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Developmental Biology

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

このプロトコールは、2%エタノールで24時間処理したゼブラフィッシュ幼虫からの肝臓の組織学的分析を記載する。このような急性エタノール処理は、肝臓脂肪症および肝臓血管系の腫脹をもたらす。

Abstract

アルコール性肝疾患(ALD)は、急性または慢性のアルコール乱用による肝臓の損傷を指す。これは、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因の1つであり、米国では200万人を超える人々に影響を与える。アルコール誘発肝障害の根底にある細胞および分子メカニズムのより良い理解は、ALDの有効な治療法を開発するために重要である。ゼブラフィッシュの幼虫は、2%エタノールへのわずか24時間の曝露後に肝脂肪症および線維形成を示し、急性アルコール性肝障害の研究に有用である。この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理の手順を記述し、それが肝臓血管の脂肪症および腫脹を引き起こすことを示している。ゼブラフィッシュの幼虫肝臓の組織学的分析のために最適化されたヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の詳細なプロトコールも記載されている。 H&E染色は、免疫蛍光よりもいくつかのユニークな利点があります。細胞外成分を同時に検出することができ、脂肪症および線維症などの肝障害を容易に検出することができる。毒素およびウイルス誘発肝臓損傷ならびに遺伝性肝疾患のモデリングにおけるゼブラフィッシュの使用が増加していることを考えると、このプロトコールは、これらの研究すべてにおいて実施された組織学的分析の参考となる。

Introduction

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アルコール過多によって引き起こされるアルコール性肝疾患(Alcoholic Liver Disease:ALD)は、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因である。米国では、肝疾患の死亡のほぼ半分がアルコール1を含み、ALDは3回の肝臓移植2のほぼ1つを担っている2 。 ALDには広いスペクトルがあります。肝細胞における過剰脂質蓄積を特徴とする脂肪症は、飲酒の初期段階で起こり、アルコール使用の停止時に可逆的である。遺伝的および環境的要因および継続的アルコール摂取の影響下で、肝臓脂肪症はアルコール性肝炎および結局は肝硬変に進行することがある3 。げっ歯類のALDモデルを用いた研究では、この疾患に対する十分な洞察が得られているが、限界がある(文献3 )。アルコール飼料の経口給餌は、げっ歯類4 5 。炎症および線維化の発症には、侵襲的かつ技術的に挑戦的な第2の傷害6,7または慢性胃内注入が必要である8,9 。また、腸骨ジストロフィーは、慢性および急性のアルコール処置10,11,12,13,14,15の両方に応答して肝損傷を発症する。特に、幼虫ゼブラフィッシュは、急性アルコール性肝臓損傷10,11,13,15を研究するための魅力的な補完的モデル生物である。ゼブラフィッシュの肝臓は機能的であり、エタノール代謝の主要な酵素を4日で産生するゼブラフィッシュ幼虫13,15 肝臓脂肪症および線維形成反応を誘発するには、エタノールを2%エタノールに24時間暴露すれば十分です。

2%エタノールで24時間処理すると、ゼブラフィッシュの幼虫13の組織エタノール濃度が80mMになることが報告されている13 。他の者は、幼虫がこの濃度を許容し、処置動物に見られる肝表現型がエタノール暴露に特異的であることを示した11,13,15,18。しかしながら、ヒトでは80mMがほぼ致命的であるため、エタノール処理されたゼブラフィッシュの肝組織像を評価し、人間との生理学的関連性を明らかにする。

ゼブラフィッシュの幼虫の急速な外部発生および半透明は、肝臓内のアルコールの作用をリアルタイムおよび固定サンプルで特徴付けることを可能にする。細胞型特異的蛍光トランスジェニック系統の利用可能性と共焦点顕微鏡法の最近の進歩により、異なる肝細胞型が急性エタノール処理11,15に応答して形態および挙動をどのように変化させるかの研究が容易になる。しかし、蛍光トランスジェニックゼブラフィッシュの共焦点イメージングは​​、肝臓組織学を研究する場合、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を完全に代用することはできない。トランスジェニックゼブラフィッシュを用いて全ての肝臓細胞型を同時にマーキングするには、個々のトランスジェニック系統を作製する必要があり、それぞれが固有のフルオロフォアを有する肝臓細胞型を標識する。異なるトランスジェニック背景を同じ魚に導入するには、ブリーディングが必要ですg世代を必要とし、時間とコストがかかる。細胞外マトリックス成分を検出するためには、さらなる免疫蛍光染色が必要である。一方、H&E染色は、同時に全ての肝臓細胞型および細胞外マトリックス成分を標識し、肝臓の概要を提供する。さらに、肝細胞死、脂肪症および線維症などの肝疾患のいくつかの組織病理学的特徴を容易に明らかにする。 H&Eは哺乳動物の肝臓組織学におけるルーチンの染色であるが、ゼブラフィッシュの肝臓研究では一般的に使用されておらず、プロトコールはあまり確立されていない。

この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH&E染色によるフォローアップ組織学的分析のためのプロトコールを記載する。 H&E染色プロトコールは、肝臓の発達および機能に関するすべての研究に使用することができる。さらに、パラフィン切片は、免疫組織化学ならびに他の特別なスタチンのために使用することができるTrichrome stain、reticulin stain などの肝臓の病理学的特徴

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Protocol

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AB WT成体および幼虫ゼブラフィッシュは、実験動物のケアおよび使用のためのガイド(National Institutes of Health刊行物86-23、1985年改訂)に従って、標準的な条件下で維持された21 。それらの使用はシンシナティ児童病院メディカルセンター(CCHMC)の機関動物管理および使用委員会によって承認された。

1.ソリューションの準備

  1. 卵の水を準備する。
    1. 市販の海塩40gを1リットルの二重蒸留水(ddH 2 O)に溶解してストック塩溶液を調製する。すべての塩が完全に溶解するまでかき混ぜる。
    2. 100mLのddH 2 Oに0.1gの粉末を加えることによって0.1%メチレンブルー溶液を調製する。
      注意:メチレンブルーは、目や皮膚に触れた場合には刺激剤です。粉体を取り扱うときは、常にラボコートと手袋を着用してください。
    3. 28.125mLのストック塩をこのように混合する。溶液と7 mLのメチレンブルー溶液を50 mLコニカルチューブに入れます。よく混ぜます。この混合物を15LのddH 2 Oに加える。十分に振盪し、室温で保存する。
  2. 100mlのddH 2 Oに12.1gのトリス粉末を添加して100mlの1M Tris-HClを調製する。塩酸(HCl)を用いてpHを9.0に調整する。
    注意:HClを吸入すると、重度のやけどや粘膜刺激を引き起こすことがあります。常にラボコートと手袋を着用し、ケミカルフードでストックボトルを取り扱う。
  3. 0.4%トリカイン(エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホネート)溶液を調製する。
    1. 2gのトリカイン粉末を489.5mLのddH 2 Oに溶解する.10.5mLのTris-HCl、pH9溶液を加える。全ての粉末が溶解するまで攪拌棒で混合する。 pH 7.0に調整する。
      注意:トリカインパウダーは呼吸器の刺激物となります。粉末を取り扱うときは、常に埃マスクを着用してください。
    2. 45mLのトリカイン溶液を50mLコニカルチューブに分注する。ソルティオを保つ直ちに使用する場合は4℃で、長期保存する場合は-20℃で保存してください。
  4. ガラス製の瓶中で95%エタノール30mL、37%ホルムアルデヒド10mL、氷酢酸2mLおよびddH 2 O20mLを混合することにより、Dietrichの固定剤を調製する。旋回させてよく混合し、室温で保存する。
    注意:ホルムアルデヒドは発癌物質と思われ、ホルムアルデヒドを含む溶液は化学フードで使用する必要があります。氷酢酸は、重度の皮膚の火傷および眼の損傷を引き起こす可能性がある。常にラボコートと手袋を着用し、ストック溶液をケミカルフードで取り扱います。ホルムアルデヒド、氷酢酸、および95%エタノールはすべて可燃性液体であり、指定の可燃性キャビネットに保存する必要があります。
    注:Dietrich固定液は室温で1年間安定です。
  5. 塩化ナトリウム(NaCl)80g、塩化カリウム(KCl)2g、リン酸二ナトリウム(Na 2 HPO 4 )14.4g、および2を加えて、10倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液1Lを調製する。4gのリン酸一カリウム(KH 2 PO 4 )を800mLのddH 2 Oに添加する。水酸化ナトリウム(NaOH)を用いてpH7.4に調整し、1Lの最終容量にddH 2 Oを加える。 1分間パージし、121℃で20分間インキュベートする液体サイクルでオートクレーブした後、この溶液を室温で保存する。
  6. 100mLの10倍PBS溶液をddH 2 O 900mLで希釈して1LのPBS 1Lを調製する。オートクレーブ後、振盪して室温で保存する。
  7. 胚をマウントするためにガラス培地ボトルに3%アガロースを調製する。
    1. 3gのアガロースを100mLのddH 2 Oに加え、渦巻き混合する。アガロースを溶解するためにマイクロ波で混合物を加熱し、沸騰が最小限であることを確実にするために加熱中に注意深く観察する。
      注意:短い加熱にもかかわらず、電子レンジから取り出したときにボトルが熱くなる可能性があります。電子レンジからボトルを取り外すには、保護手袋またはミットを使用してください。
    2. 電子レンジからボトルを取り出します。穏やかに旋回しながら、完全に溶解していない結晶を探します。結晶がない場合、その溶液は使用の準備ができている。 3%アガロースを室温で保存し、使用前に再度加熱する。
  8. ハリスヘマトキシリン原液を濾過して、沈殿した固形物を除去する。
    1. フィルターが円錐を作るように、コーヒーフィルターを半分に折りたたみます。液体がフィルタを通過するようにサイドパネルを開き、ゴミを引っ掛けます。
    2. フィルターを漏斗の中に置き、漏斗をガラス媒体ボトルに入れる。徐々にストックヘマトキシリンをフィルターに注ぎます。
      注意:ヘマトキシリンは、眼に入った場合、摂取した場合、吸入した場合には危険です。常にラボコートと手袋を着用し、ストック溶液をケミカルフードで取り扱います。
  9. 250mLのddH 2 Oに125μLの12N HClを添加することにより0.05%HClを調製する。
  10. エオシンY-フロキシンB溶液混合物を25mLの1%e1%リン酸B(aq)2.5mL、95%エタノール195mLおよび氷酢酸1mLをガラス瓶中に入れた。旋回させてよく混合し、RTで保存する
    注意:Eosin Yは、眼に入った場合、摂取した場合、および吸入した場合には危険です。常にラボコートと手袋を着用し、ストック溶液をケミカルフードで取り扱います。
  11. 98mLの卵水に2mLの純エチルアルコールを加えて2%エタノールを調製する。
    注意:エチルアルコールは眼に刺激性があります。エチルアルコールを取り扱うときは、常に適切な保護具を着用してください。それはまた可燃性であり、それに応じて取り扱われ、保管されるべきである。
    注:急性エタノール処理を行う前に毎回新鮮な2%エタノールを調製してください。

2.ゼブラフィッシュ幼虫における急性エタノール処理の実施

  1. 胚を生成するには、1匹の野生型のオスと1匹のWTのメスの魚を交配して交配する。相手タンクにプラスチック製の仕切りを差し込んで分けてください。
    注:セット魚がうまく供給されるように、1日の最終的な給餌後に交配する。
    1. 翌朝の午前8時に、ディバイダを引っ張ってペアを合わせます。
    2. 1時間後、成魚を元のタンクに戻す。胚を含む水をストレーナーに注ぐことによって胚を収集する。 100ミリリットルのペトリ皿でストレーナーを回転させ、卵の入った洗濯瓶を用いて胚を皿に洗う。 28℃のインキュベーターに胚と皿を置きます。
    3. 胚が少なくとも4細胞期(1hpf)に達したら、パスツールピペットで水中の未受精の胚と破片を取り除き、28℃のインキュベーターに受精した胚を入れます。受精後96時間まで28℃でインキュベーター内の胚を維持する。
    4. トリカイン溶液を卵の水に1〜10(容量/容量)の割合で加えることによって、幼虫の魚を麻酔する。
    5. 膨らんだ水泳膀胱を持つ40頭の96 hpf幼虫を選択してくださいパスツールピペットを使い、2つの新しいペトリ皿に均等に分けます。
    6. 可能な限り多くの残留卵を取り出してください。 mLあたり1匹の幼虫の密度で、2%エタノールを含む卵の水を1つの皿に加える。他の皿に同量の卵の水を加えてコントロールにします。
    7. コントロールおよびエタノール処理した幼虫を魚の部屋に24時間放置する。
      注:14時間の光/ 10時間の暗サイクルを有する魚の部屋でエタノール処理を行うと、インキュベーター内の暗所で実験を行うよりも一貫性があり頑強な肝障害が生じる。
    8. チューブあたり20匹以下の幼虫を有する1.5mL遠心分離管内の幼虫を収集する。
    9. できるだけ多くの液体を幼虫から除去し、ケミカルフード内に少なくとも1mL(10倍組織量)のDietrich固定剤を添加する。魚を室温で少なくとも24時間ナッターで固定する。
      注:魚は数週間、Dietrichの固定剤で安定しています。
<p class = "jove_title"> 3。組織カセットの調製および処理

  1. カセットあたり必要な数の組織カセットと2つの青色生検パッドを設定します。 1つの生検パッドを各カセットの底に置きます。各カセットに鉛筆でラベルを付けると、サンプルがはっきりと識別できます。
    注記:後の手順でラベルが失われるため、ペンまたはマーカーを使用してカセットにラベルを付けないでください。
  2. 3%アガロースに幼虫を埋め込んで、すべてのサンプルの一貫した配向を確実にする。
    1. 固定液を化学フード内のチューブから取り出し、1x PBS 1mLでそれぞれ5分間3回幼虫を洗浄する。洗浄中にチューブを室温でナッターに置きます。
    2. 洗浄中、調製した3%アガロースをマイクロ波を用いて水中で加熱して固体を融解する。一度に30秒間加熱し、沸騰を最小限に抑えるよう注意深く観察する。穏やかに攪拌しながら90℃に設定したホットプレート上に液体アガロースを保つ。
    3. 移送ピペットを使用して、最大8リットルarvaeをプラスチックの組織学的型に加え、できるだけ多くのPBSを除去する。チップを切断した移送ピペットを使用して、3%アガロースでモールドを完全に満たします。
    4. インスリン注射器を使用して、幼虫をモールドの中心に集め、それらを底に押します。矢状断面では、頭部を金型の頂部に向けて、幼虫を一列に配置する。肝臓が一貫した方向に向くようにするには、体の左側が下を向くように幼虫を回し、型の底に平らにします。
      注:肝臓は体の左側に位置するため、肝臓に到達する前に切断する必要のある部分の数を最小限に抑えます。可能な限り幼虫を互いに接近させてください。
    5. 金型を側面に4〜5分間セットして、アガロースを完全にセットする。金型からアガロースブロックを取り出し、幼虫の周りのアガロースをトリミングするためにかみそりの刃を使用してください。ブロックを端に立て、厚さを半分に切断する最終ブロックは約2〜3mmの厚さであること。
    6. 小さなアガロースブロックを準備した組織カセットに移し(ステップ3.1)、2番目の生検パッドをブロックの上に置きます。カセットを閉じ、ddH2O中に新たに調製した70%エタノールを含むシール可能な容器に、完全に組み立てたカセットを入れる。
      注意:カセットを直ちに処理しない場合は、4℃の容器内に70%エタノールを入れて固定を忘れないようにしてください。カセットは4℃で3日間安定です。
  3. 組織処理
    注:サンプルは、パラフィンでカセットを処理するための組織プロセッサーを備えた組織学または病理検査室に提出することができます。パラフィンがアガロースに完全に浸透できるように、短いプログラムではなく標準のO / N処理プログラムを要求します。
    1. 組織のカセットを、アルコールの量を増やしながらエタノールの希釈系列に移すことによって処理する。次のように組織を脱水する:70%エタノール2回、各45分; 80%エタノール、45分; 95%エタノール、2回、各45分; 100%エタノール、2回、各45分。
    2. パラフィンが組織に浸透するようにアルコールを溶媒(100%キシレン、2回、それぞれ45分間)と交換する。
      注意:キシレンは刺激性があり、吸入すると有害です。必ず化学フードを使用してください。キシレンは可燃性であり、したがって保管する必要があります。
    3. パラフィンO / N中のカセットをインキュベーター内で60〜65℃でインキュベートする。包み込むまでカセットを暖かく保つ。
  4. 処理されたアガロースブロックをパラフィンに埋め込む。
    1. 埋め込み機の温かい引き出しから1カセットを取り出し、カセットの蓋と上部生検パッドをカセットから取り外します。組織パラダイムを液体パラフィンで満たし、包埋装置の温かいプレートに保持する。
    2. 温かい鉗子を使用して、カセットからアガロースブロックを拾い上げるeをパラフィンで組織型に移す。表面に最も近い魚のアガロースブロックの側面が下を向いていることを確認します。ボトム生検パッドを取り除き、組織学的モールド全体を包埋機のクールプレートに移す。
    3. 鉗子を使用して、アガロースブロックを金型の中央に素早く配置します。金型の底にブロックを置きます。ブロックが適切に配置されたら、カセットの底を組織学的モールドの上に置き、液体パラフィンで途中まで充填します。 4°Cプレートに直接モールドを置き、パラフィンを凝固させるためにブロックを少なくとも10〜15分間妨害しないでください。最初のブロックが設定されている間、残りのブロックに対してこのプロセスを繰り返します。
    4. すべてのブロックにパラフィンをセットしたら、パラフィンブロックから組織学的モールドを軽く押して緩めます。これらのパラフィンブロックは、室温で無期限に貯蔵することができる。
  5. 4.パラフィンブロックの分割

    1. セクショニングする前日に、ミクロトームを用いてパラフィンブロックを顔にして、組織を覆う余分なパラフィンを除去する。パラフィンブロックの表面に組織が暴露されるまで、一度に5μmの厚さに切断する。切断されたすべてのセクションを停止して破棄します。 4°CO / Nで1x PBSでブロックを下に向けて浸します。
      注:ブロックは少なくとも8時間浸漬する必要があります。一日の終わりに浸漬を開始します。ブロックが1倍のPBSに長時間放置されていると、組織が腫れて歪んでしまうことがあります。
    2. 1x PBSから一度に1ブロックを除去し、ミクロトームを用いて5μm切片を切断する。鉗子またはブラシを使用して、ブレードから最後の部分を静かに引っ張って、セクションからリボンを分離します。鉗子を使用して最後のセクションでリボンをピックアップし、42℃の水浴に移す。少なくとも5分間リボンを水面に浮かべてください。
      注:パラフィンに接触している間に鉗子が水に触れないようにしてください。そうしないと、パラフィンが鉗子に溶けて分離が非常に困難になります。必要に応じて、クリーンな鉗子を使用してセクションを小さなグループに分けて、スライドに簡単にフィットさせるようにしてください。セクション間の縫い目に静かに触れ、破損することなく分離を作成します。
    3. 帯電したスライドを45度の角度で水の中に入れ、収集するセクションのグループの下に注意深く配置します。スライドを水から慎重に持ち上げて、セクションをスライドに取り付けます。
    4. 糸くずのないティッシュを使用して、セクションから余分な水を取り除きます。スライドホルダーまたはボックスにスライドを置きます。所望の組織が採取されるまで、ブロックを切断し続ける。すべてのブロックに対してセクション処理を繰り返します。
    5. パラフィンを溶かすためにスライドを55℃のインキュベーターまたはオーブンで3-16時間焼く。オーブンからスライドを取り出し、o染色が始まる前に冷ます。
      注:パラフィン切片は、ベーキングの前後の両方で無期限に室温で保存することができます。

    パラフィン切片のヘマトキシリン染色およびエオシン染色

    1. スライドを100%キシレンに15分間浸漬して脱パラフィンする;さらに15分間新鮮な100%キシレンに変更してください。
    2. 液体がスライドからきれいに動くまで、次の一連の段階的エタノールに浸してスライドを再水和する。各溶液について、100%エタノール、100%エタノール、95%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、30%エタノール、および脱イオン水の各浸漬につき8-10回、2秒浸漬する。
      注記:このプロトコールはここで停止することができ、スライドは水中で数時間放置することができます。必要に応じて、スライドを4℃で水中に保存することができます。
    3. スライドを100%濾過したHarrisヘマトキシリンに4分間入れる。直ちに脱イオン水でコンテナに戻してください。脱イオン水をtに流す彼はセクションから最も遠いコンテナの後ろのコーナーにいます。水がもはや紫色にならなくなるまで定期的に容器を空にする。
      注:セクションがスライドから外れる可能性があるため、水がスライドに直接流れないようにしてください。
    4. グースネックライトを使用して、解剖顕微鏡でヘマトキシリン強度を素早くチェックします。スライドを乾燥させないでください。汚れが所望の強度に達した場合は、次のステップに進む。色が十分暗くない場合は、スライドを100%ヘマトキシリンに1分間置き、再度水洗を繰り返してから再度確認してください。
      注:ヘマトキシリンは、エオシン染色中に色が失われないように十分に暗くする必要があります。しかし、ヘマトキシリン染色が細胞質に見られる場合、切片は過剰染色される。
    5. スライドを0.05%HClで2回浸漬し、直ちに清浄な脱イオン水で容器に戻します。水を空にして容器に水を2回補充する。
    6. スライドを95%に転写するhanolを30秒間加えた後、95%エタノールで30秒間新しい容器に移す。
    7. 2分間、スライドをエオシンY-phloxine B溶液に入れる。スライドを前の95%エタノール容器に戻し、解剖顕微鏡下で色の強度を素早くチェックする。染色が十分であれば、次のステップに進んでください。そうでない場合は、30秒間エオシン溶液に戻り、再度確認し、必要に応じて繰り返します。
      注:十分なエオシン染色は明るいピンクであり、ヘマトキシリン染色とは明らかに対照的である。顕微鏡の下で偽色が観察されないようにチェックするときは、スライドの裏側から溶液を拭き取ってください。エオシンは95%のエタノールで構成されているため、95%のエタノールで長時間放置すると色の濃さを確認しながら色の一部が溶出することがあります。
    8. スライドを100%イソプロパノールに15秒間移す。新鮮な100%イソプロパノールと交換し、スライドをイソプロパノールの中に15秒間戻します。これを繰り返します。全部で6回のイソプロパノール洗浄を行う。
      注意:イソプロパノールは眼や呼吸器の刺激物です。常に適切な保護具を着用し、飛沫を避けるようにしてください。また、可燃性が高く、適切に保管して取り扱う必要があります。
      注:試薬を節約するために、最初の(最も淡い)イソプロパノール洗浄液のみを捨ててください。他の5つの洗浄液を1から5までのボトルに入れ、次の染色に再利用してください。洗浄を再使用するときは、「1」番のボトルから始めて、使用後に廃棄してください。 "2"を使用したら、ボトル "1"に注ぎます。最後の洗浄は常に新鮮なイソプロパノールでなければなりません。
    9. スライドを100%キシレンに3分間入れる。一度に1つのスライドを取り外し、カバースリップを置きます。
      1. セクションをカバーするのに十分なマウント媒体を加え、100%キシレンに浸す。
        注:この手順は、マウントメディアの表面を滑らかにし、気泡を取り除きます。
      2. カバースリップを塗るスライドの底に。
        注:マウントメディアはスライドを所定の位置に引っ張ります。カバースリップがまっすぐでない、または完全に装着されていない場合は、静かに所定の位置にタップします。
      3. 細い線が見えるまでペーパータオル上の余分なマウント媒体を汚す。ティッシュワイプをキシレンに浸し、スライドの裏面を拭いて、滴り落ちた媒体を取り除きます。段ボールのような丈夫であるが可動性のある面にスライドを平らに置く。残りのすべてのスライドを同じ方法でカバーします。フード内でキシレンを10分間蒸発させる。
        注:キシレンで汚染された物質は、蒸気が漏れるのを防ぐために、フード内の密閉容器内で除去して廃棄しなければなりません。
    10. RT O / Nで固化させてください。

    6.ステンドグラスのイメージングと保存

    1. コンパウンド倒立顕微鏡18の画像セクション。
      注:スライドは部屋teに保管することができます無期限に

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Representative Results

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10%緩衝ホルマリンおよび4%パラホルムアルデヒド(PFA)は、組織学的プラクティスに使用される最も一般的な固定剤の2つである。しかし、ゼブラフィッシュの肝臓組織の最適な固定結果は得られません( 図1および表1 )。 10%ホルマリンまたは4%PFAによる固定は、しばしば収縮をもたらし、肝臓と周囲組織との間に大きなギャップを生じさせる( 図1AB ; 図1Bは組織収縮の例を提供する)。肝組織の一部もまた切片から脱落することがある。肝細胞の細胞質はしばしば失われる( 図1A1B )。両方の固定剤は、それらが収縮または膨潤し、もはや上皮細胞に特徴的な円柱形態を維持しないので、肝細胞の変形を引き起こし得る。 PFAの固定に関するもう1つの問題は、実際には存在しない肝細胞間には空間があり、組織が骨折しているように見える( 図1B )。さらに、これらの2つの固定剤のいずれかを使用すると、肝細胞はヘマトキシリンで良好に染色されるが、エオシンではほとんど染色されない( 図1A )。酸ベースのDietrichの固定剤は、ホルマリンとPFA固定剤の問題を克服しています( 図1C )。

ヒトALDでは、小滴および大滴の脂肪からなる脂肪症が中心静脈の近くで最も顕著であり、重症度22の増加とともに門脈の三枝に向かって外側に伸びる。ゼブラフィッシュでは、96-120hpfの2%エタノールで処理すると、肝脂肪症が誘発され、これは肝細胞中に丸い液滴が過剰に沈着することによって示唆される( 図2B 、矢印)。しかし、液滴は出現しないヒトALDに見られるのと同様の分布パターンであり、ゼブラフィッシュ肝臓23における門脈および中央静脈の明確な区別がないためである。エタノール処理した幼生肝臓の肝臓の血管は、対照の肝臓の肝臓に比べて膨潤している( 図2B 、星印)。

図1
図1 120hpfで異なるフィラメントで固定されたゼブラフィッシュ幼虫の肝臓におけるH&E染色の比較。A )RT O / Nでの10%ホルマリン; ( B )4%CO / Nで4%PFA; ( C )室温で24時間、Dietrich固定液。 10%ホルマリンでは、肝細胞はしばしば細胞質(A)を失う。組織はエオシンで適切に染色されず、紫色に見える。フィクラ後4%PFAを用いた場合、肝細胞間にギャップが見られる(B)。 4%PFAは肝臓組織を収縮させるので、肝臓と周囲組織との間に大きな隙間があるように見える。 Bの点線は、周囲の組織の境界を示す。 Dietrichの固定剤は、3つの中で最適な結果を提供します(C)。スケールバー=20μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2急性エタノール治療は、ゼブラフィッシュの幼虫の肝臓における肝臓の角化症および血管の腫脹を引き起こす。A )対照、未処理、WT幼虫における肝臓のH&E染色。 ( B )2%エタで処置したワイル型幼虫における肝臓のH&E染色nolは96~120hpfである。両方の動物を120 hpfでDietrich固定液で固定した。 (B)の矢印は、丸い液滴の過剰沈着を伴う肝細胞を指す。アスタリスクは、腫れた肝臓の血管に印を付ける。スケールバー=20μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

10%ホルマリン 4%PFA Dietrichの固定剤
定着条件 RTで少なくとも24時間 RTで3時間、または4℃でO / N RTで少なくとも24時間
サンプル保存後の固定無期限にRT 4℃で2週間まで RTで2ヶ月まで
CompatibゲノムDNA抽出による能力はいはいいいえ
収縮はいはい最小
細胞の歪みはいはい最小
携帯電話の詳細の損失はい適度最小
バランスのとれたH&E染色弱いエオシン染色弱いエオシン染色はい
免疫組織化学との適合性はいはいはい

表1: 10%ホルマリン、4%PFA、およびジベレフ肝臓組織学に対するDietrich固定剤の比較。

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Discussion

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現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH&E染色によるその後の組織病理学的分析の詳細な手順を記載している。急性エタノール処理は、ゼブラフィッシュ肝臓がアルコール代謝酵素を発現し始める段階であるため、受精後96時間以内に行わなければならない。 2%エタノールは、幼虫が13,14を許容できる最大用量である。エタノール処理された幼虫は、8時間の処理によって肝脂肪症を示し始め、脂肪症を発症する幼虫の割合は、24時間の連続治療14まで上昇し続ける14 。ゼブラフィッシュの幼虫は、120 hpfまで卵黄のみから栄養素を吸収します。したがって、120 hpfを超えるエタノール処理は推奨されていません。なぜなら、断食は脂肪症14にも寄与することができるからです。他のラボで公開されたプロトコルと比較現在の議定書で主に行われた変更は、エタノール処理が14時間の光/ 10時間の暗サイクルを有する魚施設で行われることである。これは、インキュベーター中で暗所で処置を行った場合に見られるものよりも、より一貫した強力な脂肪族反応を生じる。これは、ゼブラフィッシュ肝臓の脂質代謝遺伝子が、明/暗サイクル25に応答して毎日のリズム発現を示すという事実に関連している可能性がある25

ALDは慢性疾患であり、何年ものアルコール乱用があります。現在のエタノール処理プロトコールの重要な制限は、それが肝臓へのアルコールの急性効果を誘発するだけであるということである。このような高いエタノール濃度で48時間以上処理すると、死亡率が高くなり、慢性肝障害の研究が妨げられます。最近の研究では、成人ゼブラフィッシュを1%エタノールで3回まで連続処理した脂肪症、脂肪性肝炎、および線維化を引き起こした12 。将来有望な方向の1つは、急性エタノール治療プロトコールを用いて潜在的なALDモジュレーターを同定し、次に慢性損傷モデルにおけるその効果を検証することである。

急性エタノール処理によって誘導される肝細胞障害を評価するためにH&E染色を行う。ゼブラフィッシュにおける蛍光イメージングの容易さのために、H&E染色は、ゼブラフィッシュの肝臓組織学において日常的に使用されておらず、その手順はそれほど十分に記載されていない。現在のプロトコールは、幼虫肝臓におけるH&E染色の段階的記述を提供する。正しい固定剤を選択することは、H&E染色のための最初の最も重要なステップです。組織ホルモンには10%の緩衝ホルマリンと4%のPFAが一般的に使用されますが、それらは両方とも組織の収縮を引き起こし、肝臓の部分は切片から脱落する。 10%ホルマリン固定は、肝臓の細胞質の損失をもたらすocytes。 4%PFA固定は、肝細胞間の人為的なギャップを生じる。エオシン染色は、いずれかの固定剤で固定された肝臓におけるヘマトキシリン染色よりもはるかに弱いようである。酸ベースのDietrich固定剤は、ゼブラフィッシュ肝臓のH&E染色に適しています。細胞の細部を保存し、収縮を最小限に抑えるからです。また、肝臓などの脂肪組織にホルマリンやPFAよりも速く浸透しているようです。ヘマトキシリンとエオシンによる染色は、よりバランスがとれています。 Dietrichの固定剤の1つの警告は、それがゲノムDNA抽出に適合しないことである。試行実験では、10%ホルマリン、4%PFAまたはDietrich固定液26を用いて固定した幼虫からゲノムDNAを抽出した。幼虫を50μLの50mM NaOH中、95℃で20分間インキュベートし、次いで4℃に冷却した。次いで、1M Tris-HCl(pH8.0)5μLを添加して、塩基性溶液を中和した。簡単な遠心分離の後、上清wPCRで使用される。同じPCRプライマーおよびPCRプログラムを用いて、ホルマリンおよびPFA固定幼虫の両方からのゲノムDNAは予測サイズのPCR産物を生じたが、Dietrich固定固定幼虫のゲノムDNAはPCR産物を産生しなかった。

パラフィン切片および凍結切片の両方でH&E染色を行うことができる。しかし、パラフィン切片は、凍結切片よりも以下の利点があります。1)パラフィン切片は室温で無期限に保存できますが、凍結切片は-80°Cで1年まで保存できます。 2)凍結切片の場合、細胞内の氷結晶の形成は、細胞の形態学および細胞内の詳細を混乱させる可能性がある。さらに、凍結切片は、しばしば、パラフィン切片よりも厚い。これは、パラフィン切片から産生される組織形態と比較して組織形態の画像が貧弱になる可能性がある。

肝臓組織のパラフィンブロックを調製する場合、現在のプロトコール幼虫をアガロースに包埋する。幼虫は、体の左側が下向きになり、型の底に平らに横たわって横方向に配置される。これにより、肝臓の方向を確実に一致させることができ、セクションを連続して切断すると、肝臓の等価な領域を魚と魚27と比較することができます27 。成功したH&E染色を保証するもう1つの重要なステップは、発色です。所望の色強度に達するまで頻繁に染色をチェックすることが重要である。

H&E染色は、肝臓損傷の予備的評価を得るために使用されるべきである。エタノール処理された幼虫は、肝細胞における丸い液滴の過剰な​​沈着を示し、脂肪症を示唆する13,14,18。これらの液滴が実際に脂質であることを確認するためには、オイルレッドOおよびナイルレッドなどの脂質染料で標識することが必要である。肝臓の血管治療された動物のelsは膨張して腫れて見える。正弦波の超微細構造変化を調べるために、走査型電子顕微鏡法と透過型電子顕微鏡法を実施すべきである。以前に、細胞外マトリックスタンパク質沈着は、免疫蛍光18によって検出されたように、エタノール処理されたゼブラフィッシュ肝臓において増加することが報告されている18 。しかし、フィブリノゲン遺伝子の発現レベルが処理された魚18において穏やかに増加するだけであるので、H&Eは、このような少量の細胞外マトリックスタンパク質を検出するほどには敏感でないかもしれない。慢性的に損傷した成体ゼブラフィッシュ肝でも同じ固定液法および染色法を試験し、線維症の検出には十分であった(陰、未発表データ)。

現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫における肝臓組織学の検査に合わせて調整されていますが、ゼブラフィッシュの研究コミュニティには、サムeプロトコールは、他の組織および成体ゼブラフィッシュに適用することができる。

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Disclosures

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

Acknowledgments

著者はZebrafish International Resource CenterのKaty Murray博士に感謝したいと思います。 CCHMCのStacey Huppert博士とKari Huppert博士は、プロトコルに関する有益な助言を得た。魚のケアのためのCCHMC獣医サービス。この研究はNIH助成金R00AA020514とCCHMCの小児ゲノミクスセンター(CY)の研究助成金によって支えられました。また、シンシナティの消化器疾患研究コアセンターのNIH助成金P30 DK078392(統合形態学コア)も一部支持した。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

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ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析
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Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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