Overview
遺伝子発現を評価するさまざまな方法の間では、RNA、または RNA シーケンスの高スループット シーケンスが実行および事前入手可能なゲノム情報に頼ることがなく分析できるようが特に魅力的です。RNA シーケンス、関心のサンプルから分離された RNA を増幅するため、塩基配列を DNA ライブラリを生成する使用されます。最終的には、RNA シーケンスは、どの遺伝子が表現されるのかわかりますその表現と任意の未知の転写産物の存在のレベル。
ここでは、ゼウスが RNA シーケンスの背後にある基本的な原則を提示します。については、一般的な RNA シーケンス プロトコルの実験と解析の手順を説明します。最後に、どのように研究者現在または使用している RNA シーケンス、たとえば、異なる試料間の遺伝子発現を比較する蛋白質と核酸の相互作用を特徴付けることを検討します。
Procedure
RNA シーケンスまたは RNA シーケンスは、細胞集団に表現、として知られている、トランスクリプトーム、シーケンスとすべての RNA の量に関する情報を提供することができます技術です。他の発現のマイクロ アレイは、知られている rna のプローブなどのメソッドとは異なり RNA seq 非シーケンスのゲノムを持つ生物から遺伝子発現のプロファイリングできます。さらに、RNA シーケンスは、特に非常に低いまたは非常に高いレベルでのマイクロ アレイよりも転写発現レベルの大きい範囲を正確に測定できます。
このビデオは、RNA シーケンス ライブラリを準備し、分析データ、およびこの手法のいくつかのアプリケーションのためのプロトコル、RNA シーケンスの原理を説明します。
まず、シーケンス処理ではそのレベルが測定する転写産物の人口を隔離する RNA シーケンス トランスクリプトームの背後にあるいくつかの原則を確認してみましょう。細胞 RNA のほとんどは、リボソーム RNA や rRNA、細胞のタンパク質生産機構の中心的なコンポーネントです。RRNA 転写産物の他の種類の回復を容易にするには、シーケンスする前に通常削除で相補的なオリゴヌクレオチドに磁気ビーズにサンプルを交配させることは、磁石を使用してサンプルの残りの部分から、rRNA を分離します。
また、配列の RNA の特定の人口を選択できます。たとえば、メッセンジャー Rna が蛋白質のコーディング、または Mrna、「オリゴ dT」でキャプチャできます — ポリ A テールこれらの転写産物の終わりとして知られている拠点のシーケンスにバインド デオキシ T ヌクレオチド伸張を短い。汚染の rRNA が削除されます。22 ヌクレオチド規制 Rna であるマイクロ Rna はサイズに基づいてシーケンスを選択的に分離することができます。RNA は本質的に劣化しやすく、最初逆二本鎖に転写される DNA です。
アダプターと呼ばれるオリゴヌクレオチド シーケンスは次に DNA のフラグメントに縛られます。アダプターがその後 pcr のプライマー結合部位として一定の領域を含める、これら通常非対称なのでテンプレートの「strandedness」が保存されます。アダプターには、1 つのサンプルから発信されたすべてのフラグメントを識別する「バーコード」として知られている一意のシーケンスも含まれます。ライブラリは、PCR によってそれから増幅されます。
アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドがありますシーケンス チップを使用して、ライブラリのサンプルは、DNA の分子は、低密度のチップにアニールするように希釈を固定します。「橋増幅」フォーム「クローン クラスター」と呼ばれるプロセスを介してチップに DNA を増幅します。短い断片、長さ、各 30 150 拠点は、読み取りをシーケンスとして知られている製品の数百万の何百も生成これらの DNA のテンプレートの 1 つまたは両方の端から合成されます。
品質のシーケンスの結果を分析しているし、データが処理されます。配列の解析は、さまざまなサンプルと未知の成績証明書または成績証明書のフォーム間の Rna の発現レベルの違いなどの情報を表示できます。
RNA シーケンスの作品見てきた今では、RNA シーケンス ライブラリを準備して、シーケンス データを分析するためのプロトコルを行ってみましょう。RNA は最初、興味のサンプルから得られるし、その品質は、バイオアナライザーと呼ばれるマイクロ流体デバイスを用いた電気泳動法、たとえばチェックされます。RNA は、シーケンスの正確な結果を得るのための高品質でなければなりません。DNA 汚染がないことを確保するため、発現遺伝子の RT-PCR は逆転写酵素の有無を行われています。逆転写酵素の留守中に製品をする必要がありますはありません。
ポリ A RNA を選択するには、サンプルは、磁性ビーズに接続されているオリゴ dT プローブにバインドされます。選択した RNA はその後の反応や分析の長さ依存性バイアスを減らすマグネシウム イオンの存在下で高温 200 塩基配列部分に断片化されます。フラグメントは、二本鎖 DNA に変換され、アダプターが組み合わされています。ライブラリは PCR によって増幅し、バイオアナライザーと qPCR を実行することによって、その品質をチェックします。バイオアナライザー結果平均フラグメント サイズとアダプターの長さに基づいて予想サイズで製品のピークが表示されます。
異なるバーコード アダプターを含む、さまざまなサンプルからライブラリに参照 DNA クローンのクラスター生成とシーケンス反応など、プロセスの後続の手順の品質管理として低濃度で追加のサンプルと一緒に、一緒に混在できます。混合物はシーケンス チップに追加され、マシンに読み込まれます。
DNA クラスターの密度の監視シーケンス反応: する必要があることはない高すぎるつながりますに交差汚染、または低すぎると、不十分なデータにつながることができます。シーケンス処理の品質は、識別される不正確なベースの可能性を示します Q のスコアによって与えられます。ほとんど脚の Q スコアは、誤った読み 1000 で 1 未満の確率に相当する 30 を超える必要があります。予想レートで参照 DNA シーケンスの回復は、すべてのライブラリ シーケンスが均等に表されることを示します。
シーケンスによって生成された読み取り、お互いシーケンスされた RNA を推測するとオーバー ラップします。ゲノム情報を持つ生物のゲノムを参照読み取りを配置できます。トラン スクリプトごとの読み取り数は、各 rna 量測定カウントされます。
RNA シーケンスの動作を見て、それが使用されているいくつかの方法を見てみましょう。
トランスクリプトーム シーケンスは、異なる条件下で発現する遺伝子を識別できます。たとえば、この実験では、蚊幼虫の生育条件下で生成されるトランスクリプトームを比較しました。病気を運ぶ蚊のこの特定の種に配列されたゲノム持っていないにもかかわらず、研究者他のシーケンスされた種に得られたトランスクリプトーム情報を比較し、増加又は減少の発現レベルの遺伝子を識別することができた。
RNA シーケンスは、「並列レポーターの試金」にも使用できます遺伝子調節機構を研究します。これは、各一意のタグに結合されて記者シーケンスの転写を「運転」遺伝子規制サイトの変異変種を含むプラスミドの何千ものライブラリを哺乳類細胞の株します。RNA の隔離と高スループット シーケンス、各タグのレベルは、各規制サイト バリエーションで変異ヌクレオチドの機能的重要性に洞察力を与えるが、それぞれからレポーターの式を評価する評価されます。
最後に、RNA シーケンスは興味の蛋白質のバインド先の成績証明書を識別するために特に RNA 蛋白質の相互作用の研究に応用できます。タンパク質は抗体で免疫沈降した、バインドされた Rna は、シーケンスによって定義されます。RNA 蛋白質の複合体は最初に架橋である場合、シーケンス解析はクロスリンクのサイトをマップし、RNA ヌクレオチド レベルの蛋白質の結合サイトを識別できます。
RNA シーケンスにゼウスのビデオを見ただけこのビデオでは、我々 は RNA サンプルをライブラリ、シーケンス処理、分析、結果のデータとシーケンス解析を提供できる情報の種類に変換する方法を見てきました。その感度のおかげですべての生物とのシーケンス、低コストで使用される潜在的な RNA シーケンス遺伝学研究の複数の領域でますます使用されているし、細胞機能と開発を囲む多くの質問に洞察力を提供します。見てくれてありがとう!
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