Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

Dit protocol beschrijft histologische analyses van de levers van zebravislarven die 24 uur met 2% ethanol zijn behandeld. Een dergelijke acute ethanolbehandeling resulteert in hepatische steatosis en zwelling van de hepatische vasculatuur.

Abstract

Alcoholische Leverziekte (ALD) verwijst naar schade aan de lever door acute of chronische alcoholmisbruik. Het is een van de belangrijkste oorzaken van alcoholgerelateerde morbiditeit en sterfte en treft meer dan 2 miljoen mensen in de Verenigde Staten. Een beter begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen die aan alcoholgeïnduceerde leverschade liggen, is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van een effectieve behandeling voor ALD. Zebravislarven vertoonden hepatische steatosis en fibrogenese na 24 uur blootstelling aan 2% ethanol, waardoor ze nuttig zijn voor de studie van acute alcoholische leverletsel. Dit werk beschrijft de procedure voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en laat zien dat het leverkleuren en zwelling van de bloedvaten veroorzaakt. Een gedetailleerd protocol voor hematoxyline en Eosin (H & E) kleuring die is geoptimaliseerd voor de histologische analyse van de zebravis larve lever, wordt ook beschreven. H & E-kleuring heeft verschillende unieke voordelen ten opzichte van immunofluorescentie, aangezien het alle levens versterktCellen en extracellulaire componenten tegelijkertijd en kunnen gemakkelijk leverschade detecteren, zoals steatosis en fibrose. Gezien het toenemende gebruik van zebravis in modellerende toxine en door virus geïnduceerde leverletsel, evenals overgeërfde leverziekten, dient dit protocol als referentie voor de histologische analyses die in al deze studies zijn uitgevoerd.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alcoholische leverziekte (ALD), die wordt veroorzaakt door overconsumptie van alcohol, is een belangrijke oorzaak van alcoholgerelateerde morbiditeit en sterfte. In de Verenigde Staten betreffen bijna de helft van de leverziekte de alcohol 1 , en ALD is verantwoordelijk voor bijna 1 op 3 levertransplantaties 2 . ALD heeft een breed spectrum. Steatose, die wordt gekenmerkt door overmatige lipide accumulatie in hepatocyten, komt voor in het vroege stadium van zwaar drinken en is omkeerbaar bij stopzetting van alcoholgebruik. Onder invloed van genetische en omgevingsfactoren en voortdurende alcoholinname kan hepatische steatosis zich verder ontwikkelen tot alcoholische hepatitis en uiteindelijk cirrose 3 . Studies met behulp van ALD-modellen van knaagdieren hebben een aanzienlijke inzichten gegeven in de ziekte, maar ze hebben beperkingen (beoordeeld in referentie 3 ). Mondelinge voeding van een alcohol dieet veroorzaakt alleen steatosis bij knaagdieren 4 , </ Sup> 5 . Ontwikkeling van ontsteking en fibrose vereist een tweede belediging 6 , 7 of chronische intragastrische infusie, die invasieve en technisch uitdagend is 8 , 9 . De teleostzebravis ontwikkelt ook leverschade als reactie op zowel chronische als acute alcoholbehandeling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . In het bijzonder vertegenwoordigt de larvezebravis een aantrekkelijk complementair modelorganisme waarin acute alcoholische leverletsel 10 , 11 , 13 , 15 wordt bestudeerd. De zebravis lever is functioneel en produceert belangrijke enzymen voor ethanol metabolisme met 4 dagenPost-fertilisatie (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan direct aan het water toegevoegd worden, en blootstelling aan 2% ethanol gedurende 24 uur is voldoende om hepatische steatosis en fibrogenische reacties in zebravis larven 13 , 15 te induceren.

Er is gemeld dat behandeling met 2% ethanol gedurende 24 uur resulteerde in een weefselethanolconcentratie van 80 mM in zebravis larven 13 . Anderen hebben aangetoond dat larven deze concentratie tolereren en de leverfenotypen die in de behandelde dieren zijn gezien, zijn specifiek voor de blootstelling aan ethanol 11 , 13 , 15 , 18 van ethanol. Echter, omdat 80 mM bijna dodelijk is bij mensen 19 , is het belangrijk om de leverhistologie van de met ethanol behandelde zebravis en dete te evalueren.De fysiologische relevantie voor de mens.

De snelle externe ontwikkeling en translucentie van zebravis larven maken het mogelijk om de werking van alcohol in de lever in real-time en in vaste monsters te karakteriseren. De beschikbaarheid van celltypespecifieke fluorescerende transgene lijnen en de recente vooruitgang in confocale microscopie vergemakkelijken de studie van hoe verschillende levercel-typen hun morfologie en gedrag veranderen in reactie op acute ethanolbehandeling 11 , 15 . Het confocale beeldvorming van de fluorescerende transgene zebravis kan echter niet volledig vervangen worden door hematoxyline en Eosin (H & E) kleuring bij het bestuderen van leverhistologie. Als u alle levercel types tegelijkertijd gebruikt met behulp van transgene zebravis, hoeft u alleen transgenische lijnen te genereren, die elk een leverceltype met een unieke fluorofoor labelen. Het introduceren van verschillende transgene achtergronden in dezelfde vis vereist rasG meerdere generaties, wat tijdrovend en kostbaar is. Extra immunofluorescentie kleuring is nodig om extracellulaire matrix componenten te detecteren. H & E-kleuring etikettert tegelijkertijd alle levercel-typen en extracellulaire matrixcomponenten, waardoor een overzicht van de lever 20 wordt gegeven . Bovendien onthult het verscheidene histopathologische kenmerken van leverziekten, zoals hepatocytestoornissen, steatosis en fibrose. Hoewel H & E een routinevlek is in zoogdierleverhistologie, wordt het niet vaak gebruikt bij leveronderzoek op zebravisvissen, en het protocol is minder goed gevestigd.

Dit werk beschrijft een protocol voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en voor de follow-up histologische analyses met H & E-kleuring. Het H & E-kleurprotocol kan in alle studies van leverontwikkeling en -functie worden gebruikt. Bovendien kunnen de paraffine secties worden gebruikt voor immunohistochemie, evenals voor andere speciale staIns in leverpatologie, inclusief de trichroomvlek, reticuline vlek, enz .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AB WT volwassen en larve zebravis werden onder standaardomstandigheden 21 gehandhaafd overeenkomstig de Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren (National Institutes of Health publicatie 86-23, herzien 1985); Hun gebruik werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee in Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC).

1. Bereiding van oplossingen

  1. Bereid ei water.
    1. Bereid de voorraadzoutoplossing op door 40 g commercieel zeezout in 1 liter dubbel gedestilleerd water (ddH 2 O) op te lossen. Roer tot alle zouten volledig zijn opgelost.
    2. Bereid 0,1% methyleenblauwoplossing door 0,1 g poeder toe te voegen aan 100 ml ddH20.
      VOORZICHTIG: Methylenblauw is irriterend als het in contact komt met de ogen of de huid. Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen bij het hanteren van het poeder.
    3. Combineer 28.125 ml voorraad zout zoOplossing en 7 ml methyleenblauwoplossing in een 50 ml conische buis. Goed mengen. Voeg dit mengsel toe aan 15 L ddH 2 O. Schud grondig en bewaar bij RT.
  2. Bereid 100 ml 1 M Tris-HCl door 12,1 g Tris poeder toe te voegen aan 100 ml ddH20. Pas de pH aan op 9,0 met behulp van zoutzuur (HCl).
    VOORZICHTIG: HCl kan ernstige irritaties veroorzaken bij irritatie van de mond en slijmvliezen bij inademing. Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen en houd de voorraadfles in een chemische kap.
  3. Bereid 0,4% tricaïne (ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat) oplossing op.
    1. Oplossen 2 g tricinepoeder in 489,5 ml ddH20. Voeg 10,5 ml van de Tris-HCl, pH 9 oplossing toe. Meng met een roerbar totdat het poeder opgelost is. Pas op op pH 7,0.
      VOORZICHTIG: Tricainpoeder kan een ademhalingsirriterend zijn. Draag altijd een stofmasker bij het hanteren van het poeder.
    2. Aliquot 45 ml van de tricaïneoplossing in 50 ml conische buizen. Houd de solutioN bij 4 ° C voor direct gebruik en bij -20 ° C voor langdurige opslag.
  4. Bereid Dietrich's fixatief door 30 ml 95% ethanol, 10 ml 37% formaldehyde, 2 ml ijsazijn en 58 ml ddH20 in een glasmediumfles te combineren. Meng goed door te wervelen en op te slaan bij RT.
    VOORZICHTIG: Formaldehyde is een vermoedelijk kankerverwekkend middel, en elke oplossing met formaldehyde moet in een chemische kap worden gebruikt. Ijsazijn kan ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen en houd de voorraadoplossing in een chemische kap. Formaldehyde, ijsazijn en 95% ethanol zijn alle brandbare vloeistoffen en moeten worden opgeslagen in een aangewezen brandbare kast.
    OPMERKING: Dietrich's fixatief is 1 jaar stabiel bij RT.
  5. Bereid 1 liter 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op door 80 g natriumchloride (NaCl), 2 g kaliumchloride (KCl), 14,4 g dinatriumfosfaat (Na 2 HPO 4 ) en 2 toe te voegen.4 g monokaliumfosfaat (KH 2 PO 4 ) tot 800 ml ddH 2 O. Pas bij pH 7,4 aan met natriumhydroxide (NaOH) en voeg ddH20 toe aan een 1 liter eindvolume. Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur na autoclaven op een vloeibare cyclus die gedurende 1 minuut reinigt en incubates bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
  6. Maak 1 liter 1x PBS door 100 ml van de 10x PBS-oplossing in 900 ml ddH 2 O te verdunnen. Meng goed door te schudden en op te slaan na autoclaving bij RT.
  7. Bereid 3% agarose in een glasmedia fles voor embryo montage.
    1. Voeg 3 g agarose toe aan 100 ml ddH20 en meng door werveling. Verhit het mengsel door te micreren om de agarose op te lossen en zorgvuldig te kijken tijdens het verwarmen om ervoor te zorgen dat er minimaal kookt.
      VOORZICHTIG: De fles zal waarschijnlijk warm zijn wanneer u uit de magnetron verwijderd bent, ondanks korte verwarming. Gebruik een beschermende handschoen of mitt om de fles uit de magnetron te verwijderen.
    2. Verwijder de fles uit de magnetron.Terwijl u voorzichtig wervelt, kijk naar kristallen die niet helemaal opgelost zijn; Als er geen kristallen zijn, is de oplossing klaar voor gebruik. Bewaar de 3% agarose bij RT en verhit opnieuw voor gebruik.
  8. Filter Harris hematoxyline voorraadoplossing om eventuele vaste stoffen die neergeslagen zijn te verwijderen.
    1. Vouw een koffiefilter in de helft zodat het filter een kegel vormt. Open het zijpaneel zodat de vloeistof door het filter loopt, zodat eventuele rommel wordt gevangen.
    2. Plaats het filter in een trechter en de trechter in een glazen mediafles. Giet de voorraad hematoxyline geleidelijk door het filter.
      VOORZICHTIG: Hematoxyline is gevaarlijk bij oogcontact, inname en inademing. Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen en houd de voorraadoplossing in een chemische kap.
  9. Bereid 0,05% HC1 door 125 μl 12 N HC1 toe te voegen aan 250 ml ddH20.
  10. Bereid eosine Y-phloxine B oplossing mengsel door 25 ml 1% e te combinerenOsin Y (aq), 2,5 ml 1% phloxine B (aq), 195 ml 95% ethanol en 1 ml ijsazijn in een glazen fles. Meng goed door te wervelen en op te slaan bij RT
    VOORZICHTIG: Eosin Y is gevaarlijk bij oogcontact, inname en inademing. Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen en houd de voorraadoplossing in een chemische kap.
  11. Bereid 2% ethanol door 2 ml zuivere ethylalcohol aan 98 ml ei water toe te voegen.
    VOORZICHTIG: Ethyl alcohol is een oogirriterend middel. Draag altijd geschikte beschermende uitrusting bij het hanteren van ethylalcohol. Het is ook ontvlambaar en moet dienovereenkomstig worden behandeld en opgeslagen.
    OPMERKING: Bereid vers 2% ethanol elke keer voor het uitvoeren van de acute ethanolbehandeling.

2. Doe acute ethanolbehandeling in zebravislarven

  1. Om embryo's te genereren, stelt u kruisen vast met één wildtype mannelijke en één WT vrouwelijke vis per paringstank. Scheid ze door een plastic verdeler in de parkeerbak te plaatsen.
    OPMERKING: StelUp kruisen na de laatste voeding van de dag, zodat de vis goed gevoed zijn.
    1. Om 8.00 uur de volgende morgen trekken u de verdeler om het paar te laten meedenken.
    2. Ga na 1 uur de volwassen vis terug naar hun oorspronkelijke tank. Verzamel de embryo's door het water met de embryo's in een zeef te gieten. Draai de filter in een 100 mm Petri-schotel en wrijf de embryo's in de schotel met een wasbottel met ei water. Leg de schotel met de embryo's in een incubator bij 28 ° C.
    3. Wanneer embryo's tenminste het 4-cel stadium (1 pk) bereiken, verwijder alle onbevruchte embryo's en puin in het water met een Pasteur pipette en plaats de schotel met de bevruchte embryo's in een incubator bij 28 ° C. Bewaar de embryo's in de incubator bij 28 ° C tot 96 uur na bevruchting.
    4. Verdoof de larvalvissen door de tricineoplossing toe te voegen aan eiwit bij een 1-10 (volume / volume) verhouding.
    5. Selecteer tot veertig 96 pk larven die een opgeblazen zwem blaas gebruikenEen Pasteur pipet en verdeel ze gelijkmatig in twee nieuwe petrischalen.
    6. Verwijder zoveel mogelijk resterend ei-water. Voeg bij een dichtheid van één larve per ml het eiwit toe dat 2% ethanol bevat aan één schotel. Voeg dezelfde hoeveelheid ei water toe aan de andere schotel om als controle te dienen.
    7. Houd de controle- en ethanolbehandelde larven in de viskamer gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Het uitvoeren van ethanolbehandeling in een viskamer met een 14 uur lange / 10 uur donkere cyclus resulteert in meer consistente en robuuste leverletsel dan het experiment in het donker in een incubator uitvoert.
    8. Verzamel de larven in een 1,5 ml centrifugebuis met maximaal 20 larven per buis.
    9. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit de larven en voeg tenminste 1 ml (10x weefsel volume) Dietrich's fixatie in de chemische kap toe. Laat de vis gedurende minstens 24 uur op kamertemperatuur op een nutator vastzetten.
      OPMERKING: Vissen zijn enkele weken stabiel in Dietrich's fixative.
<P class = "jove_title"> 3. Voorbereiding van weefselcassettes en verwerking

  1. Stel het benodigde aantal weefselcassettes en twee blauwe biopsieblokken per cassette vast. Plaats een biopsy pad onderaan elke cassette. Merk elke cassette met een potlood, waarbij de steekproef duidelijk wordt geïdentificeerd.
    OPMERKING: Gebruik geen pen of markering om de cassettes te etiketteren, omdat de etikettering in latere stappen verloren gaan.
  2. Leg de larven in 3% agarose in om de consistente oriëntatie van alle monsters te waarborgen.
    1. Verwijder de fixatie van de buizen in een chemische kap en wasser de larven 3 keer gedurende 5 minuten elk met 1 ml 1x PBS. Plaats de buizen op een nutator bij de RT tijdens de was.
    2. Verwarm de bereide 3% agarose in water onder gebruik van een magnetron om de vaste stof te smelten. Verhit 30 s tegelijkertijd en let op om het koken zo klein mogelijk te houden. Houd de vloeibare agarose op een warme plaat op 90 ° C met zacht roeren.
    3. Met een transferpipette, overdracht tot 8 lErf tot een plastic histologie schimmel en verwijder zoveel mogelijk PBS. Vul de vorm met 3% agarose volledig in met behulp van een transferpipet met het afsnijden van de tip.
    4. Verzamel de larven in het midden van de schimmel met een insulenspuit en druk ze naar de bodem. Voor sagittale secties, plaats de larven in een lijn, met de koppen naar de top van de mal. Om ervoor te zorgen dat de levers op een consistente manier worden georiënteerd, draai de larven zodat de linkerkant van het lichaam naar beneden en plat tegen de bodem van de mal staat.
      OPMERKING: Omdat de lever aan de linkerkant van het lichaam ligt, minimaliseert deze positionering het aantal secties dat moet worden gesneden voordat de lever bereikt wordt. Houd de larven zo dicht bij elkaar mogelijk.
    5. Zet de vorm voor 4-5 minuten aan de zijkant om de agarose volledig in te stellen. Verwijder het agarose blok uit de vorm en gebruik een scheermesje om de agarose rond de larven te bekleden. Sta het blok op het einde en snijd de dikte in de halve sO dat het eindblok ongeveer 2-3 mm dik is
    6. Breng het kleine agarose blok naar de voorbereide weefselcassette (stap 3.1) en plaats het tweede biopsieblok bovenop het blok. Sluit de cassette en plaats de volledig gemonteerde cassette in een afdichtbare container met vers bereid 70% ethanol in ddH2O.
      OPMERKING: Als de cassettes niet onmiddellijk worden verwerkt, plaats ze in 70% ethanol in een container bij 4 ° C om verlies van fixatie te vermijden. Cassettes zijn stabiel bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen.
  3. Weefselverwerking
    OPMERKING: Monsters kunnen worden ingediend bij een histologie of pathologie laboratorium uitgerust met een weefselprocessor voor het verwerken van de cassettes in paraffine. Vraag een standaard O / N-verwerkingsprogramma in plaats van een kort programma, zodat de paraffine de agarose volledig kan binnendringen.
    1. Verwerk de weefselcassettes door ze door een verdunningsreeks ethanol, met een toenemende hoeveelheid alcohol, over te brengen aanHet weefsel uitdrogen, als volgt: 70% ethanol 2 keer, 45 minuten elk; 80% ethanol, 45 minuten; 95% ethanol, 2 keer, 45 minuten elk; 100% ethanol, 2 keer, 45 minuten elk.
    2. Vervang de alcohol met een oplosmiddel (100% xyleen, 2 keer, 45 minuten elk), zodat de paraffine het weefsel infiltreert.
      VOORZICHTIG: Xylene is irritant en is schadelijk bij inademing. Zorg ervoor dat u altijd een chemische afzuigkap gebruikt. Xylene is brandbaar en moet dienovereenkomstig worden opgeslagen.
    3. Incubeer de cassettes in paraffine O / N in een incubator bij 60-65 ° C. Houd de cassettes warm totdat ze ingebed zijn.
  4. Breng de verwerkte agarose blokken in paraffine in.
    1. Verwijder één cassette uit de opwarmerlade van de embedding machine en verwijder de deksel van de cassette en de bovenste biopsieblok uit de cassette. Vul een histologievorm met vloeibare paraffine en houd het op de warme plaat op de embedding machine.
    2. Haal de agarose blok uit de cassette met behulp van warme tangE en overbrengen naar de histologie schimmel met paraffine. Zorg ervoor dat de kant van het agarose blok met de vis die het dichtst bij het oppervlak ligt, naar beneden gericht is. Gooi de bodembiopsieblok weg en verplaats de gehele histologievorm naar de koele plaat op de embedding machine.
    3. Met behulp van tang leggen het agarose blok snel in het midden van de vorm; Plaats het blok onderaan de vorm. Zodra het blok goed geplaatst is, zet de bodem van de cassette bovenop de histologievorm en vul hem halfweg met vloeibare paraffine. Plaats de mal direct op de 4 ° C-plaat en laat de blokken gedurende ten minste 10-15 minuten niet storen om de paraffine te laten stollen. Terwijl het eerste blok opzet, herhaal dit proces voor de resterende blokken.
    4. Zodra de paraffine voor alle blokken is ingesteld, verwijder u de histologievorm uit het paraffineblok door het voorzichtig op de mal te drukken om het los te maken. Deze paraffineblokken kunnen onbeperkt bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
  5. 4. Sectie van paraffineblokken

    1. De dag voor het doorsnijden, in het paraffineblok met een microtoom om het overmaat van paraffine die het weefsel bedekt, te verwijderen. Sectie 5 μm per keer totdat het weefsel op het oppervlak van het paraffineblok wordt blootgesteld. Stop en verwijder alle gesneden secties. Week de blokken naar beneden met 1x PBS naar 4 ° C / N.
      OPMERKING: De blokken moeten minstens 8 uur doordrenkt worden. Begin het weken aan het einde van de dag. Als de blokken te lang in 1x PBS achterblijven, kan het weefsel zwellen en vervormd worden.
    2. Verwijder een blok tegelijk van de 1x PBS en snijd 5 μm secties met behulp van een microtome. Scheep het lint van secties van het mes door de laatste sectie voorzichtig van het mes te trekken met behulp van tang of borstel. Pak het lint door het laatste gedeelte met behulp van de tang en breng deze naar een waterbad bij 42 ° C. Laat de linten gedurende minstens 5 minuten op het oppervlak van het water drijven.
      OPMERKING: WijVerplaats de secties, laat de tang niet aan het water raken, terwijl het nog steeds in contact is met de paraffine. Anders zal de paraffine smelten en de scheiding heel moeilijk maken. Indien nodig, verdeel de afdelingen in kleinere groepen met behulp van schone tang zodat ze gemakkelijk op de glijbanen passen. Raak de naad voorzichtig aan tussen secties om scheiding zonder schade te scheppen.
    3. Zet een geladen glijbaan in een hoek van 45 graden in het water en plaats deze zorgvuldig onder de groep die u wilt verzamelen. Haal de glijbaan voorzichtig uit het water en laat de secties aan de glijbaan bevestigen.
    4. Spoel enig overtollig water uit de secties met lintvrij weefsel. Plaats de glijbaan in een glijhouder of een doos. Ga door naar het blok totdat het gewenste weefsel is verzameld. Herhaal het snijproces voor alle blokken.
    5. Bak de glijbanen in een 55 ° C incubator of oven gedurende 3-16 uur om de paraffine te smelten. Verwijder de glijbanen uit de oven en laat ze tOkoel voordat u het vlek begint.
      OPMERKING: Paraffinsecties kunnen voor onbepaalde tijd bij RT worden opgeslagen, zowel voor als na het bakken.

    5. Hematoxyline en Eosinverf van Paraffineafdelingen

    1. Deparaffinize de dia's door ze gedurende 15 minuten in 100% xyleen te dompelen; Vervang het tot nog eens 15 minuten in verse 100% xyleen.
    2. Rehydrateer de glijbanen door ze door de volgende serie gegradeerde ethanol te laten dompelen totdat de vloeistof schoon uit de glijbanen loopt. Voor elke oplossing, doei 8-10 keer, 2 s per dip: 100% ethanol, 100% ethanol, 95% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, 30% ethanol en gedeïoniseerd water.
      OPMERKING: Het protocol kan hier gestopt worden, en de dia's kunnen gedurende enkele uren bij het RT in water worden gelaten. Indien nodig kunnen de glijbanen bij 4 ° C in water O / N worden opgeslagen.
    3. Plaats de glijbanen in 100% gefilterde Harris hematoxyline gedurende 4 minuten. Breng ze onmiddellijk terug naar de container met gedeïoniseerd water. Breng gedeioniseerd water in tHij steekt de hoek van de container achter de secties terug. Leeg de container periodiek totdat het water niet meer paars is.
      OPMERKING: Laat het water niet rechtstreeks op de glijbanen rennen, aangezien de secties van de glijbanen kunnen komen.
    4. Controleer snel de hematoxyline intensiteit op een dissecterende microscoop met behulp van gooseneck lichten; Laat de dia's niet drogen. Als de vlek de gewenste intensiteit heeft bereikt, gaat u verder met de volgende stap. Als de kleur niet donker genoeg is, plaats de dia's in 100% hematoxyline gedurende 1 minuut en herhaal het water voordat u opnieuw controleert.
      OPMERKING: De hematoxyline moet donker genoeg zijn zodat de kleur niet verloren gaat tijdens de eosinkleuring. Echter, als hematoxylinkleuring wordt gezien in het cytoplasma, worden de secties overschreden.
    5. Dip de dia's tweemaal in 0,05% HCl en breng ze onmiddellijk terug naar de container met schoon gedeïoniseerd water. Maak het water leeg en doe de container twee keer met water.
    6. Plaats de dia's over op 95% etHanol gedurende 30 s en overdragen ze vervolgens gedurende 30 s naar een nieuwe container met 95% ethanol.
    7. Plaats de glijbanen in de eosin Y-phloxine B oplossing gedurende 2 minuten. Breng de glijbanen terug naar de vorige 95% ethanolcontainer en controleer snel de intensiteit van de kleur onder de dissectiemicroscoop. Als de kleuring voldoende is, ga verder naar de volgende stap. Zo niet, ga terug naar de eosinoplossing gedurende 30 s, controleer opnieuw en herhaal eventueel.
      OPMERKING: Voldoende eosinkleuring is lichtroze en verschijnt in verschillend contrast met de hematoxylinvlek. Zorg ervoor dat u een oplossing uit de achterkant van de dia's wist wanneer u onder de microscoop controleert, zodat er geen valse kleur wordt waargenomen. Omdat eosin bestaat uit 95% ethanol, kan langdurige tijd in 95% ethanol, terwijl de kleurintensiteit wordt gecontroleerd, een deel van de kleur lekken.
    8. Breng de glijbanen gedurende 15 s aan 100% isopropanol over. Vervang met verse 100% isopropanol en plaats de slides terug in de isopropanol gedurende nog eens 15 s. Herhaal dit pRoces voor in totaal 6 isopropanol wassen.
      VOORZICHTIG: Isopropanol is een oog- en ademhalingsirriterend middel. Zorg altijd voor voldoende beschermende uitrusting en voorkom spatten. Het is ook zeer ontvlambaar en moet dienovereenkomstig worden opgeslagen en behandeld.
      OPMERKING: Om de reagentia op te slaan, verwijder alleen de eerste (pinkste) isopropanolwas. Houd de andere vijf wasoplossingen in flessen genummerd 1 tot en met 5, om opnieuw te worden gebruikt voor de volgende kleuring. Begin bij het hergebruiken met de fles genummerd "1" en verwijder na gebruik. Zodra de was "2" is gebruikt, gooi het in de fles "1" en ga zo maar door. De laatste was moet altijd fris isopropanol zijn.
    9. Plaats de dia's gedurende 100 minuten in 100% xylenen. Verwijder een dia tegelijkertijd en plaats een deksel.
      1. Voeg voldoende montagemedium toe om de afdelingen te bedekken en doe ze in 100% xyleen.
        OPMERKING: Deze stap zal het oppervlak van het montagemedium glad maken en eventuele bellen verwijderen.
      2. Breng een deklap aanNaar de bodem van de dia.
        OPMERKING: Het montagemedium moet de dia in de positie trekken. Als de deksel niet recht of helemaal zit, moet u het voorzichtig op zijn plaats drukken.
      3. Zet enig overmatig montagemedium op een papieren handdoek tot alleen een dunne lijn wordt gezien. Doe een weefsel af in de xyleen en veeg de achterkant van de glijbaan om elk gedroogd medium te verwijderen. Plaats de dia plat op een stevig maar mobiel oppervlak, zoals een stuk karton. Dek alle resterende dia's op dezelfde manier over. Laat de xyleen gedurende 10 minuten in de afzuigkap verdampen.
        OPMERKING: Eventuele materialen die met xyleen zijn verontreinigd, dienen te worden verwijderd en weggegooid in een afgesloten container in de kap om te voorkomen dat er dampen ontkomen.
    10. Laat het montage medium verharden bij RT O / N.

    6. Beeldvorming en opslag van gebrandschilderde dia's

    1. Beeldafdelingen op een samengestelde omgekeerde microscoop 18 .
      OPMERKING: Dia's kunnen op kamer te worden gehoudenTemperatuur onbepaald.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

10% gebufferd formaline en 4% paraformaldehyde (PFA) zijn twee van de meest voorkomende fixatiemiddelen die gebruikt worden voor histologiepraktijken. Ze geven echter geen optimale fixatie resultaten voor zebravis leverweefsel ( Figuur 1 en Tabel 1 ). Fixatie met 10% formaline of 4% PFA resulteert vaak in krimpen, waardoor grote lekken ontstaan ​​tussen de lever en de omliggende weefsels ( Figuur 1A , B ; Figuur 1B geeft een voorbeeld van weefselkrimping). Porties van het leverweefsel kunnen ook uit het gedeelte vallen. Het cytoplasma van de hepatocyten is vaak verloren ( Figuur 1A , 1B ). Beide fixatiemiddelen kunnen vervorming van de hepatocyten veroorzaken, aangezien zij ofwel krimpen of zwellen en niet langer de kolomme morfologie behouden die kenmerkend is voor epitheelcellen. Een extra probleem met de PFA-fixatie isDat er spaties zijn tussen de hepatocyten die niet echt zijn, waardoor het weefsel breekt ( Figuur 1B ). Bovendien, wanneer een van deze twee fixatiemiddelen wordt gebruikt, worden de hepatocyten goed gekleurd met hematoxyline, maar minder met eosine ( Figuur 1A ). De zuur-gebaseerde Dietrich's fixatie overwint de problemen met de formaline- en PFA-fixatiemiddelen ( Figuur 1C ).

In menselijke ALD is steatosis, die bestaat uit klein- en dikke vet, het meest prominent in de buurt van de centrale ader en strekt zich uit naar de portaaltrie met een toenemende ernst van 22 . Bij zebravis induceert behandeling met 2% ethanol van 96-120 pkf ook leverstatose, die wordt veroorzaakt door de overmatige afzetting van ronde druppels in de hepatocyten ( Figuur 2B , pijlen). De druppels vertonen echter nietNeem gelijkaardig verdelingspatroon zoals gezien in menselijk ALD, omdat er geen duidelijk onderscheid is tussen portaal en centrale aderen in de zebravislever 23 . De hepatische bloedvaten in de ethanolbehandelde larvallever zijn gezwollen vergeleken met die in de controle lever ( Figuur 2B , sterretjes).

Figuur 1
Figuur 1 : Vergelijkingen van H & E-kleuring in de lever van de zebravislarven die vast waren met verschillende fixatiemiddelen op 120 pkf. ( A ) 10% Formalin bij RT O / N; ( B ) 4% PFA bij 4 ° C / N; ( C ) Dietrich's fixatief bij RT gedurende 24 uur. Met 10% formaline verliest de hepatocyten hun cytoplasma (A) vaak. Het weefsel is niet goed gekleurd met eosine en lijkt paars. Na fixaMet 4% PFA, worden gapingen tussen de hepatocyten (B) gezien. 4% PFA zorgt ervoor dat het leverweefsel krimpt, dus er lijkt een grote kloof tussen de lever en de omliggende weefsels te zijn. De streeplijn in B markeert de rand van de omliggende weefsels. Dietrich's fixative zorgt voor een optimaal resultaat onder de drie (C). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 : Acute Ethanol Behandeling veroorzaakt hepatische Steatosis en bloedvaten zwelling in zebravis larvenleveren. ( A ) H & E-kleuring van de lever in een controle, onbehandelde, WT larve. ( B ) H & E-kleuring van de lever in een wil-type larve die behandeld werd met 2% ethaNol van 96 tot 120 hpf. Beide dieren werden met Dietrich's fixatief op 120 pk gefixeerd. Pijlen in (B) wijzen op de hepatocyten met overmatige afzetting van ronde druppels. Sterretjes markeren de gezwollen bloedvaten van de lever. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

10% formaline 4% PFA Dietrich's fixatief
Fixatie conditie Minimaal 24 uur bij RT 3 uur bij RT of O / N bij 4 ° C Minimaal 24 uur bij RT
Voorbeeldopslag postfixatie Onbepaald bij RT Tot 2 weken bij 4 ° C Tot 2 maanden bij RT
compatMet behulp van genomische DNA-extractie Ja Ja Nee
krimpen Ja Ja Minimum
Distorsie van cellen Ja Ja Minimum
Verlies van cellulaire details Ja Bescheiden Minimum
Evenwichtige H & E vlekken Zwakke eosinvlek Zwakke eosinvlek Ja
Verenigbaarheid met immunohistochemie Ja Ja Ja

Tabel 1: Vergelijkingen van 10% formaline, 4% PFA en Dietrich's Fixatives voor Zebrafish Liver Histology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en de daaropvolgende histopathologische analyses met H & E-kleuring. Acute ethanolbehandeling moet niet eerder dan 96 uur na bevruchting worden uitgevoerd, aangezien dit het stadium is waarop de zebravislever alcohol-metaboliserende enzymen uitdrukt 13 . 2% ethanol is de maximale dosis die larven 13 , 14 kunnen tolereren. De met ethanol behandelde larven beginnen met hepatische steatose met 8 uur behandeling te vertonen, en de percentages larven die de ontwikkeling van steatosis ontwikkelen, blijven stijgen tot 24 uur continue behandeling 14 . Zebravislarven absorberen uitsluitend voedingsstoffen uit de dooier tot 120 hpf. Daarom is ethanolbehandeling boven 120 pk niet aanbevolen, omdat vasten ook bij steatosis 14 kan bijdragen. Vergeleken met protocollen die door andere laboratoria worden gepubliceerdOratoria 13 , 24 , is de belangrijkste wijziging in het huidige protocol dat de ethanolbehandeling wordt uitgevoerd in een visfaciliteit die een 14 uur lange / 10 uur durende cyclus heeft. Dit resulteert in meer consistente en robuuste steatotische reacties dan die welke worden gezien wanneer de behandeling in het donker in een incubator wordt uitgevoerd. Dit kan verband houden met het feit dat de lipide metabolische genen in de zebravislever de dagelijkse ritmische expressie tonen in reactie op de licht / donkere cyclus 25 .

ALD is een chronische ziekte en duurt jarenlang alkoholmisbruik. De kritieke beperking van het huidige protocol voor ethanolbehandeling is dat het alleen de acute effecten van alcohol op de lever veroorzaakt. Behandeling met zo'n hoge ethanolconcentratie gedurende meer dan 48 uur zorgt voor hoge mortaliteit, waardoor het onderzoek naar chronische leverbeschadiging voorkomt. Uit een recente studie is gebleken dat continue behandeling van volwassen zebravis met 1% ethanol voor maximaal drieMaanden leidden tot steatosis, steatohepatitis en fibrose 12 . Een veelbelovende toekomstige richting zou kunnen zijn om een ​​potentiële modulator van ALD te identificeren met behulp van het acute ethanolbehandelingsprotocol en vervolgens het effect ervan te valideren in het chronische letselmodel.

H & E-kleuring wordt uitgevoerd om de hepatocellulaire schade die door acute ethanolbehandeling wordt geïnduceerd te evalueren. Vanwege het gemak van het uitvoeren van fluorescentie beeldvorming in zebravis, wordt H & E-kleuring niet routinematig gebruikt in zebravis leverhistologie, en de procedure is minder goed beschreven. Het huidige protocol geeft een stap-voor-stap beschrijving van H & E-kleuring in de larvallever. Het kiezen van de juiste fixatie is de eerste en meest essentiële stap voor H & E-kleuring. Hoewel 10% gebufferde formaline en 4% PFA vaak in histologie worden gebruikt, veroorzaken ze beide weefselkrimp en delen van de lever die uit het gedeelte vallen. 10% formaline fixatie leidt tot het verlies van cytoplasma in de hepatocytes. 4% PFA-fixatie resulteert in kunstmatige kloof tussen de hepatocyten. Eosinkleuring lijkt veel zwakker te zijn dan hematoxyline-kleuring in de levers die met fixatief zijn gefixeerd. Het zuur-gebaseerde Dietrich's fixatief is meer geschikt voor H & E-kleuring van de zebravislever, aangezien het cellulaire details behoudt en krimp vermindert. Voorts lijkt het ook vetweefsel, zoals de lever, te snijden, sneller dan formaline en PFA. De kleuring met hematoxyline en eosine is evenwichtiger. Eén caveat van Dietrich's fixative is dat het niet compatibel is met genomische DNA-extractie. In een proefexperiment werd genomisch DNA geëxtraheerd uit de larven die werden opgelost met behulp van 10% formaline, 4% PFA of Dietrich's fixatief 26 . De larven werden 20 minuten geïncubeerd in 50 μl 50 mM NaOH bij 95 ° C en vervolgens afgekoeld tot 4 ° C. 5 μl 1 M Tris-HCl, pH 8,0 werd vervolgens toegevoegd om de basisoplossing te neutraliseren. Na een korte centrifugatie wordt de supernatant wZoals gebruikt in PCR. Met hetzelfde PCR-primers- en PCR-programma leverde het genomische DNA van zowel de formaline- als PFA-vaste larven PCR-producten met de voorspelde grootte, terwijl het genomische DNA uit de Dietrich's fixatieve vaste larven geen PCR-producten leverde.

H & E-kleuring kan zowel op paraffine als in bevroren afdelingen worden uitgevoerd. Parafinensecties hebben echter de volgende voordelen ten opzichte van bevroren delen: 1) Overwegende dat paraffine secties voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur kunnen worden opgeslagen, bevroren delen kunnen maximaal een jaar bij -80 ° C worden opgeslagen. 2) Voor bevroren delen kan de vorming van ijskristallen binnen de cellen de celmorfologie en het subcellulaire detail verstoren. Bovendien zijn bevroren delen dikwijls dikker dan paraffine secties. Dit kan resulteren in slechte beelden van weefselmorfologie in vergelijking met die van paraffine secties.

Bij het bereiden van paraffineblokken voor leverweefsels, het huidige protocolBegint de larven in agarose. De larven zijn lateraal gepositioneerd, met de linkerzijde van het lichaam naar beneden gericht en vlak tegen de bodem van de mal liggen. Dit zorgt voor een consistente oriëntatie van de levers, zodat bij het snijden van secties, equivalente gebieden van de lever kunnen worden vergeleken van vis tot vis 27 . Een andere belangrijke stap die zorgt voor succesvolle H & E-kleuring is de kleurontwikkeling. Het is van cruciaal belang om de kleuring regelmatig te controleren totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt.

H & E-kleuring dient te worden gebruikt om een ​​voorlopige beoordeling van leverschade te verkrijgen. De ethanolbehandelde larven tonen een overmatige afzetting van ronde druppels in de hepatocyten, wat suggereert van steatosis 13 , 14 , 18 . Etikettering met lipide kleurstoffen, zoals Olie Rood O en Nijlrood, is nodig om te bevestigen dat deze druppels inderdaad lipiden zijn. Het hepatische bloedvaatjeEls in de behandelde dieren lijken verwijd en gezwollen. Scanning elektronenmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie moeten worden uitgevoerd om de ultrastructurale veranderingen in de sinusoïden te onderzoeken. Er is eerder gemeld dat extracellulaire matrix eiwitafzetting verhoogd is in de ethanolbehandelde zebravislever, zoals gedetecteerd door immunofluorescentie 18 . Gezien het feit dat de expressieniveaus van fibrogeengenen slechts bescheiden stijgen in de behandelde vis 18 , kan H & E wellicht niet gevoelig genoeg zijn om zo'n kleine hoeveelheid extracellulaire matrix eiwitten te detecteren. De zelfde fixatieve en kleurende methoden werden getest op de chronisch gewonde volwassen zebravislevers en waren voldoende om fibrose te detecteren (Yin, ongepubliceerde data).

Hoewel het huidige protocol is aangepast aan het onderzoek van leverhistologie bij zebravis larven, heeft het een bredere toepassing op de zebravis onderzoeksgemeenschap, zoals de samE protocol kan worden toegepast op andere weefsels en volwassen zebravis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs zouden graag Dr. Katy Murray willen erkennen bij het Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert en Kari Huppert bij CCHMC, voor hun nuttige advies over het protocol; En CCHMC veterinaire dienst, voor de visverzorging. Dit werk werd ondersteund door NIH grant R00AA020514 en een onderzoeksbijdrage van het Center for Pediatric Genomics bij CCHMC (naar CY). Het was ook gedeeltelijk steun door NIH-subsidie ​​P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) van het Spijsverteringskliniek Centrum in Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95, (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12, (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52, (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56, (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277, (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3, (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5, (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35, (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10, (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49, (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6, (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33, (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279, (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19, (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78, (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). University of Oregon Press. (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2, (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131, (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32, (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43, (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (11), 4358-4363 (2011).
Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter