Bu yazının nano ölçekli yapının kesin modellerini üretmek için süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için Fiji tabanlı açık kaynak yazılım paketi VirusMapper kullanır.
Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi şu anda hücre biyolojisi araştırma devrim yaratıyor. Onun kapasitesi nano ölçekli biyolojik kompleksleri ve süreçlerin rutin görüntüleme için izin verir nm yaklaşık 300 çözünürlüğü sınırı kırmak için. Çözünürlükteki bu artış, aynı zamanda, tek parçacık analizi gibi elektron mikroskopisinde popüler yöntem, hali hazırda süper çözünürlüklü floresan mikroskobu uygulanabilir olduğu anlamına gelir. süper çözünürlük optik görüntüleme ile analitik bir yaklaşım birleştirerek, yarı kararlı bir yapı içinde moleküler elemanlar yapısal haritaları oluşturmak için floresan mikroskopi molekülü özel etiketleme kapasitesi yararlanmak mümkün olur. VirusMapper – – bir, yüksek performanslı kullanımı kolay ve yüksek verimli ImageJ eklentisi olarak paketlenmiş Bu amaçla, yeni bir algoritma geliştirdik. Bu makale, biyolojik m yeni yapısal özelliklere ortaya çıkarmak için yeteneğini vitrine, bu yazılım için derinlemesine bir kılavuz sunuyorolecular kompleksleri. Burada, uyumlu veri araya ve süper çözünürlüklü görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için bu algoritmayı nasıl kullanılacağına ilişkin bir adım-adım protokolünü nasıl sağlanacağı sunuyoruz.
Süper çözünürlüklü (SR) mikroskopi onları anlama açısından son derece önemli moleküler özgü etiketleme ile birlikte görüntü anahtar moleküler süreçler yeteneği sağlayarak hücre biyolojisi üzerinde büyük bir etkisi oldu. SR şu anda bu tür görüntü canlı hücreleri 1, 2 potansiyeli gibi ışık mikroskobu önemli faydalar elde edilmesi esnasında, elektron mikroskopisi (EM) ile, daha önce sadece elde çözünürlükleri (20-150 nm) yaklaşmak için ışık mikroskobu sağlar. Bundan başka, nano ölçekli düzeyinde bulunan yapısal koruma SR verilere tek parçacık analizi (SPA), elektron mikroskobu 3 yaygın olarak kullanılan bir kavramın uygulamaya izin verir. SPA kullanarak, bir yapının çok yüksek ölçüde korunmuş kopya görüntülenmiş ve çözünürlük, hassas ya da sinyal-gürültü görüntülenmiştir nesnenin artırmak için birlikte ortalaması alınabilir. SR ile kombinasyon halinde kullanıldığında, SPA yüksek p için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştirHIV 7 ve HSV-1 ile 8 olarak çekirdek gözenek kompleks 4, 5 bileşenleri, sentrozom 6 ve virüslerin recision eşleme.
Bununla birlikte, SR, SPA rutin birlikte uygulama yazılım mevcut eksikliğinden öne sürülmüştür. Bu nedenle, biz VirusMapper, popüler görüntü işleme yazılımı ImageJ / Fiji 9'a bir eklenti geliştirdi. Bu SR mikroskobu ile görüntülenmiş yapıların hızlı, kullanıcı dostu, çok kanallı naif ortalamayı sağlamak üzere tasarlanmış floresan görüntüleri 10 ile genelleştirilmiş SPA için ilk serbestçe kullanılabilir yazılım paketidir. virüsler için tasarlanmış olsa da, farklı moleküler türler, görüntülenen tanımlanmıştır ve lokalize edilebilir her hangi bir makromoleküler kompleks uygulanabilir.
VirusMapper yüksek hassasiyetli molekül üretmek için kullanılabilmektedirortalama boyutları ve diğer parametrelerin hesaplanması için izin veren herhangi bir bilinen yapı model bulunur. algoritma tasarımı farklı yönlerde veya farklı morfolojik durumlarının saptanması için temin yapıların popülasyonları ayrılması için elverişli hale getirmektedir. Buna ek olarak, çok kanallı görüntüleme temel yapısı iyi bilinmektedir burada bu şekilde referans tabanlı yapı bulma için izin durumlarda bir referans kanalı kullanmak için kullanılabilir. Yazılım indirme ve yükleme talimatları üzerine sağlanmaktadır https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Örnek verileri de orada bulunabilir ve kullanıcıların kendi uygulamak denemeden önce örnek veriler üzerinde yazılım kullanarak uygulama tavsiye edilir.
Burada, ham verilerden SPA modeller üretmek için bu eklentisi kullanarak adımları tarif edilmiştir. Yazılım tek o içeren ham görüntüleri alırgiriş olarak çok etiketli yapılar r. Bu yazılım çalıştırıldığında olarak ayarlanır parametrelerin bir dizi konu, döner, görüntülü yapıları içinde etiketlenmiş bileşenlerin ortalama dağılımlarını gösteren SPA modelleri.
Bu protokolün amacı, Şekil 1 'de ana hatlarıyla boru hattına göre görüntülenen yapıları içinde bileşenlerinin ortalama lokalizasyonu veren hassas SPA modelleri üretmektir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, program akışı yararlı üç aşamaya ayrılır. İlk aşamada, her bir kanal için parçacık yığınları ile sonuçlanan, kademeli bir çok görüntü etmektir. Bu parçacıklar modelleri oluşturmak için ve model üretimi için tohum üretmek için ortalaması alınır birimleridir. İkinci aşamada son aşamada partiküllerinin tüm dizi kaydetmek için kullanılan tohum görüntü oluşturmak için. Bu s katkıda bu kanalda parçacıkların, el ile, bir referans kanalı seçme ve yapılıreeds. Tohumlar, bu referans kanalı olarak seçilir, ancak tüm kanallar için oluşturulabilir. Parçacıklar başlangıçta bu kanalda bir 2D Gauss uydurma ile yeniden düzenlenebilir edilir. Seçilen ve yeniden düzenlendi olan tüm parçacıkları daha sonra bir tohum üretilmesi için ortalaması alınmıştır. modellenecek olan veriler görülen her bir ortak bir yapı için, parçacıklar açık ve doğru bir şekilde yapıyı temsil tohum olarak seçilmelidir. Bu aşamada arayüz ayrıca, yapıları için verileri taramak için faydalıdır.
Son aşama şablon eşleştirme kullanarak modellerini üretmektir. Bu, başlangıçta, çapraz korelasyon önceki bölümde oluşturulan tohum resimlere ekstre parçacıklarının kayıt ile elde edilir. Kayıtlı parçacıklarının alt birlikte ortalaması alınır ve proses ayrıca arzu edildiği takdirde, hata kare ortalaması modeli azaltmak için tekrarlanır. Bu alt küme yerine getirilmesi gereken tohum karşı minimum benzerlik kurarak belirlenir. model oluştururkenbirden fazla kanal eş zamanlı olarak s, eklem benzerlik, ya da her bir kanal için benzerlikler ortalama kullanılır. bunlara katkıda elde edilen model ve kayıt parçacıklar daha sonra analiz edilebilir.
Bu yöntemle, araştırmacılar virüs ve diğer makromoleküler kompleksleri protein mimarisinin yüksek hassasiyet, çok kanallı 2D modellerini oluşturmak için SPA ve SR mikroskobu gücünü birleştirmek için donatılmıştır. Ancak, bazı önemli hususlar dikkate alınmalıdır.
Tohumlar sürekli görülen bir yapıyı temsil etmek seçilmelidir. Bu nedenle, ham veriler tohum seçilir önce dikkatlice kontrol edilmelidir. Bu önyargılı modellerini önlenmesi açısından önemlidir. Seçimleri modellerinde parçacıkların belirli bir sayıda içerir için gereken minimum benzerlik eşikleri incelenmesiyle doğrulanabilir. Açıktır ki, tohum seçimi için, daha yüksek Bu eşik parçacıklarının belirli bir sayıda olması gerekmektedir, daha bu yapı verileri belirgindir.
veri heterojenlik olduğunda şablon uygun konsept, özellikle yararlıdır. vi olan bütün farklı yapılarsible tespit edilmeli ve farklı modeller her durum için yarattı. bir kanalda heterojen yapıların ayrılması, ancak eş zamanlı olarak ikinci bir kanala modelleri oluşturarak, desen hususu derhal olmazdı ortaya çıkabilir.
Diğer bir faktör bu algoritma kullanılarak iterasyon prosedürü stokastik asimetri maksimize edeceği zaman farkında olmak. iki simetrik bir maksimaya sahip bir yapı modellerken Örneğin, maksimum arasındaki tüm hafif asimetriler yineleme sırasında birbirleri ile aynı hizada olacak ve nihai modeli, maksimum asimetrik olacaktır. Bu modellenen yapının bilinen bir simetri yansıtmaz, o zaman bu hesaba alınmalıdır. VirusMapper model üretme sürecine simetri eksenleri dahil etmek için potansiyel bir gelişme olacağını rağmen şu anda bu maksimizasyonu önlemenin tek yolu, 1 yineleme sayısını sınırlamaktır. VirusMapper Herhangi yeni versiyonları avai olacakBaşvurulan web sitesinde tıklamanız yeterli olacaktır (Malzeme Tablo). Kullanıcılar ayrıca herhangi bir ortak sorularına yanıt burada SSS bulacaksınız.
açıklandığı gibi yazılım kullanıcı modellemek istediği özelliklere görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahip görüntülü olabilir herhangi yapıya uygulanabilir. SPA çözünürlüğünü artırabilir rağmen, açıkça aksi görünmez özelliklerin görünürlüğünü artırmak olmayacaktır. Bu protokol, bu nedenle, yöntem, verilerin kalitesini artırmak için değildir. En temiz veri ve iyi çıkan modellerini sağlayacak görüntüleme stratejisinin herhangi bir teknik, dikkatli numune hazırlama ve optimizasyon olduğu gibi.
SR görüntüleme yönteminin seçimi genel olarak el altında numunenin bağlı olacaktır, ayrıca önemlidir ve. , VirusMapper SIM ve STED'in 10 iyi çalışacak şekilde valide edilmiş ve aynı zamanda yüksek kaliteli yerelleştirme mikroskopi verileri ile kullanılabilir, ancak bakım bu durumda alınmalıdırolarak seyrek etiketleme asimetri maksimizasyonu benzer sorunlara yol açabilir.
Şu anda, VirusMapper floresans görüntüleri tek parçacık analiz ve sadece genel amaçlı 2D SPA ortalama yazılımın tek serbestçe algoritmadır. Aynı ilkeler 4, 6 kullanımı yaptık Diğer çalışmalar, 8 her bir çalışma için uzman özel yazılım kullandık. Hiçbir yazılım sağlandı, ancak 3D veri yeniden inşası için Genel amaçlı algoritmalar, 5, 18 yayınlandı.
Bu makalede tarif edildiği gibi kullanıldığında, VirusMapper virüs ve diğer kompleksler makromoleküler proteini mimarisi, hassas, doğru ve sağlam bir modeli üretmek için kullanılabilir. Bu model ile, araştırmacılar yapının ortalama boyutları hassas ölçümler alabilirÇalışmanın altında ures, potansiyel olarak onları başka türlü mümkün olmazdı biyolojik sonuçlara ulaşmanıza olanak verir.
Ayrıca, bu tekniğin çok kanallı yetenekleri ile, komplekslerin proteinler ve bileşenlerin sınırsız sayıda eşlemek için ve yeni protein organizasyonu bilgiye mümkündür. Böyle bir virüs yaşam döngüsünün farklı aşamalarında farklı biyolojik ilgili koşullar, içinde nano ölçekli yapısında değişiklikler inceleyen biyoloji değerli bilgiler sunma potansiyeline sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Biz VirusMapper özgün gelişim ve doğrulama katkılarından dolayı Corina Beerli Jerzy Samolej Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck ve Kathrin Scherer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca yazının eleştirel okuma için Artur Yakimovich teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi hibe ile finanse edildi (BB / M022374 / 1) (RH); Moleküler Hücre Biyolojisi MRC Laboratuvarına çekirdek fonlama, University College London (JM); Avrupa Araştırma Konseyi (649.101-UbiProPox) (JM); ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MR / K015826 / 1) (RH ve JM). RG Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (AP / M506448 / 1) tarafından finanse edilmektedir.
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |