Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Гистологический анализ острой алкогольной травмы печени у данио

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

Этот протокол описывает гистологические анализы печени у личинок рыбок данио, которые обрабатывались 2% -ным этанолом в течение 24 часов. Такая обработка острым этанолом приводит к стеатозу печени и набуханию печеночной сосудистой сети.

Abstract

Алкогольная болезнь печени (ALD) относится к повреждению печени из-за острого или хронического злоупотребления алкоголем. Это одна из ведущих причин заболеваемости и смертности от алкоголя и затрагивает более 2 миллионов человек в Соединенных Штатах. Лучшее понимание клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе алкогольной травмы печени, имеет решающее значение для разработки эффективного лечения ALD. Личинки данио вызывают печеночный стеатоз и фиброгенез через 24 ч воздействия 2% -ного этанола, что делает их полезными для изучения острого алкогольного поражения печени. В данной работе описывается процедура лечения острым этанолом у личинок рыбок данио и показано, что он вызывает стеатоз и опухание печеночных кровеносных сосудов. Также описан детальный протокол окрашивания гематоксилин-эозином (H & E), который оптимизирован для гистологического анализа личиночной печени рыбок данио. Окрашивание H & E имеет ряд уникальных преимуществ по сравнению с иммунофлуоресценцией, так как оно означает все живоеЭритроциты и внеклеточные компоненты одновременно и могут легко обнаруживать повреждение печени, такое как стеатоз и фиброз. Учитывая увеличение использования данио в моделировании токсина и вызванного вирусом повреждения печени, а также наследственных заболеваний печени, этот протокол служит справочным материалом для гистологического анализа, проведенного во всех этих исследованиях.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Алкогольная болезнь печени (ALD), вызванная чрезмерным потреблением алкоголя, является основной причиной заболеваемости и смертности от алкоголизма. В Соединенных Штатах почти половина смертей от заболеваний печени связана с алкоголем 1 , и ALD отвечает за почти 1 из 3 трансплантаций печени 2 . ALD имеет широкий спектр. Стеатоз, который характеризуется избыточным накоплением липидов в гепатоцитах, встречается на ранней стадии интенсивного питья и обратимо при прекращении употребления алкоголя. Под влиянием генетических и экологических факторов и продолжающимся потреблением алкоголя стеатоз печени может прогрессировать до алкогольного гепатита и, в конечном счете, цирроза 3 . Исследования с использованием моделей грызунов ALD обеспечили существенное понимание болезни, но они имеют ограничения (см. Ссылку 3 ). Устное питание от алкогольной диеты вызывает только стеатоз у грызунов 4 , </ Sup> 5 . Развитие воспаления и фиброза требует либо второго инсульта 6 , 7, либо хронического внутрижелудочного вливания, которое является инвазивным и технически сложным 8 , 9 . Телео данио также развивает повреждение печени в ответ на хроническое и острое лечение алкоголизмом 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . В частности, личиночные рыбки данио представляют собой привлекательный дополнительный модельный организм, в котором изучается острая алкогольная травма печени 10 , 11 , 13 , 15 . Печень данио является функциональной и производит ключевые ферменты для метаболизма этанола к 4-му дню(Dpf) 13 , 16 , 17. Этанол может быть непосредственно добавлен в воду, а воздействие на 2% этанола в течение 24 ч является достаточным для индуцирования печеночного стеатоза и фиброгенных реакций у личинок рыбок данио 13,15.

Сообщалось, что обработка 2% этанола в течение 24 ч приводила к концентрации тканевого этанола 80 мМ у личинок рыбок данио 13 . Другие показали, что личинки переносят эту концентрацию, и фенотипы печени, наблюдаемые у обработанных животных, специфичны для воздействия этанола 11 , 13 , 15 , 18 . Тем не менее, поскольку 80 мМ почти смертельно для людей 19 , важно оценить гистологию печени обработанных этанолом рыбок данио и детейRmine физиологическое отношение к людям.

Быстрое внешнее развитие и просвечивание личинок рыбок данио позволяют характеризовать действие алкоголя в печени в режиме реального времени и в фиксированных образцах. Доступность флуоресцентных трансгенных линий, специфичных для клеточного типа, и последние достижения в конфокальной микроскопии облегчают изучение того, как различные типы клеток печени изменяют свою морфологию и поведение в ответ на лечение острым этанолом 11,15. Однако конфокальная визуализация флуоресцентного трансгенного данио не может полностью заменить окрашивание гематоксилин-эозином (H & E) при исследовании гистологии печени. Маркировка всех типов клеток печени одновременно с использованием трансгенных рыбок данио требует генерации отдельных трансгенных линий, каждая из которых маркирует один тип клеток печени уникальным флуорофором. Введение различных трансгенных фоновых условий в одну и ту же рыбу требует разведенияG нескольких поколений, что требует больших затрат времени и затрат. Дополнительное окрашивание иммунофлуоресценции необходимо для обнаружения компонентов внеклеточного матрикса. С другой стороны, окрашивание H & E одновременно маркирует все типы клеток печени и компоненты внеклеточного матрикса, таким образом обеспечивая обзор печени 20 . Более того, он легко обнаруживает несколько гистопатологических признаков заболеваний печени, таких как смерть гепатоцитов, стеатоз и фиброз. Хотя H & E является обычным пятном в гистологии печени млекопитающих, оно обычно не используется в исследованиях печени рыбок данио, а протокол менее хорошо известен.

Эта работа описывает протокол для обработки острым этанолом у личинок рыбок данио и для последующего гистологического анализа с окрашиванием H & E. Протокол окрашивания H & E может использоваться во всех исследованиях развития и функционирования печени. Кроме того, парафиновые срезы могут быть использованы для иммуногистохимии, а также для других специальных исследованийIns в патологии печени, включая пятно трихрома, окрашивание ретитулина и т . Д.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AB WT взрослых и личиночных данио были сохранены в стандартных условиях 21 в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальные институты здравоохранения, публикация 86-23, пересмотрен в 1985 году); Их использование было одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Детского медицинского центра в Цинциннати (CCHMC).

1. Подготовка растворов

  1. Подготовьте воду из яиц.
    1. Приготовьте раствор исходной соли путем растворения 40 г коммерческой морской соли в 1 л дважды дистиллированной воды (ddH 2 O). Перемешать до полного растворения всех солей.
    2. Приготовьте 0,1% раствор метиленового синего, добавив 0,1 г порошка к 100 мл ddH 2 O.
      ОСТОРОЖНО: Метиленовый синий является раздражителем, если он вступает в контакт с глазами или кожей. При обращении с порошком всегда надевайте халат и перчатки.
    3. Объединяют 28,125 мл запаса соли такИ 7 мл раствора метиленового синего в 50 мл конической пробирке. Хорошо перемешать. Добавьте эту смесь к 15 л ddH 2 O. Тщательно встряхните и храните при комнатной температуре.
  2. Подготовка 100 мл 1 М Трис-HCl путем добавления 12,1 г порошка Трис в 100 мл ddH 2 O. Отрегулируйте рН до 9,0 с помощью соляной кислоты (HCl).
    ОСТОРОЖНО: HCl может вызвать сильные ожоги и раздражение слизистой оболочки при вдыхании. Всегда носите лабораторное пальто и перчатки и обрабатывайте бутылку с запасом в химическом капюшоне.
  3. Приготовьте 0,4% раствор трикаина (этил 3-аминобензоат метансульфонат).
    1. Растворяют 2 г порошка трикаина в 489,5 мл ddH 2 O. Добавляют 10,5 мл раствора Трис-HCl, pH 9. Перемешивают при помощи мешалки, пока весь порошок не растворится. Доведите до рН 7,0.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Порошок Трикаина может быть раздражителем дыхательной системы. При обращении с порошком всегда надевайте противопылевую маску.
    2. Аликвоту 45 мл раствора трикаина в 50 мл конических пробирок. Сохраняйте решениеN при 4 ° C для немедленного использования и при -20 ° C для длительного хранения.
  4. Подготовьте фиксатор Дитриха, объединив 30 мл 95% этанола, 10 мл 37% формальдегида, 2 мл ледяной уксусной кислоты и 58 мл ddH 2 O в стеклянной бутылке. Хорошо перемешайте, закручивая и храните при комнатной температуре.
    ОСТОРОЖНО: Формальдегид является подозрением на канцероген, и любой раствор с формальдегидом следует использовать в химическом капюшоне. Ледниковая уксусная кислота может вызвать серьезные ожоги кожи и повреждение глаз. Всегда носите лабораторное пальто и перчатки и обрабатывайте основной раствор в химическом капюшоне. Формальдегид, ледяная уксусная кислота и 95% этанол являются легковоспламеняющимися жидкостями и должны храниться в специально предназначенном огнеопасном шкафу.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Фиксатор Дитриха стабилен при комнатной температуре в течение 1 года.
  5. Готовят 1 л 10-кратного фосфатно-солевого раствора (PBS) путем добавления 80 г хлорида натрия (NaCl), 2 г хлорида калия (KCl), 14,4 г динатрийфосфата (Na 2 HPO 4 ) и 2.4 г монокалийфосфата (KH 2 PO 4 ) до 800 мл ddH 2 O. Доведите рН до 7,4 с помощью гидроксида натрия (NaOH) и добавьте ddH 2 O в 1 л конечного объема. Хранить этот раствор при комнатной температуре после автоклавирования на жидкостном цикле, который продувается в течение 1 мин и инкубируется при 121 ° С в течение 20 мин.
  6. Сделайте 1 л 1х PBS путем разбавления 100 мл 10х раствора PBS в 900 мл ddH 2 O. Хорошо перемешайте, встряхивая и сохраняя при комнатной температуре после автоклавирования.
  7. Подготовьте 3% агарозу в стеклянной бутылке для эмбриона.
    1. Добавляют 3 г агарозы к 100 мл ddH 2 O и перемешивают закручиванием. Нагрейте смесь микроволновым излучением, чтобы растворить агарозу, и осторожно наблюдайте во время нагревания, чтобы обеспечить минимальное кипение.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Бутылка, вероятно, будет горячей, если ее удалить из микроволновой печи, несмотря на короткий нагрев. Используйте защитную перчатку или перчатку для удаления бутылки с микроволновой печи.
    2. Выньте бутылку из микроволновой печи.В то время как кружась мягко, ищите любые кристаллы, которые не полностью растворены; Если кристаллов нет, раствор готов к использованию. Храните 3% агарозу при комнатной температуре и снова нагрейте перед использованием.
  8. Матричный раствор Harris hematoxylin для удаления любых твердых частиц, которые выпали в осадок.
    1. Сложите фильтр для кофе пополам, чтобы фильтр создавал конус. Откройте боковую панель так, чтобы жидкость проходила через фильтр, позволяя выловить любой мусор.
    2. Поместите фильтр в воронку и воронку в бутылку из стеклянного носителя. Постепенно вылейте гематоксилин в почву через фильтр.
      ОСТОРОЖНО: Гематоксилин является опасным при контакте с глазами, при проглатывании и при вдыхании. Всегда носите лабораторное пальто и перчатки и обрабатывайте основной раствор в химическом капюшоне.
  9. Готовят 0.05% HCl, добавляя 125 мкл 12 N HCl к 250 мл ddH 2 O.
  10. Приготовить смесь раствора эозина Y-флоксин B путем объединения 25 мл 1% eОсин Y (водн.), 2,5 мл 1% флоксина В (водн.), 195 мл 95% этанола и 1 мл ледяной уксусной кислоты в стеклянной бутылке. Хорошо перемешать, закручивая и храня в РТ
    ОСТОРОЖНО: Eosin Y опасен для глазного контакта, проглатывания и вдыхания. Всегда носите лабораторное пальто и перчатки и обрабатывайте основной раствор в химическом капюшоне.
  11. Готовят 2% этанола, добавляя 2 мл чистого этилового спирта к 98 мл воды из яиц.
    ВНИМАНИЕ: Этиловый спирт является раздражителем глаз. При обращении с этиловым спиртом всегда надевайте защитные средства. Он также легко воспламеняется и должен быть обработан и храниться соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый раз перед началом лечения острым этанолом следует приготовить свежий 2% -ный этанол.

2. Выполните лечение острого этанола у личинок данио рерио

  1. Чтобы произвести эмбрионы, установите кресты с одним самцом дикого типа и одной женской рыбой WT на спаривающий резервуар. Разделите их, вставив пластиковый разделитель в спаривающий резервуар.
    ПРИМЕЧАНИЕ.Скрещивания после окончательного кормления в день, чтобы хорошо кормить рыб.
    1. В 8 часов утра следующего дня потяните делитель, чтобы позволить спариться.
    2. Через 1 ч верните взрослую рыбу в исходный резервуар. Соберите эмбрионы, вливая воду, содержащую эмбрионы, в фильтр. Переверните фильтр в 100-миллиметровой чашке Петри и промойте эмбрионы в блюдо, используя промывочный флакон с водой из яиц. Поместите блюдо с эмбрионами в инкубатор при 28 ° C.
    3. Когда эмбрионы достигают по крайней мере 4-клеточной стадии (1 hpf), удалите любые неоплодотворенные эмбрионы и мусор в воде с помощью пипетки Пастера и поместите чашку с удобренными эмбрионами в инкубатор при 28 ° C. Поддерживать эмбрионы в инкубаторе при 28 ° С до 96 ч после оплодотворения.
    4. Анестезируют личиночную рыбу, добавляя раствор трикаина в воду из яйца при соотношении 1-10 (объем / объем).
    5. Выбирайте до сорока личинок 96 hpf, которые имеют надутый пузырь плавания, используяПипеткой Пастера и разделить их равномерно на две новые чашки Петри.
    6. Вынимают столько остаточной воды яйца насколько возможно. При плотности одной личинки на мл добавьте яичную воду, содержащую 2% этанола, в одну чашку. Добавьте такое же количество яичной воды в другое блюдо, которое будет служить в качестве контроля.
    7. Держите контрольные и обработанные этанолом личинки в рыбной комнате в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Проведение этанольной обработки в рыбном зале с 14-часовым циклом света / 10 ч темным приводит к более устойчивой и сильной травме печени, чем проведение эксперимента в темноте в инкубаторе.
    8. Соберите личинки в 1,5 мл центрифужной пробирке не более чем с 20 личинками на пробирку.
    9. Удалите как можно больше жидкости из личинок и добавьте по крайней мере 1 мл (объем ткани 10х) фиксажа Дитриха в химическом капюшоне. Дайте рыбе закрепиться на нутаторе при комнатной температуре не менее 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба стабильна в фиксаторе Дитриха в течение нескольких недель.
<P class = "jove_title"> 3. Подготовка тканевых кассет и переработка

  1. Укажите необходимое количество кассет для салфеток и две синие биопсийные подушечки на кассету. Поместите одну биопсию в нижней части каждой кассеты. Пометьте каждую кассету карандашом, четко идентифицируя образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Не используйте ручку или маркер для маркировки кассет, поскольку этикетки будут потеряны на последующих этапах.
  2. Внедрение личинок в 3% агарозу для обеспечения последовательной ориентации всех образцов.
    1. Удалите фиксатор из пробирок в химическом капюшоне и промойте личинки 3 раза по 5 минут каждый с 1 мл 1x PBS. Поместите трубки в нутатор при RT во время промывок.
    2. Во время промывок нагревают приготовленную 3% агарозу в воде с использованием микроволновой печи для плавления твердого вещества. Одновременно нагревайте в течение 30 секунд и осторожно наблюдайте, чтобы свести к минимуму кипение. Держите жидкую агарозу на горячей пластине, установленной до 90 ° C, осторожно размешивая.
    3. Используя переносную пипетку, переместите до 8 лArvae к пластической гистологической плесени и удалить как можно больше PBS. Используя переносную пипетку с отрезанным наконечником, полностью заполните форму 3% агарозой.
    4. Используя инсулиновый шприц, соберите личинки в центр формы и протолкните их на дно. Для сагиттальных сечений расположите личинок в линию, при этом головы должны быть обращены к верхней части формы. Чтобы печень была ориентирована последовательно, поверните личинки так, чтобы левая сторона тела была обращена вниз и плотно прилегала к нижней части формы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку печень расположена на левой стороне тела, такое позиционирование сводит к минимуму количество участков, которые необходимо разрезать до достижения печени. Держите личинки как можно ближе друг к другу.
    5. Установите форму в сторону в течение 4-5 мин, чтобы агароза полностью установилась. Удалите агарозный блок из формы и используйте лезвие для обрезания агарозы вокруг личинок. Стенд блок на конец и сократить толщину в половине сO что конечный блок имеет толщину приблизительно 2-3 мм.
    6. Перенесите небольшой агарозный блок на подготовленную кассету для тканей (шаг 3.1) и поместите вторую биопсию на верхнюю часть блока. Закройте кассету и поместите полностью собранную кассету в герметичный контейнер со свежеприготовленным 70% -ным этанолом в ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если кассеты не будут обрабатываться немедленно, поместите их в 70% этанол в контейнер при 4 ° C, чтобы избежать потери фиксации. Кассеты устойчивы при температуре 4 ° C в течение 3 дней.
  3. Обработка тканей
    ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы можно подавать в лабораторию гистологии или патологии, оснащенную тканевым процессором для обработки кассет в парафине. Запросите стандартную программу обработки O / N, а не короткую программу, чтобы парафин полностью проникал в агарозу.
    1. Обработайте кассетные ткани путем переноса их через ряд разбавления этанола, с увеличивающимся количеством спирта, доОбезвоживают ткань следующим образом: 70% этанола 2 раза, по 45 мин каждый; 80% этанола, 45 мин; 95% этанола, 2 раза по 45 минут каждый; 100% этанола, 2 раза по 45 минут каждый.
    2. Замените спирт растворителем (100% ксилол, 2 раза, по 45 мин каждый), чтобы парафин просочился в ткань.
      ОСТОРОЖНО: Ксилол является раздражителем и вреден при вдыхании. Обязательно всегда используйте химический капюшон. Ксилол легко воспламеняется и должен храниться соответственно.
    3. Инкубируйте кассеты в парафине O / N в инкубаторе при 60-65 ° C. Держите кассеты в тепле.
  4. Вставить обработанные агарозные блоки в парафин.
    1. Выньте одну кассету из нагревательного ящика встраиваемой машины и снимите крышку кассеты и верхнюю биопсийную подушку с кассеты. Заполните гистологическую плесень жидким парафином и держите ее на теплой пластине на погружной машине.
    2. Используя теплые щипцы, возьмите агарозный блок из кассетыE и перенести его в гистологическую форму с помощью парафина. Убедитесь, что сторона агарозного блока с рыбой, ближайшей к поверхности, обращена вниз. Выбросьте нижнюю биопсийную подушку и перенесите всю гистологическую плесень на холодную пластину на погружной машине.
    3. Используя щипцы, быстро поместите агарозный блок в центр формы; Поместите блок на дно формы. Как только блок будет правильно размещен, поместите нижнюю часть кассеты поверх гистологической формы и заполните ее наполовину жидким парафином. Поместите форму непосредственно на плиту 4 ° C и не мешайте блокам в течение по крайней мере 10-15 минут, чтобы позволить парафину затвердеть. Пока идет настройка первого блока, повторите этот процесс для оставшихся блоков.
    4. Как только парафин будет установлен для всех блоков, удалите гистологическую плесень из парафинового блока, слегка нажав на пресс-форму, чтобы ослабить ее. Эти парафиновые блоки могут храниться при комнатной температуре неограниченно долго.
  5. 4. Секционирование парафиновых блоков

    1. Накануне секционирования, лицом в парафиновый блок, используя микротом для удаления избытка парафина, покрывающего ткань. Участок 5 мкм за один раз, пока ткань не окажется на поверхности парафинового блока. Остановите и выбросьте все разрезы, которые вырезаны. Замочите блоки лицевой стороной вниз в 1x PBS при 4 ° CO / N.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Блоки должны быть пропитаны в течение не менее 8 часов. Начало замачивания в конце дня. Если блоки остаются в 1x PBS слишком долго, ткань может набухать и искажаться.
    2. Удалите по одному блоку из 1x PBS и разрежьте 5-мкм срезы с помощью микротома. Отделите ленту секций от лезвия, аккуратно оттянув последнюю часть от лезвия с помощью пинцета или щетки. Поднимите ленту по последней секции с помощью щипцов и перенесите ее на водяную баню при 42 ° C. Позвольте лентам плавать на поверхности воды в течение как минимум 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ:N перенося разделов, не позволяйте пинцетом касаться воды, в то же время в контакте с парафином. В противном случае, парафин будет плавиться на щипцы и сделать разделение очень трудно. Если необходимо, разделите секции на более мелкие группы, используя чистые щипцы, чтобы они могли легко вписаться в слайды. Осторожно коснитесь шва между секциями, чтобы создать разделение без повреждений.
    3. Поместите заряженный предмет в воду под углом 45 градусов и аккуратно расположите его под группой секций, которые необходимо собрать. Аккуратно поднимите слайд с воды и разрешите прикреплять секции к предметному стеклу.
    4. Излейте лишнюю воду из секций, используя ткань без ворса. Поместите слайд в держатель или коробку слайда. Продолжайте секцию блока, пока не будет собрана желаемая ткань. Повторите процесс секционирования для всех блоков.
    5. Выпекайте слайды в инкубаторе или духовке при 55 ° C в течение 3-16 часов, чтобы расплавить парафин. Удалите слайды из духовки и дайте имO остыть перед началом окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Парафиновые срезы могут храниться при RT неограниченно, как до, так и после выпечки.

    5. Окрашивание гематоксилин-эозином парафиновых сечений

    1. Депарафинизировать слайды путем погружения их в 100% ксилол в течение 15 мин; Замените его на свежий 100% ксилол еще на 15 минут.
    2. Увлажняют слайды, погружая их через следующую серию градуированного этанола до тех пор, пока жидкость не начнет очищаться от слайдов. Для каждого раствора окунать 8-10 раз, 2 с на один провал: 100% этанол, 100% этанол, 95% этанол, 95% этанол, 70% этанол, 50% этанол, 30% этанол и деионизированная вода.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Протокол можно остановить здесь, и слайды можно оставить при комнатной температуре в течение нескольких часов. При необходимости слайды можно хранить при температуре 4 ° C в воде O / N.
    3. Поместите слайды в 100% -ный фильтрованный гематоксилин Харриса в течение 4 мин. Немедленно переносите их обратно в контейнер с деионизированной водой. Пропустите деионизированную воду в tОн обратный угол контейнера, самый дальний от секций. Периодически опорожняйте контейнер, пока вода не станет фиолетовой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Не допускайте попадания воды непосредственно на слайды, так как эти секции могут выпасть из слайдов.
    4. Быстро проверяйте интенсивность гематоксилина на рассекающем микроскопе с помощью гусиного света; Не позволяйте слайдам высохнуть. Если окраска достигла желаемой интенсивности, перейдите к следующему шагу. Если цвет недостаточно темный, поместите слайды в 100% гематоксилин в течение 1 мин и повторите промывку водой перед повторной проверкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Гематоксилин должен быть достаточно темным, чтобы цвет не терялся во время окрашивания эозином. Тем не менее, если окрашивание гематоксилином наблюдается в цитоплазме, участки перекраины.
    5. Окуните слайды дважды в 0,05% HCl и сразу же переносите их обратно в контейнер с чистой деионизированной водой. Опорожните воду и дважды наполните контейнер водой.
    6. Передача слайдов на 95% и болееHanol в течение 30 с, а затем переносят их в новый контейнер с 95% -ным этанолом в течение 30 с.
    7. Поместите слайды в раствор эозина Y-флоксин B в течение 2 мин. Перенесите слайды обратно в предыдущий 95-процентный контейнер с этанолом и быстро проверьте интенсивность цвета под рассекающим микроскопом. Если окрашивания достаточно, переходите к следующему шагу. Если нет, вернитесь к раствору эозина в течение 30 с, проверьте еще раз и повторите при необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Достаточное окрашивание эозином является ярко-розовым и проявляется в явном контрасте с гематоксилиновым пятном. Обязательно протрите любое решение с задней стороны слайдов при проверке под микроскопом, чтобы не наблюдалось ложного цвета. Поскольку эозин состоит из 95% этанола, длительные периоды времени в 95% этаноле, в то время как проверка интенсивности цвета может выщелачивать часть цвета.
    8. Перенесите слайды в 100% изопропанол на 15 секунд. Замените свежим 100% -ным изопропанолом и поставьте слайды обратно в изопропанол еще на 15 с. Повторите этот pВ общей сложности 6 промываний изопропанолом.
      ОСТОРОЖНО: Изопропанол является раздражителем для глаз и органов дыхания. Обязательно надевайте защитное снаряжение и избегайте разбрызгивания. Он также легко воспламеняется и должен храниться и обрабатываться соответствующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы сэкономить на реагентах, отбросьте только первую (самую розовую) промывку изопропанолом. Остальные пять промывочных растворов следует хранить во флаконах с номерами от 1 до 5, чтобы повторно использовать их для следующего окрашивания. При повторном использовании промывок начинайте с бутылки с номером «1» и отбрасывайте после использования. Как только моют «2», вылейте его в бутылку «1» и так далее. Окончательная промывка всегда должна быть свежей изопропанолом.
    9. Поместите слайды в 100% ксилолов в течение 3 мин. Удалите по одному слайду за раз и поместите покровное стекло.
      1. Добавьте достаточное количество монтажной среды для покрытия секций и окунайте их в 100% ксилол.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг позволит сгладить поверхность монтажной среды и удалить все пузырьки.
      2. Применить покровное стеклоК нижней части слайда.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Монтажная среда должна вытягивать ползун в нужное положение. Если покровное стекло не является прямым или полностью уложенным, аккуратно постучите по нему.
      3. Заклейте лишнюю среду для установки на бумажное полотенце, пока не увидите только тонкую линию. Окуните салфетку в ксилол и протрите спину слайда, чтобы удалить капающую среду. Поместите плоский слайд на прочную, но подвижную поверхность, как кусок картона. Покрывает все остальные слайды одним и тем же способом. Дайте ксилолу испариться в капоте на 10 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Любые материалы, загрязненные ксилолом, следует удалить и выбросить в герметичный контейнер в вытяжном шкафу, чтобы предотвратить испарение любых паров.
    10. Дайте отверждающей среде затвердеть при RT O / N.

    6. Отображение и хранение пятен с пятнами

    1. Разделы изображения на сложном инвертированном микроскопе 18 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Слайды могут храниться в помещении teНеограниченно долго.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

10% буферный формалин и 4% параформальдегид (PFA) являются двумя наиболее часто используемыми фиксаторами, используемыми для гистологических методов. Однако они не дают оптимальных результатов фиксации для ткани печени данио ( рис. 1 и табл. 1 ). Фиксация с 10% формалином или 4% PFA часто приводит к усадкам, создавая большие промежутки между печенью и окружающими тканями ( рис. 1A , B ; на рисунке 1B показан пример усадки ткани). Части печени могут также выпадать из секции. Цитоплазма гепатоцитов часто теряется ( рис. 1А , ). Оба фиксата могут вызывать искажение гепатоцитов, так как они либо сжимаются, либо разбухают, и больше не поддерживают столбчатую морфологию, которая характерна для эпителиальных клеток. Еще одна проблема с фиксацией PFAЧто существуют промежутки между гепатоцитами, которые не являются реальными, что приводит к тому, что ткань выглядит переломанной ( рисунок 1B ). Кроме того, когда используется любой из этих двух фиксаторов, гепатоциты хорошо окрашиваются гематоксилином, но в меньшей степени - эозином ( фиг. 1А ). Фиксирующий препарат Дитриха, основанный на кислоте, преодолевает проблемы с фиксаторами формалина и PFA ( рисунок 1C ).

В ALD человека стеатоз, который состоит из жира малой и крупной капли, наиболее заметен вблизи центральной вены и простирается наружу к портальной триаде с возрастающей серьезностью 22 . У рыбок данио обработка 2% этанола с 96-120 л.с.ф. также индуцирует печеночный стеатоз, что связано с чрезмерным осаждением круглых капелек в гепатоцитах ( рис. 2В , стрелки). Однако капельки не проявляютсяТа же картина распределения, что и при ALD человека, потому что нет четкого различия между портальными и центральными венами печени печени рыбок данио 23 . Печеночные кровеносные сосуды в обработанной этанолом личиночной печени опухают по сравнению с таковыми в контрольной печени ( рис. 2В , звездочки).

Рисунок 1
Рисунок 1 : Сравнение окрашивания H & E в печени личинок данио рерио, которые были исправлены с фиксаторами Differert при 120 hpf. ( A ) 10% формалина при RT O / N; ( B ) 4% PFA при 4 ° CO / N; ( C ) фиксатор Дитриха при КТ в течение 24 часов. При использовании 10% формалина гепатоциты часто теряют свою цитоплазму (А). Ткань не окрашивается должным образом эозином и появляется фиолетовым. После fixaС 4% ПФА, разрыв между гепатоцитами (В) наблюдается. 4% PFA заставляет ткань печени сокращаться, поэтому, как представляется, существует большой разрыв между печенью и окружающими тканями. Пунктирная линия в B обозначает границу окружающих тканей. Фиксатив Дитриха обеспечивает оптимальный результат среди трех (C). Шкала шкалы = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2 : Острая обработка этанолом вызывает печеночный стеатоз и опухание кровеносных сосудов в печени личинок данио рерио. ( A ) H & E окрашивание печени у контрольной, необработанной личинки WT. ( B ) H & E окрашивание печени у личинки wil-типа, которую обрабатывали 2% -ным этаноломНоль от 96 до 120 ч. Ф. Оба животных фиксировали фиксатором Дитриха в 120 hpf. Стрелки в (B) указывают на гепатоциты с чрезмерным осаждением круглых капелек. Звездочки отмечают опухшие печеночные кровеносные сосуды. Шкала шкалы = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

10% формалин 4% PFA Фиксатор Дитриха
Условие фиксации Не менее 24 ч при RT 3 ч при RT или O / N при 4 ° C Не менее 24 ч при RT
Пример фиксации записи в хранилище Неопределенно в RT До 2 недель при 4 ° C До 2 месяцев при RT
CompatibС извлечением геномной ДНК да да нет
усадка да да минимальный
Искажение клеток да да минимальный
Потеря сотовой информации да скромный минимальный
Сбалансированное окрашивание H & E Слабая эозиновая окраска Слабая эозиновая окраска да
Совместимость с иммуногистохимией да да да

Таблица 1: Сравнение 10% формалина, 4% ПФА и Фиксации Дитриха для гистологии печени Данио.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Текущий протокол описывает подробную процедуру для обработки острым этанолом у личинок рыбок данио и последующие гистопатологические анализы с окрашиванием H & E. Острая обработка этанолом должна проводиться не ранее чем через 96 ч после оплодотворения, так как на этой стадии печень данио начинает экспрессировать метаболизирующие спирт ферменты 13 . 2% этанола - это максимальная доза, которую личинки могут переносить 13 , 14 . Обрабатываемые этанолом личинки начинают проявлять печеночный стеатоз к 8 часам лечения, а процент личинок, развивающихся в стеатозе, продолжает расти до 24 часов непрерывного лечения 14 . Личинки данио извлекают питательные вещества исключительно из желтка до 120 л.с. Поэтому лечение этанолом, превышающее 120 hpf, не рекомендуется, поскольку голодание также может способствовать стеатозу 14 . По сравнению с протоколами, опубликованными другой лабораторией13 , 24 , основная модификация, сделанная в текущем протоколе, заключается в том, что обработка этанолом проводится в рыбном хозяйстве, которое имеет темный цикл света в свету / в 10 ч. Это приводит к более устойчивым и надежным реакциям в стеатозе, чем те, которые наблюдаются, когда лечение проводится в темноте в инкубаторе. Это может быть связано с тем фактом, что гены метаболического липида в печенке данио проявляют суточную экспрессию ритма в ответ на цикл 25 света / темноты.

ALD является хроническим заболеванием и занимает годы злоупотребления алкоголем. Критическое ограничение текущего протокола лечения этанолом заключается в том, что он вызывает только острую реакцию алкоголя на печень. Лечение с такой высокой концентрацией этанола более 48 часов вызывает высокую смертность, предотвращая исследование хронической печеночной недостаточности. Недавнее исследование показало, что непрерывное лечение взрослых данио с 1% этанолом до трехМесяцы привели к стеатозу, стеатогепатиту и фиброзу 12 . Перспективным будущим направлением может быть идентификация потенциального модулятора ALD с использованием протокола лечения острым этанолом, а затем его валидация в модели хронических повреждений.

Окрашивание H & E проводится для оценки повреждений гепатоцеллюлярного происхождения, вызванных острой обработкой этанолом. Из-за простоты проведения флуоресцентной визуализации у рыбок данио окрашивание H & E обычно не используется в гистологии печени данио, и процедура описана менее хорошо. Текущий протокол обеспечивает пошаговое описание окрашивания H & E в личиночной печени. Выбор правильного фиксатора является первым и наиболее важным шагом для окрашивания H & E. Хотя 10% -ный буферный формалин и 4% PFA обычно используются в гистологии, они оба вызывают усадку тканей и части печени, выпадающие из секции. Фиксация 10% формалина приводит к потере цитоплазмы в гепатеocytes. 4% фиксация PFA приводит к искусственным разрывам между гепатоцитами. Окрашивание эозином, по-видимому, значительно слабее, чем окрашивание гематоксилином в печени, которые фиксируются либо фиксатором. Фиксатор Дитриха на основе кислоты более подходит для окрашивания H & E печени данио, поскольку он сохраняет клеточные детали и минимизирует усадку. Он также, кажется, проникает в жировую ткань, такую ​​как печень, быстрее, чем формалин и PFA. Окрашивание гематоксилином и эозином является более сбалансированным. Одним из оговорок фиксатора Дитриха является то, что он несовместим для выделения геномной ДНК. В пробном эксперименте геномную ДНК экстрагировали из личинок, которые фиксировали с использованием 10% формалина, 4% PFA или фиксатора Дитриха 26 . Личинки инкубировали в 50 мкл 50 мМ NaOH при 95 ° С в течение 20 мин и затем охлаждали до 4 ° С. Затем для нейтрализации основного раствора добавляли 5 мкл 1 М Трис-HCl, pH 8,0. После кратковременного центрифугирования супернатант wКак используется в ПЦР. С теми же праймерами ПЦР и программой ПЦР геномная ДНК личинок, фиксированных формалином и PFA, давала ПЦР-продукты с предсказанными размерами, тогда как геномная ДНК личинок фиксированной фиксации Дитриха не давала никаких продуктов ПЦР.

Окрашивание H & E может проводиться как на парафиновых срезах, так и в замороженных средах. Однако парафиновые секции имеют следующие преимущества перед замороженными участками: 1) В то время как парафиновые секции можно хранить при комнатной температуре неограниченное время, замороженные секции можно хранить при -80 ° C в течение года. 2) Для замороженных срезов образование кристаллов льда внутри клеток может нарушить морфологию клеток и субклеточные детали. Кроме того, замороженные секции часто толще, чем парафиновые секции. Это может привести к ухудшению изображения морфологии тканей по сравнению с теми, которые производятся из парафиновых срезов.

При подготовке парафиновых блоков для тканей печени текущий протоколВстраивает личинки в агарозу. Личинки расположены сбоку, левая сторона тела обращена вниз и лежит плотно относительно нижней части формы. Это обеспечивает последовательную ориентацию печени, так что, когда срезы разрезаются последовательно, эквивалентные области печени можно сравнить с рыбой и рыбой 27 . Другим ключевым шагом, обеспечивающим успешное окрашивание H & E, является развитие цвета. Очень важно регулярно проверять окрашивание до достижения желаемой интенсивности цвета.

Окрашивание H & E следует использовать для получения предварительной оценки повреждения печени. Обрабатываемые этанолом личинки показывают чрезмерное осаждение круглых капелек в гепатоцитах, что свидетельствует о стеатозе 13 , 14 , 18 . Маркировка липидными красителями, такими как Oil Red O и Nile Red, необходима для подтверждения того, что эти капельки действительно являются липидами. Печеночный сосуд печениУ обработанных животных появляются растянутые и опухшие. Для изучения ультраструктурных изменений синусоид необходимо провести сканирующую электронную микроскопию и просвечивающую электронную микроскопию. Ранее сообщалось, что отложение белка внеклеточного матрикса увеличивается в печени обработанного этанолом печени рыбки данио, что обнаруживается иммунофлуоресценцией 18 . Однако, учитывая, что уровни экспрессии фиброгенных генов в обработанной рыбе 18 только незначительно увеличены, H & E может быть недостаточно чувствительным для обнаружения такого небольшого количества белков внеклеточного матрикса. Те же самые методы фиксации и окрашивания были испытаны на хронически поврежденной печени взрослых рыбок данио и были достаточны для обнаружения фиброза (Инь, неопубликованные данные).

Хотя текущий протокол предназначен для изучения гистологии печени у личинок рыбок данио, он имеет более широкое применение в сообществе исследователей данио, так как самE может применяться к другим тканям и к взрослым данио.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность д-ру Кэти Мюррей в Международном ресурсном центре Zebrafish; Д-р Стейси Хапперт и Кари Хапперт в CCHMC за их полезные советы по протоколу; И ветеринарная служба CCHMC, для ухода за рыбой. Эта работа была поддержана грантом NIH R00AA020514 и исследовательским грантом от Центра детской геномики в CCHMC (до CY). Кроме того, он частично поддерживался грантом NIH P30 DK078392 (Интегративное морфологическое ядро) Центра сердечно-сосудистых заболеваний в Цинциннати.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95, (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52, (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56, (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277, (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3, (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5, (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35, (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10, (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6, (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33, (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279, (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19, (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78, (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). University of Oregon Press. (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2, (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131, (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32, (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43, (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (11), 4358-4363 (2011).
Гистологический анализ острой алкогольной травмы печени у данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter