉडल को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। विकल्प मॉडल में कणों की एक निश्चित संख्या में शामिल करने के लिए आवश्यक न्यूनतम समानता थ्रेसहोल्ड की परीक्षा द्वारा मान्य किया जा सकता है। जाहिर है, बीज के एक विकल्प के लिए, उच्च इस सीमा से कणों की दी गई संख्या के लिए होने की जरूरत है, और अधिक है कि संरचना डेटा में स्पष्ट है।
जब डेटा में विविधता है टेम्पलेट मिलान अवधारणा विशेष रूप से उपयोगी है। सभी विभिन्न संरचनाओं कि vi हैंअसंभव पहचान की जानी चाहिए और विभिन्न मॉडलों प्रत्येक मामले के लिए बनाया। एक चैनल में विषम संरचनाओं को अलग लेकिन एक साथ एक दूसरे चैनल में मॉडल बनाकर, पैटर्न सामने आ सकते हैं कि तुरंत स्पष्ट नहीं किया गया है।
एक अन्य विचार जब इस कलन विधि का उपयोग कि यात्रा प्रक्रिया स्टोकेस्टिक विषमता को अधिकतम जाएगा के बारे में पता किया जाना है। उदाहरण के लिए, जब दो सममित मॅक्सिमा के साथ एक संरचना मॉडलिंग, मॅक्सिमा के बीच सभी मामूली विषमताओं एक दूसरे के साथ यात्रा के दौरान गठबंधन किया जाएगा, और अंतिम मॉडल इस प्रकार अधिकतम विषम हो जाएगा। इस संरचना में एक ज्ञात समरूपता प्रतिबिंबित नहीं करता है मॉडल की जा रही है, तो यह ध्यान में रखा जाना चाहिए। वर्तमान में, एक ही रास्ता इस अधिकतमकरण से बचने के लिए हालांकि एक संभावित विकास VirusMapper मॉडल पीढ़ी प्रक्रिया में समरूपता के अक्ष को शामिल करने के लिए हो सकता है, 1 करने के लिए पुनरावृत्तियों की संख्या को सीमित करने के लिए है। VirusMapper के किसी भी नए संस्करण avai हो जाएगासंदर्भित वेबसाइट पर करने के लिए सक्षम है (देखें सामग्री तालिका)। उपयोगकर्ताओं को भी किसी भी आम प्रश्नों का जवाब करने के लिए यहाँ एक पूछे जाने वाले प्रश्न मिल जाएगा।
सॉफ्टवेयर के रूप में वर्णित किसी भी संरचना है कि सुविधाओं है कि उपयोगकर्ता मॉडल करने के लिए चाहता है कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ imaged किया जा सकता है के लिए लागू है। एसपीए संकल्प में सुधार कर सकते हैं, यह स्पष्ट रूप से सुविधाओं है कि अन्यथा दिखाई नहीं देते हैं की दृश्यता में सुधार नहीं होगा। यह प्रोटोकॉल, इसलिए, एक विधि डेटा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए नहीं है। किसी भी तकनीक, सावधान नमूना तैयार करने और अनुकूलन इमेजिंग रणनीति का साफ डेटा और सबसे अच्छा परिणामी मॉडल प्रदान करेगा के साथ होता है।
एसआर इमेजिंग साधन के चुनाव भी महत्वपूर्ण है और सामान्य रूप में, हाथ में नमूना पर निर्भर करेगा। VirusMapper सिम और STED 10 के साथ अच्छी तरह से काम करने के लिए मान्य किया गया है, और यह भी उच्च गुणवत्ता वाले स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी डेटा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ध्यान इस मामले में लिया जाना चाहिए,के रूप में विरल लेबलिंग विषमता अधिकतमकरण के समान ही समस्याओं का कारण बन सकता है।
वर्तमान में, VirusMapper प्रतिदीप्ति छवियों के एकल कण विश्लेषण और केवल सामान्य प्रयोजन 2 डी एसपीए औसत सॉफ्टवेयर के लिए केवल स्वतंत्र रूप से उपलब्ध एल्गोरिथ्म है। अन्य अध्ययनों से पता है कि एक ही सिद्धांतों 4, 6 का इस्तेमाल किया है, 8 कस्टम प्रत्येक विशेष अध्ययन के लिए विशेष सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया है। 3 डी डेटा के पुनर्निर्माण के लिए सामान्य प्रयोजन एल्गोरिदम, प्रकाशित किया गया है 5, 18, हालांकि कोई सॉफ्टवेयर प्रदान किया गया।
जब के रूप में इस आलेख में वर्णित करते थे, VirusMapper वायरस और अन्य परिसरों में से macromolecular प्रोटीन वास्तुकला का, सटीक, सही और मजबूत मॉडलों का उत्पादन किया जा सकता है। इन मॉडलों के साथ, शोधकर्ताओं struct की औसत आयाम की सटीक माप ले जा सकते हैंअध्ययन के तहत ures, संभवतः उन्हें जैविक निष्कर्ष है कि नहीं होगा अन्यथा संभव तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है।
इसके अलावा, इस तकनीक का मल्टी चैनल क्षमताओं के साथ, यह संभव परिसरों के भीतर प्रोटीन और घटकों के एक असीमित संख्या में मैप करने के लिए और उपन्यास प्रोटीन संगठन को खोजने के लिए है। इस तरह के एक वायरस जीवन चक्र के विभिन्न चरणों के रूप में विभिन्न जैविक रूप से प्रासंगिक की स्थिति, में नैनो पैमाने संरचना में परिवर्तन की जांच करना, संभावित जीव विज्ञान में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम मूल विकास और VirusMapper के सत्यापन के लिए उनके योगदान के लिए कोरिना बीर्ली, जर्ज़ी सामोलेज, पेड्रो माटोस परेरा, क्रिस्टोफर ब्लैक, और कैथरीन शेरेर धन्यवाद देना चाहते हैं। हम यह भी पांडुलिपि के बारे में उनकी महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए आर्टर यकिमोविच धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम के जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (बी बी / M022374 / 1) (आरएच); आण्विक सेल बायोलॉजी के लिए एमआरसी लेबोरेटरी के कोर धन, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन (जेएम); यूरोपीय अनुसंधान परिषद (649,101-UbiProPox) (जेएम); और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआर / K015826 / 1) (आरएच और जेएम)। आरजी इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (ईपी / M506448 / 1) द्वारा वित्त पोषित है।
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |