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Bioengineering

Magnetisches und thermisch empfindliches Poly ( doi: 10.3791/55648 Published: July 4, 2017

Summary

Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von magnetischen und wärmeempfindlichen Mikrogelen über eine temperaturinduzierte Emulsion ohne chemische Reaktion. Diese empfindlichen Mikrogele wurden durch Mischen von Poly ( N- isopropylacrylamid) (PNIPAAm), Polyethylenimin (PEI) und Fe 3 O 4 -NH 2 Nanopartikeln für die potentielle Verwendung in magnetisch und thermisch getriggerter Arzneimittelfreisetzung synthetisiert.

Abstract

Magnetisch und thermisch empfindliche Poly ( N- isopropylacrylamid) (PNIPAAm) / Fe 3 O 4 -NH 2 -Mikrogele mit dem eingekapselten Anti-Krebs-Medikament Curcumin (Cur) wurden für die magnetisch getriggerte Freisetzung entworfen und hergestellt. PNIPAAm-basierte magnetische Mikrogele mit einer sphärischen Struktur wurden über eine temperaturinduzierte Emulsion hergestellt, gefolgt von einer physikalischen Vernetzung durch Mischen von PNIPAAm, Polyethylenimin (PEI) und Fe 3 O 4 -NH 2 magnetischen Nanopartikeln. Aufgrund ihrer Dispergierbarkeit wurden die Fe 3 O 4 -NH 2 -Nanopartikel in die Polymermatrix eingebettet. Die auf der Fe 3 O 4 -NH 2 und der PEI-Oberfläche exponierten Amin-Gruppen unterstützten die sphärische Struktur durch physikalische Vernetzung mit den Amidgruppen des PNIPAAm. Das hydrophobe Anti-Krebs-Medikament Curcumin kann in Wasser nach der Einkapselung in die Mikrogele dispergiert werden. Die Mikrogele wurden charakterisiertDurch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) und UV-Vis-Spektralanalyse. Weiterhin wurde die magnetisch getriggerte Freisetzung unter einem externen Hochfrequenzmagnetfeld (HFMF) untersucht. Eine signifikante "Burst-Freisetzung" von Curcumin wurde nach dem Aufbringen des HFMF auf die Mikrogele aufgrund des magnetischen induktiven Erhitzungselements (Hyperthermie) beobachtet. Dieses Manuskript beschreibt die magnetisch getriggerte kontrollierte Freisetzung von Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 verkapseltem Curcumin, die möglicherweise für die Tumortherapie angewendet werden kann.

Introduction

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Hydrogele sind dreidimensional (3D) polymere Netzwerke, die sich nicht auflösen können, sondern in wässrigen Lösungen aufquellen können 1 . Die polymeren Netzwerke haben hydrophile Domänen (die hydratisiert werden können, um die Hydrogelstruktur zu liefern) und eine vernetzte Konformation (die den Zusammenbruch des Netzwerks verhindern kann). Zur Herstellung von Hydrogelen wurden verschiedene Verfahren untersucht, wie Emulsionspolymerisation, anionische Copolymerisation, Vernetzung von benachbarten Polymerketten und inverse Mikroemulsionspolymerisation 2 . Die physikalische und chemische Vernetzung wird durch diese Methoden eingeführt, um strukturell stabile Hydrogele 1 , 3 zu erhalten . Die chemische Vernetzung erfordert normalerweise die Beteiligung des Vernetzungsmittels, das das Grundgerüst oder die Seitenkette der Polymere verbindet. Im Vergleich zur chemischen Vernetzung ist die physikalische Vernetzung eine bessere Wahl für fabr Ige Hydrogele aufgrund der Vermeidung eines Vernetzungsmittels, da diese Mittel für praktische Anwendungen oft toxisch sind 4 . Es wurden mehrere Ansätze zur Synthese von physikalisch vernetzten Hydrogelen untersucht, wie die Vernetzung mit ionischer Wechselwirkung, Kristallisation, Bindung zwischen amphiphilen Blöcken oder Pfropfen auf die Polymerketten und Wasserstoffbindung 4 , 5 , 6 , 7 .

Stimuli-empfindliche Polymere, die in Abhängigkeit von unterschiedlichen Umgebungsbedingungen ( dh Temperatur, pH-Wert, Licht, Ionenstärke und Magnetfeld) zu konformationellen, chemischen oder physikalischen Eigenschaftsveränderungen führen können, haben in letzter Zeit als potentielle Plattform für Systeme mit kontrollierter Freisetzung Aufmerksamkeit erregt , Arzneimittelabgabe und Anti-Krebs-Therapie 8 , 9 ,Xref "> 10 , 11 , 12. Die Forscher konzentrieren sich auf thermoempfindliche Polymere, bei denen die intrinsische Temperatur leicht kontrollierbar ist. PNIPAAm ist ein wärmeempfindliches Polymer, das sowohl hydrophile Amidgruppen als auch hydrophobe Isopropylgruppen enthält und eine niedrigere kritische Lösungstemperatur aufweist (LCST) 13. Die Wasserstoffbindung zwischen Amidgruppen und Wassermolekülen liefert die Dispersität von PNIPAAm in wässriger Lösung bei niedrigen Temperaturen (unterhalb des LCST), während die Wasserstoffbrücken zwischen Polymerketten bei hohen Temperaturen (oberhalb des LCST) auftreten und Wasser ausschließt Moleküle, so dass das Polymernetzwerk zusammenbricht.Bei dieser einzigartigen Eigenschaft wurden viele Berichte zur Herstellung von temperaturgesteuerten, selbstorganisierten Hydrogelen durch Einstellen des hydrophoben und hydrophilen Verhältnisses der Polymerkettenlänge, wie Copolymerisation, Pfropfung oder Seiten- Kettenmodifikation für PharmazeutikaPlattformen 14 , 15 , 16 , 17 .

Magnetische Materialien wie Eisen, Kobalt und Nickel haben in den vergangenen Jahrzehnten verstärkte Aufmerksamkeit für biochemische Anwendungen erhalten 18 . Unter diesen Kandidaten ist Eisenoxid am häufigsten wegen seiner Stabilität und geringen Toxizität verwendet. Nano-große Eisenoxide reagieren sofort auf das Magnetfeld und verhalten sich wie superparamagnetische Atome. Solche kleinen Teilchen aggregieren jedoch leicht; Das reduziert die Oberflächenenergie und verliert daher ihre Dispersität. Um die Wasserdispersität zu verbessern, werden Pfropfen oder Beschichten zum Schutz der Schicht üblicherweise nicht nur dazu verwendet, jedes einzelne Teilchen auf Stabilität zu trennen, sondern auch die Reaktionsstelle 19 weiter zu funktionalisieren.

Hier haben wir magnetisches PNIPAAm-basiertes Mikro hergestelltGele, um als Arzneimittelträger für Systeme mit kontrollierter Freisetzung zu dienen. Der Syntheseprozess ist in Fig. 1 beschrieben und dargestellt. Anstelle einer komplizierten Copolymerisation und chemischen Vernetzung wurde die neue temperaturinduzierte Emulsion von PNIPAAm mit anschließender physikalischer Vernetzung zur Gewinnung der Mikrogele ohne zusätzliches Tensid oder Vernetzungsmittel eingesetzt. Dies vereinfachte die Synthese und verhinderte eine unerwünschte Toxizität. Innerhalb eines solchen einfachen Präparationsprotokolls boten die as-synthetisierten Mikrogele sowohl für die magnetischen Eisenoxid-Nanopartikel als auch für die hydrophobe Anti-Krebs-Arzneimittel, Curcumin, Wasserdispersion an. FT-IR, TEM und Imaging lieferten Beweise für Dispersion und Verkapselung. Aufgrund des eingebetteten Fe 3 O 4 -NH 2 zeigten die magnetischen Mikrogete das Potential, als Mikrogeräte für die kontrollierte Freisetzung unter HFMF zu dienen.

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Protocol

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1. Synthese von oberflächenmodifizierten, wasserdispergierbaren magnetischen Nanopartikeln, Fe 3 O 4 und Fe 3 O 4 -NH 2

  1. Zugabe von 14,02 g FeCl 3 , 8,6 g FeCl 2 · 4H 2 O und 250 mL Wasser zu einem 500 ml-Becherglas.
  2. Verbinden Sie den Rotor und den Regler mit dem mechanischen Rühren. Die Lösung bei 300 U / min für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mischen.
  3. Man gibt 25 ml Ammoniumhydroxid (33%) in die Lösung bei RT zu und rührt (300 U / min) für 30 min. Halten Sie den Becher offen.
    ACHTUNG: Ammoniumhydroxid kann bei Einatmen Nasenreizung verursachen. Dieser Schritt muss in einer geeigneten Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
  4. Um die magnetischen Eisenoxide (Fe 3 O 4 ) zu sammeln, entfernen Sie das mechanische Rühren. Setzen Sie einen Magnet unter den Becher, um die schwarzen Partikel zu sammeln.
    1. Nachdem die Fe 3 O 4 Nanopartikel vollständig ausgefällt sind, entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Schüttle nicht das bEaker beim Ausgießen des Überstandes, um den Verlust von Fe 3 O 4 zu vermeiden.
    2. Entfernen Sie den Magneten und fügen Sie 50 ml Frischwasser zum Becher hinzu.
    3. Schütteln Sie den Becher, um das Fe 3 O 4 erneut zu dispergieren. Wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.4.2 dreimal, um das Fe 3 O 4 zu reinigen.
  5. Nach dem letzten Waschvorgang alle Fe 3 O 4 (10 g) in eine 100-ml-Glasflasche überführen. Wasser zugeben, bis das Gesamtlösungsvolumen 100 ml beträgt. Schütteln Sie die Glasflasche kräftig, bis keine Klumpen sichtbar sind.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die Fe 3 O 4 Nanopartikel werden hergestellt.
  6. Das Fe 3 O 4 mit Aminosilan (Fe 3 O 4 -NH 2 ) modifizieren.
    1. Nehmen Sie die 100-ml-Lösung aus Schritt 1.5 und überführen Sie sie in ein 1.000-ml-Becherglas. Füge 10 ml Ammoniaklösung, 90 ml Wasser und 900 ml Ethanol zum Becher hinzu.
    2. Verwenden Sie einen Magnetrührer, um die Lösung zu mischen300 U / min. Man gibt 500 μl (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) tropfenweise zum Becher bei RT zu und rührt noch 12 h.
  7. Reinigen und sammeln Sie das Fe 3 O 4 -NH 2 wie in Abschnitt 1.4 beschrieben.
  8. 1 g Fe 3 O 4 -NH 2 (ab Schritt 1.7) in einer 20-ml-Glasflasche mit 20 mL Wasser erneut dispergieren.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die Fe 3 O 4 -NH 2 -Nanopartikel werden hergestellt.

2. Synthese von organisch-anorganischen Hybrid-Mikrogelen durch thermoinduzierte Emulsion

  1. Vorbereitung der Lösung 1-1 und 1-2 .
    1. Für die Lösung 1-1 werden 0,25 g PNIPAAm, 5 ml Fe 3 O 4 -Lösung (aus Schritt 1,5) und 0,2 g PEI zu einer 50-ml-Glasflasche gegeben. Fügen Sie 20 ml Wasser hinzu und verwenden Sie einen Magnetrührstab, um bei 300 U / min für 30 min zu rühren.
    2. Für Lösung 1-2 wiederholen Sie Schritt 2.1.1, aber ersetzen Sie Fe 3 O 4 als Fe3 O 4 -NH 2 -Lösung (ab Schritt 1.8).
  2. Zur Herstellung von Lösung 2 werden 0,8 g PEI und 18,2 ml Wasser zu einer 50-ml-Glasflasche gegeben. Verwenden Sie ein Wasserbad, um die Lösung auf 30 ° C für 30 min aufzuheizen. Vorbereitung einer zweiten Flasche Lösung 2 .
  3. Vorbereitung von PNIPAAm / Fe 3 O 4 .
    1. Verwenden Sie einen Ultraschall-Zell-Disruptor zu sonicate (50 w), ein Magnetrührstab zu rühren (300 U / min) und ein Wasserbad, um Lösung 2 (70 ° C) zu erhitzen.
    2. Die Lösung 1-1 der erhitzten Lösung 2 tropfenweise unter Verwendung einer 3-ml-Spritze mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min zugeben.
    3. Setzen Sie die Beschallung fort, rühren und erhitzen bei 70 ° C für 30 min.
    4. Die Lösung auf RT abkühlen lassen. Entfernen Sie die Lösung aus dem Zellstörer und Wasserbad.
    5. Sammeln Sie die Mikrogele, indem Sie den Magneten nahe an die Glasflasche legen.
    6. Den Überstand entfernen afDie Mikrogele sind auf den Boden der Glasflasche gefällt.
    7. Füge weitere 25 ml Wasser in die Glasflasche und re-dispergieren die Mikrogele durch Vortexen. Diese Lösung ist PNIPAAm / Fe 3 O 4 .
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
  4. Herstellung von PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 .
    1. Verwenden Sie einen Ultraschall-Zell-Disruptor zu sonicate (50 w), ein Magnetrührstab zu rühren (300 U / min) und ein Wasserbad, um Lösung 2 (70 ° C) zu erhitzen.
    2. Addieren Sie die Lösung 1-2 zu der erhitzten Lösung 2 tropfenweise unter Verwendung einer 3-ml-Spritze mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min.
    3. Setzen Sie die Beschallung fort, rühren und erhitzen bei 70 ° C für 30 min.
    4. Die Lösung auf RT abkühlen lassen. Entfernen Sie die Lösung aus dem Zellstörer und Wasserbad.
    5. Sammeln Sie die Mikrogele, indem Sie den Magneten nahe an die Glasflasche legen.
    6. Sobald die Mikrogele ausfallen, entfernen SieDer Überstand.
    7. Füge weitere 25 ml Wasser in die Glasflasche und re-dispergieren die Mikrogele durch Vortexen. Diese Lösung ist PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 .
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

3. Herstellung von mit Curcumin beladenen Mikrogelen (Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 )

HINWEIS: Diese Schritte müssen im Dunkeln durchgeführt werden.

  1. Füge 100 mg Cur und 20 ml Ethanol zu einer 20-ml-Glasflasche hinzu.
  2. Nehmen Sie 2 ml der Cur-Lösung und überweisen Sie auf die PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 -Lösung (Schritt 2.4.7). Rühre bei 400 U / min und RT über Nacht.
  3. Nach dem Rühren bei 400 U / min und RT über Nacht, verwenden Sie den Magneten, um PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 zu sammeln, wie in den Schritten 2.4.5 und 2.4.6 beschrieben.
  4. Füge weitere 25 ml Wasser in die Glasflasche und re-dispergieren die Mikrogele durch Vortexen. Diese Lösung ist C Ur-PNIPAAm / Fe & sub3; O & sub4; -NH & sub2 ;.

4. Magnetisch ausgelöste Drug Release

  1. Übertragen Sie 10 ml der Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 -Lösung und fügen Sie 2 ml Wasser zu einem 15-mL-Zentrifugationsröhrchen hinzu.
  2. Setzen Sie das Zentrifugationsrohr in die Mitte der Spule, um den HFMF 20 anzuwenden. HFMF bei 15 KHz für 20 min auftragen.
  3. 50 ml der HFMF-Lösung entnehmen und mit frischem 0,5 ml Wasser in jedem 2-minütigen Intervall bei Anwendung des HFMF ersetzen.
  4. Die entnommene Lösung in die 1-ml-Küvette überführen.
  5. Messung der Absorption der entnommenen Lösung durch UV / Vis bei 482 nm 21 .
  6. Bestimmen Sie die Konzentration der freigesetzten Medikamente unter Verwendung der Beziehung von Absorption und Konzentration von einer Standard-Eichkurve 22 .
    HINWEIS: Die Standard-Kalibrierrelation ist:
    S / ftp_upload / 55648 / 55648eq1.jpg "/>
    Wobei der Korrelationskoeffizient 0,9993 beträgt.

5. Charakterisierung der magnetischen Mikrogele

  1. Thermogravimetrischer Analysator (TGA) 23 .
    1. Messen Sie den Gewichtsverlust von PNIPAAm / Fe 3 O 4 und PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 gegenüber der Temperatur unter Luftatmosphäre durch TGA.
      1. Die Probe von RT auf 100 ° C erhitzen und 10 min bei 10 ° C aufnehmen, um Feuchtigkeit zu vermeiden. Die Probe von 100 ° C auf 800 ° C mit einer Geschwindigkeit von 10 ° C / min erhitzen. Wiegen Sie die Proben.
      2. Zeichnen Sie den Gewichtsverlust gegen die Temperatur von PNIPAAm / Fe 3 O 4 und PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 .
        HINWEIS: Das Restgewicht ist entweder Fe 3 O 4 oder Fe 3 O 4 -NH 2 , während das verlorene Gewicht PNIPAAm ist.
  2. FT-IR"> 24
    1. Trocknen Sie 10 mg Probe mit 1 g KBr bei 100 ° C über Nacht.
    2. Drücken Sie die Mischung aus Schritt 5.2.1 in Pellets, wie in den folgenden Schritten beschrieben (5.2.2.1 - 5.2.2.5):
      1. Schleifen Sie die Materialien aus Schritt 5.2.1 in ein feines Pulver mit einem Mörser und Pistill.
      2. Setzen Sie den zusammengebauten Apparat (Mörser und Stößel) in die Pelletpresse. Richten Sie das Gerät in der exakten Mitte der Presse aus.
      3. Pumpen Sie die Presse, bis ein Druck von 20.000 psi erreicht ist. Lassen Sie das Pellet bei diesem Druck für 5 min sitzen.
        VORSICHT: Richten Sie das Gerät in der exakten Mitte der Presse aus, sonst wird die Probe aus dem Mörser herausdrücken und Verletzungen durch die Belichtung verursachen.
      4. Entfernen Sie die Matrize, die das Pellet und den Kolben enthält, aus der Presse.
      5. Drehen Sie ihn um und pumpen Sie den Kolben, um das Pellet herauszuziehen.
    3. Aufzeichnen der FT-IR-Absorptionsspektren von Proben durch FT-IR bei Frequenzen im Bereich von 400 bis 4.000 cm -1 -1 Auflösung 24 .
  3. Morphologiebeobachtungen nach TEM 25 .
    1. Die Probenlösung auf ein mit einem Kollodion beschichtetes Kupfergitter tropfen und dann bei RT oder in einem 70 ° C-Ofen über Nacht trocknen lassen.
    2. Nehmen Sie TEM Bilder.
      HINWEIS: Starke Elektronenstrahlen können die Proben beschädigen. Daher sollten TEM-Bilder so schnell wie möglich genommen werden.
  4. Wässrige Dispersionsfähigkeiten von Polymeren und Mikrogelen.
    1. Zur Vorbereitung der PNIPAAm-Lösung werden 7 mg PNIPAAm und 7 ml Wasser zu einer 7-ml-Glasflasche gegeben. Verwenden Sie einen Wirbel, um die Lösung zu mischen, bis es keine Aggregate gibt.
    2. Zur Herstellung von PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 -Lösung werden 0,7 ml PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 -Lösung (Schritt 2.4.7) auf eine 7-ml-Glasflasche gegeben und 6,3 ml Wasser zugesetzt. Verwenden Sie einen Wirbel, um die Lösung zu mischen, bis es keinen Niederschlag gibt.
    3. Zur Vorbereitung von Cur-PNIPAAM / Fe 3 O 4 -NH 2 -Lösung, 0,7 ml Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 -Lösung (Schritt 3,4) zu einer 7-ml-Glasflasche überführen und 6,3 ml Wasser zugeben. Verwenden Sie einen Wirbel, um die Lösung zu mischen, bis es keinen Niederschlag gibt.
    4. Nehmen Sie ein Bild von den Lösungen (Schritte 5.4.1 - 5.4.3) mit einer Digitalkamera.
    5. Legen Sie die Lösungen in einen Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 70 ° C. 2 Stunden bis zum Gleichgewicht warten
    6. Nehmen Sie ein anderes Bild von den Lösungen. Um die Temperatur aufrechtzuerhalten, nehmen Sie das Bild innerhalb von 1 min. Vermeiden Sie es, die Glasflasche zu schütteln, da dies die Niederschläge re-dispergieren kann.
  5. Zur magnetischen Sammlung von Mikrogelen legen Sie den starken Magneten in die Nähe der Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 -Lösung (Schritt 5.4.3). Warten Sie, bis die Mikrogele vollständig gesammelt sind, dann nehmen Sie ein Bild.
    1. Entfernen Sie den Magneten und verwirren Sie die Mikrogel-Lösung bis vollständig dispergiert. Nehmen Sie ein anderes Bild. </ Li>

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Representative Results

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Das Schema zur Synthese von PNIPAAm / PEI / Fe 3 O 4 -NH 2 -Mikrogelen ist in 1 gezeigt . TGA wurde angewendet, um die relative Zusammensetzung der organischen Verbindung gegen das gesamte Mikrogel zu schätzen. Da nur die organische Verbindung PNIPAAm verbrannt werden konnte, wurde die relative Zusammensetzung von PNIPAAm und Fe 3 O 4 (oder Fe 3 O 4 -NH 2 ) bestimmt und ist in Tabelle 1 gezeigt . Warum zeigen PNIPAAm / Fe & sub3; O & sub4; -NH & sub2; -Mikrogele die bessere Dispersität, aber halten niedrigere Gehalte an Eisenoxiden Aufgrund der stärkeren Wechselwirkung und einer besseren Dispersion in PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 als bei PNIPAAm / Fe 3 O 4 ist Fe 3 O 4 -NH 2 einfacher, PNIPAAm als Fe 3 O 4 zu vernetzen. Als Ergebnis wurden die Ausbeuten an PNIPAAm / Fe & sub3; O 2 -Mikrogele sind viel höher als die von PNIPAAm / Fe 3 O 4 . Aufgrund der Auffangprozesse (Schritte 2.3.3 - 2.3.5 und 2.4.3 - 2.4.5) wurde unvernetzte PNIPAAm mit dem Überstand entfernt, da nur das magnetische Eisenoxid mit Mikrogelen magnetisch absorbiert werden kann. Infolgedessen betragen die Gewichtsprozente von PNIPAAm in den Mikrogelen 32,37% (PNIPAAm / Fe 3 O 4 ) und 68,56% (PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 ). Die Fe 3 O 4 -NH 2 -Nanopartikel können im Vergleich zu Fe 3 O 4 -Nanopartikeln viel mehr PNIPAAm vernetzen.

Die TEM-Bilder von PNIPAAm-Lösungen und magnetischen Mikrogelen wurden von der Digitalkamera bei Raumtemperatur aufgenommen. Wie in Abbildung 2a gezeigt , gibt es keine spezifischen Strukturen in einer reinen PNIPAAm-Lösung bei Raumtemperatur. Allerdings sind regelmäßige sphärische Eisenoxid parti( Fig. 2b ) wurden sowohl in PNIPAAm / Fe & sub3; O & sub4; ( Fig. 2c ) als auch in PNIPAAm / Fe & sub3; O & sub4; -NH & sub2; ( Fig. 2d ) Mikrogelen beobachtet, was den Nachweis einer physikalischen Vernetzung ergab, die aus der Wasserstoffbindung zwischen PNIPAAm und PEI resultierte . Die meisten Fe 3 O 4 -Nanopartikel können nur auf der Oberfläche der PNIPAAm-basierten Matrix adsorbiert und Aggregationscluster hergestellt werden ( Abbildung 2c ). Jedoch können aufgrund der größeren Wasserdispersität und der kleineren Größe der magnetischen Nanopartikel ( Abbildung 3d ) im Vergleich zu nackten Fe 3 O 4 -Nanopartikeln APTES-modifizierte Eisenoxid-Nanopartikel, Fe 3 O 4 -NH 2 , in die Partikel eingebettet werden. Nach der Beladung mit Curcumin wurde die Morphologie von Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 ( Fi2e) war viel isolierter als die von magnetischen Mikrogelen aufgrund der hydrophoben Charakteristik von Cur. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass Cur nicht nur innen eingekapselt, sondern auch auf der Oberfläche der Mikrogele absorbiert wurde.

Die Mikrogelpräparation und die therapeutische Molekülkapselung wurden durch die FT-IR-Analyse identifiziert, wie in 3 gezeigt . Im Vergleich zu Fe 3 O 4 aus der Literatur 19 , 26 wurden die neu erscheinenden Absorptionspeaks bei 2927, 1203, 987 und 472 cm -1 auf die Schwingung von CH-Streckung, Si-O-Si-Streckung, Si-O, zurückgeführt Streckung und Si-O-Biegung, was die erfolgreiche Modifikation von APTES zur Deckung der Oberfläche der Fe 3 O 4 -Nanopartikel vorschlug. Fe-O-Schwingungsspitzen (584 cm -1 ) wurden auch bei PNIPAAm / Fe 3 O 4 beobachtet 3 O 4 -NH 2 . Allerdings war die relative Intensität der Fe-O-Vibration bei PNIPAAm / Fe 3 O 4 höher als bei PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 , was auch unsere Beschreibung der Zusammensetzung unterstützte, dass eine bessere Wasserdispergierung zu einer Bessere strukturelle Verteilung Nach dem Beladungsprozess erschienen in den FT-IR-Spektren von Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 charakteristische Absorptionspeaks von Curcumin bei 1509 und 3511 cm -1 bezogen auf aromatische C = C-Biegung bzw. OH-Streckung Zeigte die erfolgreiche Kapselung von Curcumin an.

Die Fotos verschiedener Mikrogele bei 25 ° C oder 70 ° C sind in Abbildung 4 dargestellt , in der die milchigen und braunen Lösungen die Aggregation von PNIPAAm bzw. Eisenoxiden darstellen. Im Vergleich zu den Fig. 4a - c , es gab keine offensichtlich sichtbaren Aggregationen in PNIPAAm, PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 und Cur-PNIPAAm / Fe3O 4 -NH 2 -Lösungen bei Raumtemperatur (25 ° C). PNIPAAm-Lösung und magnetische Mikrogele wurden dann opak, wenn die Lösungen höher erhitzt wurden als die LCST von PNIPAAm, wie in Abbildung 4d - f gezeigt . Beide magnetischen Mikrogele waren milchig, aber ohne Niederschlag dispergiert, und dies zeigte die große Dispersität und starke, physikalische Bindung zwischen PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 und Curcumin an. Wie in Fig. 5 gezeigt , können die magnetischen Mikrogele leicht mit dem Magneten gesammelt und in die wässrige Lösung ohne jegliche Aggregation nach dem Entfernen des Magneten erneut dispergiert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass diese magnetischen Mikrogele möglicherweise auf ein wässriges Abgabesystem wie den menschlichen Körper aufgetragen werden könntenOder klinischen Anwendungen.

In-vitro- Freisetzungsverhalten von magnetischen Mikrogelen wurden über HFMF überwacht. Die in Fig. 6 dargestellte Versuchsvorrichtung ist in Fig. 6 gezeigt , wo das Zentrifugationsrohr in der Mitte der Spule sein sollte, die das Magnetfeld trägt. Der in der Röhrenmitte befindliche braune Niederschlag war die magnetischen Mikrogele, die von den Lösungen unter HFMF-Behandlungen getrennt wurden.

Der Anteil der magnetischen Freisetzung mit und ohne HFMF wurde überwacht und ist in Abbildung 7 dargestellt . Im Vergleich zum Prozentsatz der Freisetzung ohne HFMF innerhalb identischer Perioden (20 min) erhöhte sich der Freisetzungsprozentsatz bei der HFMF-Behandlung um das 2,5-fache, und die Temperatur der Bulk-Lösung konnte gleichzeitig auf über 50 ° C erhöht werden. Durch die Eindämmung von wärmeempfindlichen Polymeren konnten PNIPAAm, magnetische Mikrogele,Das eingekapselte Arzneimittel (Cur) auspressen, was aus der PNIPAAm-Polymermatrix resultiert, die hydrophob wird und dann unter hoher Temperatur (50 ° C) konjugiert wird. Mittlerweile konnte Curcumin freigegeben werden, um die Anti-Krebs-Therapie durch Anwendung der HFMF zu erreichen. Lokale Erwärmung von der magnetischen Induktion auf HFMF kann die Bindung zwischen Cur und PNIPPAm zerstören, obwohl der hydrophobe Cur erwartet wird, an die hydrophobe PNIPPAm bei hohen Temperaturen zu binden. Weiterhin würde auch die Volumenänderung (von hydrophober zu hydrophober und niedrigerer zu höherer Temperatur) der magnetischen Mikrogele den Cur ausdrücken.

Die Temperaturerhöhung der Massenlösung wurde aufgezeichnet und in Fig. 7 als die rote Kurve mit dem Diamantsymbol gezeigt. Wie gezeigt, erhöhte sich die Temperatur zunächst mit der Heizzeit und wurde nach 14 min ausgetrocknet. Das Plateau sollte die Sättigung der magnetischen induktiven Erwärmung (Hyperthermie)In der Masse Wasser. Allerdings sollte die lokalisierte Temperatur hoch genug sein, um den Cur zu quetschen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematisches Syntheseverfahren für PNIPAAm / PEI / Fe3O4-NH2-Mikrogele.
Mischen Sie die PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 und PEI zusammen und erwärmen Sie das Gemisch auf 70 ° C, um eine H-Bindung für das Mikrogelpräparat einzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. TEM-Bilder von PNIPAAm-Lösungen und magnetischen Mikrogelen. A) PNIPAAm, b) Fe 3 O 4 , c) PNIPAAm / Fe 3 O 4 , d) PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 und e) Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 . Die TEM-Bilder wurden aufgenommen, um die Dispersität und Morphologie der Proben zu überwachen. Die TEM-Proben wurden bei RT hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. FT-IR-Spektren von PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 , PNIPAAm / Fe 3 O 4 , PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 und Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 . Die so synthetisierten Mikrogele wurden mit KBr vermischt und in Pellets gepresst. FRIR wurde dann angewendet, um die Wechselwirkungen zu klären. OF PNIPAAm, Fe 3 O 4 -NH 2 , PEI und Curcumin durch Überwachung der Absorptionsänderungen von Funktionsgruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Wässrige Dispersion Fähigkeiten von Mikrogelen unter und oberhalb des LCST: a) PNIPAAm, b) PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 und c) Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 bei 25 ° C. D) PNIPAAm, e) PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 und f) Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 bei 70 ° C. Die Probenlösungen wurden bei RT hergestellt und auf 70 ° C erwärmt. Das FotoGraphen wurden unter RT und 70 ° C aufgenommen, um die Wasserdispersität von synthetisierten Mikrogelen zu beobachten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Sammlung von mit Curcumin beladenen magnetischen Mikrogelen durch einen Magneten. Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 wurden in wässriger Lösung (links) dispergiert und von einem Magneten (rechts) gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6. Experimentelle Apparatur für Magnettrig Geringe Freigabe mit HFMF. Der weiße Ring ist die Kupferspule. Das Zentrifugationsrohr, das die magnetischen Mikrogele enthält, ist gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7
Abbildung 7. Kontrollierte Freisetzung von Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 Mikrogelen bei pH 7,4 mit (quadratisches Symbol) und ohne (Kreis-Symbol) HFMF. Der Curcumin-Freisetzungsprozentsatz der magnetischen Mikrogele mit (schwarzen Quadraten) und ohne (schwarze, Kreise), die das HFMF anwenden, wird gezeigt. Die Temperaturerhöhung von Cur-PNIPAAm / Fe 3 O 4 -NH 2 -Mikrogelen mit HFMF wird in Rot (Diamant) angezeigt. Fehlerbalken stellen SD dar.= "_ Blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Proben PNIPAAm (%) Fe & sub3 ; O & sub4; (%)
PNIPAAm / Fe & sub3; O & sub4 ;. 32.37 68,63 (Fe & sub3; O & sub4;)
PNIPAAm / Fe & sub3; O & sub4; -NH & sub2 ;. 68,56 31,44 (Fe & sub3; O & sub4; -NH & sub2;)

Tabelle 1. Relative Zusammensetzung (% Gewicht) der magnetischen Nanopartikel und PNIPAAm in den Mikrogelen. Die relative Zusammensetzung der magnetischen Mikrogele wurde mittels TGA-Analyse berechnet.

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Discussion

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Die wichtigsten Schritte der Präparation sind im Protokollabschnitt 2 für die Synthese der magnetischen Mikrogele durch thermoinduzierte Emulsion. Wie in Fig. 2 (TEM-Bilder) gezeigt, konnte die sphärische Struktur von Mikrogelen aufgrund der physikalischen Vernetzung aufgrund der starken H-Bindung zwischen PNIPAAm (Amidgruppen), PEI (Aminogruppen) auf RT (niedriger als das LCST) gehalten werden, Und Fe & sub3; O & sub4; -NH & sub2; (Amingruppen). Basierend auf dem Vergleich in Fig. 4 sind die magnetischen Mikrogele bei niedriger (25ºC) oder hoher (70ºC) Temperatur gut dispergiert. Die Mikrogele können auch durch einen Magneten gesammelt und in homogene Lösung, wie in Fig. 5 gezeigt, erneut dispergiert werden.

Die traditionelle Herstellung von Hydrogelen, die sowohl mit hydrophoben als auch mit hydrophilen Monomeren synthetisiert werden, erfordert normalerweise die Einführung von Vernetzungsmitteln, um 3D zu erhaltenNetzwerke 4 , 5 , 6 , 7 . Allerdings sind Vernetzungsmittel schwer zu entfernen und verursachen häufig Nebenwirkungen in ihrer Anwendung.

PNIPAAm kann sich unter hohen Temperaturen zu Partikeln zusammensetzen oder sich selbst zusammensetzen und auch in homogene Lösung re-dispergieren, wenn die Temperatur niedriger ist als ihre LCST. Vernetzung und chemische Modifikation werden häufig für die Hydrogel-Zubereitung verwendet, um den Zusammenbruch von 3D-Netzwerken zu verhindern. Hierbei wird hierbei eine thermoinduzierte Vernetzung durch Wasserstoffbindung angewendet, um chemische Reaktionen zu ersetzen und damit das Synthese- und Herstellungsverfahren zu vereinfachen.

Wesentlich für den Erfolg der Hydrogelherstellung sind das polymerisations- und vernetzungsfreie Verfahren und die Verkapselung von hydrophoben Arzneimitteln. Ohne Polymerisation konnte das Hydrogel die nicht umgesetzten Initiatoren und Monomere, die oft führen, entfernenZu starker Toxizität. Hier haben wir erfolgreich die Dispersion und Verkapselung von anorganischen Verbindungen (Eisenoxid) und hydrophoben Molekülen (Curcumin) durch Oberflächenmodifikation und Lösemittel-Einführung erreicht.

Durch In-vitro- Freisetzungstests ( Abbildung 7 ) fanden wir, dass die magnetischen Mikrogele eine effiziente Zunahme sowohl der Temperatur als auch des Freisetzungsprozentsatzes im externen Magnetfeld (HFMF) durch den magnetischen induktiven Erhitzungseffekt (Hyperthermie) hatten. Mit den oben erwähnten Eigenschaften sind diese PNIPAAm-basierten magnetischen Mikrogele potentielle Kandidaten für die magnetisch und thermisch getriggerte, gezielte Lieferung der Tumortherapie.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu veröffentlichen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde finanziell vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (MOST 104-2221-E-131-010, MOST 105-2622-E-131-001-CC2) unterstützt und teilweise unterstützt vom Institut für Atom- und Molekulare Wissenschaften, Academia Sinica

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) Polyscience, Inc 21458-10 Mw ~40,000
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma-Aldrich 440140 > 99 %
Iron(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 44939 99%
Iron(III) chloride Sigma-Aldrich 157740 97%
Curcumin Sigma-Aldrich 00280590
Ammonia hydroxide Fisher Chemical A/3240/PB15 35%
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich 806552 pH 7.4, liquid, sterile-filtered
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 50 % (w/v) in water
High-frequency magnetic field (HFMF) Lantech Industrial Co., Ltd.,Taiwan LT-15-80 15 kV, 50–100 kHz
Ultraviolet-Visible Spectrophotometry Thermo Scientific Co. Genesys
Transmission electron microscopy (TEM) JEM-2100 JEOL
Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) PerkinElmer Spectrum 100
Thermogravimetric analyzer PerkinElmer Pyris 1
Ultrasonic cell disruptor Hielscher Ultrasonics UP50H

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Kuo, C. Y., Liu, T. Y., Wang, K. S., Hardiansyah, A., Lin, Y. T., Chen, H. Y., Chiu, W. Y. Magnetic and Thermal-sensitive Poly(N-isopropylacrylamide)-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release. J. Vis. Exp. (125), e55648, doi:10.3791/55648 (2017).More

Kuo, C. Y., Liu, T. Y., Wang, K. S., Hardiansyah, A., Lin, Y. T., Chen, H. Y., Chiu, W. Y. Magnetic and Thermal-sensitive Poly(N-isopropylacrylamide)-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release. J. Vis. Exp. (125), e55648, doi:10.3791/55648 (2017).

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