Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה

doi: 10.3791/56599 Published: June 19, 2018

Summary

שיטה קלה עבור מדידה ואפיון הידבקות חיידקים לצמחים, בעיקר שורשים ונבטים, המתוארת במאמר זה.

Abstract

כתב יד זה מתאר שיטה למדידת מחייב חיידקי משטחי המפעל axenic במיקרוסקופ אור, באמצעות ספירת קיימא. צמח החומרים המשמשים כוללים שורשים, נבטים, עלים, לחתוך פירות. בשיטות המתוארות הן זולות, קל וזה מתאים גודל מדגם קטן. איגוד נמדד במעבדה, ניתן להשתמש במגוון מדיה הדגירה ותנאים. ההשפעה של מעכבי יכול להיקבע. גם יכול להיות מוערך מצבים לקדם ומעכבות מחייב. במקרים מסוימים זה אפשרי להבחין אם התנאים השונים לשנות מחייב בראש ובראשונה בגלל השפעתם על המפעל או על החיידקים.

Introduction

המדד של איגוד חיידקי לשתול משטחים הפך חשוב בשלושה מצבים שונים. המצב הראשון הוא הבחינה של השידור של האדם פתוגנים צמח משטחים1,2,3. המטרה היא למנוע מחייב חיידקי או כדי להסיר או להרוג חיידקים מאוגד ובכך להפחית את העברת מחלות על-ידי חומר צמחי. המצב השני הוא הבחינה של הכריכה של פתוגנים צמח לשתול משטחים4. שוב המטרה היא למנוע מחייב או כדי להסיר או להרוג חיידקים מאוגד ובכך להפחית את המחלה. המצב השלישי הוא הבחינה של הכריכה של חיידקים סימביוטיים או צמחים-צמיחה-קידום5,6. . המטרה היא לקדם בקטריאלי מחייב ובכך להגדיל ובריאות הצמח יבול התשואות.

הטכניקות למדידת איגוד חיידקי לשתול משטחים המתוארות במאמר זה הם זול וקל יחסית לביצוע. שהדרישות היחידות במיקרוסקופ הינם חומרים הנמצאים בדרך כלל בדיקות מעבדה. עבור כמה טכניקות sonicator אמבט שימושית. מהטכניקות שתוארו מיועדים מחייב ניסויים מתבצעות בעזרת גודל מדגם קטן יחסית. מדידות של איגוד מיוצרים במעבדה, למרות שזה עשוי להיות אפשרי לשנות חלק משיטות אלה לשימוש בחממה או בשטח.

טכניקות אלה שימשו למדידת איגוד חיידקי שורשים, נבטים, עלים לחתוך לחתוך פירות, עגבניות שרי שלמות מעבדה7,8,9,10,11, 12,13,14,15. הם גם שימשו כדי למדוד שורש התיישבות צמחים גדלים בקרקע או חול מעבדה16. הטכניקות שימשו עם מינים חיידקיים רבים כולל Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli סלמונלה enterica, ו Pseudomonas fluorescens. ניתן למצוא תיאור שימושי של שיטות להערכת את האינטראקציה של א tumefaciens עם משטחי מורטון, Fuqua (2012)17. בכל המקרים גודל מדגם מעורבים היו קטנים, בדרך כלל פחות מ- 25-50 צמחים. מהטכניקות שתוארו מתאימים לשימוש עם פתוגנים אנושי אשר צריך להישמר כלולות במהלך הניסויים.

Protocol

1. הכנת חומר צמחי Axenic

  1. להכין בשתילים שגדלו במים.
    1. הכנס מספר קטן של זרעים (פחות מ 30) 30, 50, 100 או 150 מ"ל כוס זכוכית. השתמשנו עגבניות אספסת, תודרנית לבנה, אפונה, שעועית, טבק, חסה, גזר זרעים עם פרוטוקול זה.
      הערה: כדי לקבוע כמה זרעי יכולים להיות מעוקר יחד ללא זיהום מתפשט מזרע אחד למשנהו, ראה שלב 1.1.2.
    2. מכסה את הזרעים עם 80% אתנול, מערבולת בקצרה. תן את הזרעים משרים למשך 1 דקות.
    3. יוצקים את האתנול ולכסות את הזרעים עם פתרון של 50% על ידי אמצעי אחסון מסחרי מלבין (NaClO) ו- 0.1% טריטון X-100 במי ברז. תן את הזרעים משרים למשך 20 דקות.
      הערה: אם הזרעים גדולים, כגון זרעי שעועית, ייתכן צורך להאריך את הזמן השריית להרוג לחלוטין את הפטריות על פני הזרע.
    4. יוצקים את התערובת אקונומיקה ולשטוף את הזרעים 3 פעמים עם מים סטריליים. תן את הזרעים להשרות במים 1 דקות עבור כל כביסה.
    5. כדי להשיג השתילים axenic להוסיף כמות קטנה של מים סטרילי בין 5 ל 25 מ ל בהתאם לגודל של הזרעים. שופכים את הזרעים והמים לתוך צלחת פטרי סטריליות על נביטת הזרעים.
      הערה: המים צריכים לכסות את החלק התחתון של המנה אך אינו מכסה את הזרעים לעודד היווצרות של שערות השורש. Axenic מתאר תרבות שבה רק זן אחד של אורגניזם קיים.
    6. דגירה בחושך עד השתילים מגיעים לגודל הרצוי בין 1 ס מ 10 ס מ (כ- 5 ימים עגבניות, לבנה א ו- 1 עד 3 ימים על אספסת). זרעים גדולים יותר להשתמש במיכל סטרילי מקורה עם קיבולת של יותר מ- 100 מ ל כגון צלחת זכוכית מכוסה בנייר כסף.
  2. לקבוע את התדירות של זיהום של הרבה זרע מסוים עם מיקרואורגניזמים אשר נותרו קיימא על או בתוך הזרעים לאחר השטח-עיקור.
    הערה: דבר זה הכרחי מכיוון זרעים מזדמנים לשאת מיקרואורגניזמים תחת קליפת הזרע אשר יכול להרוג. השטח-עיקור. להשתמש את התדירות של זרעים מזוהמים הרבה זרע כדי לקבוע כמה זרעים לחטא בבת אחת ללא סיכון גבוה של הקבוצה של זרעים להיות מזוהמים בגלל זרע אחד עם חיידקים או פטריות אשר לשרוד את הטיפול.
    1. לבצע את השלבים 1.1.1 דרך 1.1.3.
    2. מניחים את הזרעים על אגר מזין צלחת פטרי. לשים 10-30 זרעים בכל צלחת ריווח אותם. כך הם can be הבקיע בנפרד. חותם את הכלים עם סרט איטום או קלטת.
    3. תקופת דגירה של 3-5 ימים-25 ° C הבקיע בכל יום עבור גלוי המוצלח מיקרואורגניזמים מהזרעים.
  3. להכין בשתילים שגדלו בחול. ניתן לגדל שתילים בחול לשימוש בניסויים אדהזיה חיידקי.
    1. לבצע את השלבים 1.1.1 דרך 1.1.3.
    2. לחטא חול קוורץ או ים ב החיטוי. שני אלה מכילים חומר אורגני. אם פעולה זו תשפיע על הניסוי, לשטוף את החול על ידי הסתרתה באמצעות פעמיים נפחו של 0.1 M HCl. לערבב במשך 10 דקות אפשר החול ליישב, יוצקים את הנוזל. יש לשטוף את החול 3 פעמים עם מים, ופעם עם 80% אתנול ואחריו שתי שטיפות מים נוספים באמצעות פרוטוקול אותו באשר 0.1 M HCl. Sterilize החול שטף החיטוי.
    3. לחטא מכולות מאת ששוטף את 50% מלבין במשך 5 דקות, לשטוף אותם 5 פעמים עם מים סטריליים על ידי צלילה. לאפשר להם להתייבש, חותם התחתון עם איטום הסרט. הסרט כפי להשיגה מהיצרן בדרך כלל ללא עלות של מיקרואורגניזמים מבפנים הצד אשר צריך להיות ממוקם מול בתוך המכולה.
    4. מערבבים החול סטרילי עם מים מספיק סטרילי כדי להרטיב את זה מספיק את המקלות חול יחד. הסכום יהיה תלוי כמה יבשים החול הוא. בדרך כלל 10-35% של אמצעי האחסון של החול מספיקה. מניחים על החול הרטוב בתוך המיכל המאפשר עומק מספיק עבור אורך שורשים צורך ומספיק מרחב מעל החול לצמיחה של הצילומים. המרחק המדויק תלוי מינים, מגוון של הצמח בשימוש.
    5. זרעי הצמח.
      1. תעשה חור רדוד בחול עם מוט זכוכית סטריליים רק עמוק מספיק. כדי למקם את הזרע מתחת לפני השטח של החול (בערך 1-5 מ"מ). מקם את הזרע לתוך החור. לכסות אותה עם שכבה דקה של חול. חותם העליון של המיכל עם איטום הסרט כדי למנוע אובדן מים וכניסה של חיידקים נוספים.
      2. לגדל את הצמחים במעבדה תחת אור או בחממה הטמפרטורה המתאימה, אורך יום מינים, מגוון רחב של צמחים. עגבניות, אספסת או תודרנית לבנה להשתמש בטמפרטורת החדר ומחזורי/כהה 12 שעות.
    6. שותלים שתילים בתוך בור בחול (1-2 מ מ קוטר, עמוקה מספיק כי השורש יהיה מכוסה בחול). . תרחיב את החור עם מוט זכוכית סטריליים... מדריך השורש בזהירות לתוך החור בעזרת קרס הסרוגה מפלדת סטרילי ואם צריך למלא את צידי החור בחול.
  4. לחלופין, לגדל צמחים axenically או אגר המכיל תערובת מלחים כגון MS זלץ. שימוש יורה של צמחים axenic גדל אגר ישירות. הימנע שורשים גדל עם אגר כפי אגר ומודבקת על פני הצמח והן את החיידקים. זה עלול לגרום רושם מוטעה של הידבקות חיידקים פני הצמח.

2. הכנת חומר אחר הצמח

  1. רחץ חומר צמחי גדל בחממה עם מים לפני השימוש כדי להפחית את מספר החיידקים הילידים. יהיו חיידקים ופטריות על הצמחים. חד-תאיים יהיה להציג באדמה, על השורשים, ואולי גם על העלים. כביסה עם אקונומיקה או אתנול תשנה את פני השטח של צמח, לא מומלץ.
    1. אם לאחר כביסה מים מספרי משמעותי של החיידקים נשארים, מתייחסים הצמחים עם סבון ידיים נוזלי מדולל או לדלל מי חמצן (0.01%) כדי להסיר או להרוג את החיידקים. . זה בדרך כלל פחות נזק למפעל יותר אקונומיקה או אתנול.
  2. כאשר חומר צמחי שנרכשו בשוק המקומי, קשה decontaminate, לבחור חומר אשר לא נראה שהיו אחסון ממושך. הימנע חלקי של החומר, אשר מופיעים חום או פגום.
    1. לשטוף אותה עם מים ולעשות חתכים טריים על הקצוות של חומר אשר בעבר היה לחתוך לפני השימוש בו, אלא אם כן האינטראקציות של החיידק מבחן עם חיידקים (ואת פרוקריוטים) אשר צברו באתרים חתך הן עניין. לא לשטוף עם אקונומיקה או אתנול כפי שהם תשנה את פני השטח של צמח.
  3. לטפל בפצע אתרים. הפצע אתרים לעיתים קרובות לספק חיידקים גישה אל הפנים של הצמח גשמי18.
    1. לחסום או להקטין את הקובץ המצורף חיידקי, ותנועה דרך, פצע או חתך אתרים שנוצרו בהכנת החומר בטבילת הקצה חתוך בפרפין מומסת או על-ידי צביעה באתר עם שעווה מומסת בעזרת מברשת קטנה. אל תשתמש במרית או כל יישום חדה כמו זה עלול לגרום נזק הרקמה.
    2. חותם נובע צלקות על פירות כגון עגבניות עם פרפין. חיידקים מסוימים לשחות לתוך האזור תחת הפרפין, אך מספרם קטן בדרך כלל.
    3. אם הערך חיידקי לתוך הפצע אתרים מעניינים, הערכת המרחק חיידקים שיכול להזיז נישא על ידי זרמי מים או דיפוזיה על ידי התבוננות בתנועת צבע להוסיף את הפתרון. סימון תאי חיידקים על ידי החדרת גנים קידוד החלבון הניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוכם ולאתר אותם באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות המתוארים שלב 6.1.219.

3. הכנה של חיידקים

  1. מגדלים את החיידקים. שימוש בינוני המעריכה בצורה הקרובה ביותר את התנאים החיידקים נוטים להיחשף מיד לפני שנתקלת הצמח בעולם האמיתי מחוץ למעבדה. פחמן וחנקן מקורות כמו גם הנוכחות של יונים, קטיונים במיוחד דו ערכיים (Ca, Mg, Fe, Mn ו Zn) פוספט, וכן את ה-pH של המדיום חשובים.
    1. השתמש בינוני AB מינימלי או מרק לוריא tumefaciens א , חיידקים אחרים אדמה20. לשימוש e. coli, אשר עשוי לנבוע בבטן, מרק לוריא.
    2. להוסיף בינוני21inducers כגון שורש exudates או תמציות צמחים מסחרי כגון soytone או סוכרים כמו סוכרוז או xylose. אם חומרים אלה משמשים inducers, להוסיף ריכוז נמוך, כך למשל 0.01%. אם הם מקורות פחמן בשימוש, להוסיף ריכוז גבוה יותר, לדוגמה, 0.1%.
  2. הכינו את inoculum חיידקי. לדלל את החיידקים במים סטריליים או המדיום שבו הדגירה יבוצע ולהוסיף אותם לחומר הצמח. דילול המתאים נדון בשלבים 4.2 ו- 4.3.
    1. כדי להסיר את המדיה צמיחה לפני השימוש החיידקים, centrifuge את המתלים חיידקי ב g x 10,000 למשך 2 דקות, יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend את החיידקים על ידי vortexing אותם תוך המדיום אותו אשר ישמש עבור הדגירה עם החומר הצמח. שיטה זו עשויה להסיר או להפחית את מספר או כמות חומר חוץ-תאית, תוספות כגון exopolysaccharides, כמוסות, flagellae, ו/או pili. אם זה חשוב כי מבנים אלה פני השטח נותרו ללא פגע, ואז פשוט לדלל את החיידקים לפני מזריקים להם או להשתמש בשיטה חלופית שמתואר בשלב 3.2.2.
    2. כאמצעי חלופי כדי להסיר את מדיום הגידול, לאסוף את החיידקים על מסנן ניטרוצלולוזה או פוליקרבונט עם גודל הנקבוביות של 0.2 µm או פחות. רוחצים את החיידקים עם המדיום הדגירה את resuspend להם על ידי טלטול עדין או vortexing של המסנן במיכל סטרילי של המדיום.

4. חיסון של חיידקים

  1. לקבוע את מספר החיידקים כדי לקבל חיסון ביחס המדידה כדי לשמש כדי לקבוע אדהזיה חיידקי ואורך זמן הדגירה.
  2. עבור מחקרים מיקרוסקופיים שכללו הדגירה פעמים בפחות מיום 1 לחסן מספר גדול יחסית של חיידקים. מוסיפים כמות של תרבות להגיע ריכוז חיידקי הסופי של יותר מ- 106 חיידקים לכל mL. משכי זמן ארוכים יותר הדגירה להקטין את גודל inoculum חיידקי.
  3. עבור מחקרים שבהם אדהזיה חיידקי שהריווח נמדד על ידי ספירת קיימא, להוסיף כמות של תרבות להגיע ריכוז חיידקי הסופי של 103 לחיידקים6 10 לכל mL.
  4. הימנע הוספת חיידקים רבים כי חילוף החומרים שלהם משתנה ריכוז ה-pH או חמצן במדיום הדגירה. מודדים pH באמצעות נייר pH או אלקטרודה. למדוד ריכוז חמצן באמצעות אלקטרודה חמצן.
  5. עבור הצמחים גדלו בחול, לחסן בשלוש דרכים אפשריות.
    1. לחסן את הזרע עם החיידק לפני השתילה למסמס את הזרע עבור 1 דקות בהשעיה במים של חיידקים6 כ-10 לכל mL.
    2. לחסן את השורש על ידי הנבטת שתילים axenic כפי שמתואר בסעיף 1, כאשר השורש שתיל הוא בערך 1 ס"מ טובלים אותו או הצבת כל שתיל השעיה של חיידקים6 10 לכל מ ל מים 1 דקות.
    3. לחסן חול על ידי ערבוב החיידקים עם החול לפני השתילה לתת ריכוז סופי של חיידקים3 כ-10 לכל mL או השקיית שתיל עם השעיה של חיידקים6 10 לכל mL לאחר השתילה.

5. דגירה של החיידקים עם החומר צמח

  1. עבור הדגירה בתקשורת נוזלי, דגירה החיידקים עם החומר הצמח במים סטריליים או סוכרוז ו מינרלים מלחים או לשתול רקמות תרבות בינוני (כגון 1:10 דילול של מלחי MS)22,23.
    1. השתמש מכולה אשר אינן מתיישבות החיידקים. נסו לשמור על פני הצמח מכוסה ברציפות על-ידי צלילה או עצבנות עדין. עצבנות נמרצת עשויה למנוע הידבקות או אפילו להסיר חיידקים פני הצמח.
    2. לבחון את חומר צמחי במיקרוסקופ אור לאחר משתנה מרווחי זמן כדי לקבוע מתי להפסיק הדגירה, לבצע מדידות. קורס זמן של אדהזיה היא לעתים קרובות ערך עם דגימות שנלקחו כל h 1 עד 4 או כל יום בהתאם למהירות של האינטראקציה.
  2. כדי דגירה בחול, החל שאותם שיקולי המתוארות עבור הדגירה במדיום נוזלי בשלב 5.1.

6. מדידת אדהזיה באמצעות מיקרוסקופ

  1. לבצע מדידות מיקרוסקופיות עם אופטיקה Nomarski או שלב-ניגודיות כדי להקל על הצפייה של החיידק על משטחים. עם זאת, ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ שדה בהיר עם הגדלה של 20 X ומעלה.
    1. להשתמש תצפית מיקרוסקופית כדי לקבוע אם החיידק אקראית מבוזרת או ממוקם אתרים ספציפיים. גם לבדוק הם מחויבים ביחידים או באשכולות. חפשו את הנוכחות של microcolonies מציעה התפתחות חיידקים או מלכודת לאחר הידבקות. בדוק אם החיידק נראה יוצרים ממבנה biofilm על פני השטח.
      הערה: ממבנה biofilm הוא מספר רב של חיידקים שמאוגד אל פני השטח, מוקף24,23,25מטריצה חוץ-תאית. המבנה עשוי להיות חלק ובעל מראה אחיד או ארכיטקטורת יותר מסובך. שיטות לימוד biofilms המשויך משטחי המפעל כבר מתואר17.
    2. השתמש חיידקים עם סמן פלורסנט התגית. אם חיידקים אחרים קיימים חיידקים עניין מזוהים באמצעות תגית פלורסנט כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, להשתמש פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי לקבוע הנוכחות של החיידק מתויג אשכולות של חיידקים26. עבור ה-GFP, השתמש במסנן עם 490 nm עירור, 520 פליטה ננומטר.
      1. בדוק כי תגית פלורסנט הוא לא להשפיע לרעה את החיידקים על ידי התבוננות הדבקות חומר axenic של תערובת שווה של פראי סוג חיידקים ובקטריות מתויג של המתח אותו באמצעות אופטיקה Nomarski והן על ידי קרינה פלואורסצנטית. אם החיידק פלורסנט וחשוך באופן אקראי מעורב ובהווה במספרים שווים התג לא התערבו עם וזמינותו.
  2. לקבוע את מספר החיידקים המצורפת.
    הערה: קשה מאוד לקבוע את מספר החיידקים המצורפת במיקרוסקופ. כאשר הכריכה הוא אל משטחי המפעל לא סדיר, זה בדרך כלל לא ניתן לקבל מדידה כמותית. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (לא נדון במאמר זה) ניתן לבצע מדידות כאלה.
    1. כאשר החיידק מאוגדים משטח חלק כגון שיער שורש, לספור את מספר החיידקים מאוגד על הקצה של שורש השיער לכל אורך שיער השורש מ מ. לטפל כדי להשתמש שערות השורש של בערך באותו הגודל וצורה בהשוואה בין מדידות.
    2. כדי לקבוע את גודלו של אובייקטים במיקרוסקופ, להשתמש שקופית מסחרי עם סימנים נמדד על זה. להתבונן, לצלם בשקופית זו-באותן ההגדרות כמו משמש החומר ניסיוני ולהשתמש את התמונות המתקבלות כדי לקבוע את גודלו של אובייקטים photomicrographs.
  3. להכין את הדגימה במיקרוסקופ.
    1. לשטוף את הדגימה. להעביר את הדגימה טיפת מים או הדגירה בינוני בשקופית מיקרוסקופ, התבוננו בו ישירות.
      הערה: זה יש יתרון כי אם היה ללא התפתחות חיידקים או חיידקי מוות שם צפויים להיות חיידקים חינם רבים. לקחת את ההעדר של חיידקים חינם כאות אזהרה כי אולי היו מוות חיידקי או חיידקי מחייב המיכל שבו בוצע הדגירה. השפעת נטילת הדגימה מוצג באיור1.
    2. לשטוף את הדגימה בעדינות במדיום מים או דגירה על-ידי הצבת זה בקבוקון של נוזל, היפוך המבחנה בעדינות. אז במקום המדגם על השקופית מיקרוסקופ בנוזל טריים להשגחה.
    3. הר המדגם בנוזל שימוש רגילה כיסוי וגלוש מיקרוסקופ.
      1. אם המדגם הוא עבה ולכן יעשה בליטה מתחת בתגית לכסות, השתמש תגית הכיסוי press-apply. אלה שער גולשת יש טבעת גומי או פלסטיק סביב הקצה בתגית כיסוי. למקם את הדוגמה של נוזלים בתוך הבאר בתגית כיסוי למקם את השקופית למעלה ואז לחץ כלפי מטה בעדינות כדי לאטום בתגית כיסוי לשקופית. היפוך ולבחון.
      2. לחלופין להשתמש אצה ספירת שקופיות, מכסה בצורה דומה. שימו לב: שקופיות עם עומק הזה לא יכול להיבדק באופן כללי עם עדשת המטרה של יותר מ 20 X הגדלה.

Figure 1
איור 1 : שלבים בהכנת מדגם לקביעת מספר חיידקים מאוגד. כריכת tumefaciens א שערות השורש עגבניות (A, B ו- C), חוטי ניילון (D, E ו- F). הדגימות רכוב במים ללא שטיפה שניהם מאוגד חיידקים (חיצים שחורים), חיידקים חינם (החצים הלבנים) ניתן לראות (A ו- D). לאחר כביסה שמאוגד החיידקים נשארים אבל החיידק חינם הם כבר לא מציגים (הפריצה). לאחר sonication החיידק מאוגד הוסרו מהמשטח מדגם (C ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. אם חיידקים פלורסנט שימשו, לבחון את הדגימה במיקרוסקופ לאחר החול הוסר. שורשי הצמחים גדלו בחול הם בדרך כלל לא מתאים מיקרוסקופ, כמו חלקיקי חול להפריע התצפית של החיידקים.
    1. הסר את הצמח מיכל גדילה לפי שלב 7. מקם את השורשים בתוך מיכל מים ומערבבים בעדינות כדי להסיר את החול השוקעים בתחתית המיכל.
    2. הסר את המפעל מן המים כביסה והר המדגם כמו שלב 6.3.3.

7. מדידת אדהזיה באמצעות הנייד קיימא נחשב

  1. לקבוע את המספר של קיימא חיידקים המצורף באמצעות של sonicator.
    1. להסיר את החיידקים לא מאוגד. מקם את הדגימה בקבוקון עם מספיק מים, שטיפת בינוני מאגר או הדגירה כדי לכסות את חומר צמחי, להפוך את המבחנה מספר פעמים.
      1. אם היו יותר מ- 103 חיידקים חינם לכל mL נוכח הדגירה הראשונית, לבצע כביסות רציפים כדי להסיר את כל אחד מהם. בדוק במיקרוסקופ אור (ראה שלב 6.3) כדי לקבוע הנוכחות של חיידקים חינם.
      2. לשטוף עד שיש צמצום משמעותי במספר של חיידקים בחינם אבל צריך לזכור כי יש איזון בין חיידקים המאוגדים והלא מאוגדים אז מספר החיידקים חינם מעולם לא עלולה להפחית לאפס.
    2. הסר את הדגימה בקבוקון כביסה נוזלי עם מלקחיים או מרית.
    3. לקבוע את מספר החיידקים המאוגדים ב- incubations של צמחים בנוזל.
      1. להשעות את הדגימה שטף בבקבוקון, לכסות אותו. עם נפח מדודה של מים, דגירה בינונית או מאגר כביסה. השתמש נוזלי מספיק כדי לכסות את הדגימה. הכנס את המבחנה sonicator אמבטיה, sonicate אותו על מין אחד.
      2. להסיר את הדגימה ונבדוק את זה תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע אם החיידק מאוגד הוסרה מן הצמח. הסרת חיידקים מן מדגם sonication מוצג באיור1. אם יש עדיין כרוך חיידקים נוכח המשך sonicating הדגימה עד כזה עם הזמן, כי אין בקטריות מאוגד נשארים על המשטח מדגם. אם לא ניתן להסיר את החיידקים המאוגד על-ידי sonication, להוסיף חול קוורץ עקר 1-10 מ"ג/מ"ל וחזור sonication ובדיקה מיקרוסקופית.
      3. לקבוע כי ההליך sonication המופיע היעיל ביותר בשלב 7.1.3.2 אינו מפחית את הכדאיות של החיידקים על ידי השעיית חיידקים מתרבות נוזלי בפתרון שישמש עבור sonication (הוספת חול קוורץ, אם זה היה הכרחי). לקבוע את ספירת התאים קיימא. Sonicate החיידק ולקבוע את ספירת התאים קיימא שוב.
        הערה: אם יש ירידה בספירת תאי בת קיימא, לשנות את ההליך על-ידי שינוי ההרכב של הזמן נוזל ו/או sonication עד הטיפול אינו משפיע על ספירת התאים קיימא.
      4. לקבוע כי המאגר דילול המשמש עבור ספירת קיימא אינו משפיע על הכדאיות של חיידקים אשר יש כבר מתפשט בתנאים בשימוש על-ידי השוואת תא קיימא ספירת עשה שימוש שונה דילול מאגרי ו/או מים.
  2. לקבוע את המספר של קיימא חיידקים המחוברים באמצעות המגון.
    1. מקם את הדגימה מרגמה סטרילי או בלנדר או התקן אחר המגון. . לכסות את זה עם נפח מדודה של מים סטריליים, דגירה בינונית או שטיפה מאגר27 השתמש נפח מספיק לכסות את הדגימה. לשימוש בבלנדר 100 מ.
    2. לטחון את הדגימה ובודקים אותו הוא טוב. בדוק את ה-pH לאחר המגון כדי לוודא כי חומצה שוחררו רקמת הצמח לא גרמה ירידה חדה ב- pH מתחת ל7. אם ה-pH ירד להשתמש בופר כמו מאגר פוספט בתוך הנוזל המגון כדי לשמור על רמת ה-pH.
    3. לקבוע את ספירת התאים קיימא.
  3. השתמש חיידקים שמסומנים עמידות לאנטיביוטיקה.
    1. במצבים בהם קיים סוג אחד או יותר של חיידק, לסמן זני חיידקים באמצעות התנגדות ספונטנית אנטיביוטיקה (בדרך כלל ריפאמפיצין, חומצה nalidixic).
      1. לקבוע את רמת של אנטיביוטיקה לשימוש. אם תרבויות אחרות האורגניזמים צפוי להיות נוכח הדגירה זמינים, צלחת תרבויות אלה גדלו בתנאים של הדגירה המיועד עם צמחים על צלחות המכיל מגוון של ריכוזים של הנבחרת לאנטיביוטיקה. לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר אשר אינו מאפשר צמיחה של כל האורגניזמים. זהו הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שבה החיידק המבחן צריך להיות עמיד.
      2. להשיג ספונטנית מוטנטים עמידים בפני אנטיביוטיקה. לגדול תרבות של החיידקים בינוני עשיר יומן מאוחר או שלב נייח. צלחת מדולל לצלחת המכילה אנטיביוטיקה הרצוי-הריכוז המתאים 0.1 מ"ל. לקבוע ריכוז לשימוש כפי שמתואר בשלב 7.3.1.1. תמשיך ולטהר את החיידקים אשר גדלים, ולכן הם עמידים בפני האנטיביוטיקה.
      3. לקבוע כי עמידות לאנטיביוטיקה ואינו מקטין את הצמיחה של החיידקים על-ידי ביצוע עיקול צמיחה בינוני נוזלי של האב, זנים עמידים לאנטיביוטיקה. לקבוע כי חיידקים עמידים בפני אנטיביוטיקה להראות באותה הרמה של קולוניזציה של חומר צמחי axenic כמו המתח האב, אם זה אפשרי.
  4. לקבוע את מספר החיידקים קיימא מאוגדים הצמחים גדלו בחול.
    1. הסר את הצמח מיכל וחול. כדי להסיר צמחים מכולות, להסיר תחילה את חומר האטימה בחלק העליון והתחתון של הגורם המכיל. הצב את המכולה על פיסת נייר סטרילי ולהסיר בעדינות את כולו חול או אדמה ואת המפעל בתור אחד גליל מחודדות גדולות על ידי דפיקות בעדינות את המיכל נגד משטח כדי לשחרר את החומר.
      1. במידת הצורך, השתמש מרית או מוט כדי לשחרר את החומר בקצוות נכנס דרך החלק התחתון של המיכל.
    2. כאשר הצילינדר של חול או אדמה המכילים את הצמח חינם על הנייר, נתחלק באמצע כדי לגלות את שורש הצמח. אם רצונך בכך, לקחת דגימות של החול מ סמוך לקצה של המכולה, כמו גם ליד הבסיס. זה עשוי להיות שימושי כדי לקבוע את התפשטות (ואת הצטברות וצמיחה) של החיידק.
    3. למדוד את האורך של השורש. לאסוף את השורש ולהסיר את חול ובקטריות הקפדה באופן רופף על השורש (החומר rhizosphere) על ידי טבילה לשורש נפח מדודה של מים או מאגר וניער אותו בעדינות. לקבוע את ספירת התאים קיימא של חיידקים הנוצרת ההשעיה על ידי ציפוי מדיום מתאים כגון לוריא אגר. זה מייצג את מספר חיידקים הקשורים באופן רופף עם השורש.
  5. להסיר את החיידקים בחוזקה מאוגד על-ידי sonication ולקבוע את המספרים שלהם כפי שמתואר בשלב 7.1.
  6. לחלופין, כדי לקבוע מיקום הבסיס של החיידק בחוזקה מאוגד למקם השורש שטף על פני צלחת פטרי המכילה אגר מזין או מדיום מתאים אחר. לבחון את המיקום של מושבות חיידקים על השורש בימים 3 באמצעות זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ ויבתר.
  7. מבטאים את תוצאות כמו מספר חיידקים לכל צמח, לכל ס מ2 של פני השטח, לכל אורך השורש ס מ או לפי משקל גרם טריים של רקמות. לעשות משכפל מרובים באותו יום, גם משכפל בימים שונים באמצעות תרביות חיידקים שונים, שונים והרבה חומר צמחי.

8. קביעת אם השפעה של דגירה תנאים על הדבקות היא עקב תגובה של החיידק או הצמח

  1. שימוש בחומרי צמח מת או נהרג.
    1. נושא את הצמח גשמי למגוון רחב של כימיקלים, כתות ומייצבים או טיפולים אחרים כגון חום על מנת להרוג אותו. לשטוף את החומר צמח ביסודיות במדיום מים, דגירה לאחר השימוש של כל הטיפולים האלה. ואז לחסן את החיידקים. . זה לא יהרוס את פני השטח של צמח אבל זה יגרום סמויה פעיל כך זה יכול להגיב על החיידקים.
    2. למדוד אדהזיה חיידקי כמתואר בצעדים 6 או 7. גם לקבוע את מספר התאים קיימא הוסיף אינקובציית החומר הצמח בתחילת הדגירה ולאחר מספר התאים קיימא נוכח בסוף הדגירה כדי להבטיח כי כימיקלים רעילים לא נכחו בזמן הדגירה.
  2. השתמש בחומר דומם.
    1. ההקפדה חיידקי שימוש בחומר דומם כדי לקבוע אם אפקט ראיתי על הדבקות חיידקים לשתול חומר הוא השפעה על הצמח או החיידקים. לבחור של חומר דומם אשר מאגד החיידקים, בדומה הצורה והגודל חומר צמחי למד. האפשרויות כוללות מסנן המסמכים של כל סוגי (תאית, ניטרוצלולוזה, פיברגלס, לוחות פוליקרבונט, וכו '), הליכי משנה (ניילון, כותנה, פוליאסטר, צמר זכוכית, וכו '.), זכוכית או פלסטיק coverslips, פלדת אל-חלד קופונים ואת דיאליזה ממברנות.
    2. לשטוף את החומר הדומם ביסודיות בתוך מים, המדיום שבו הדגירה יבוצע ולחטא אותו לפני השימוש. רוב החומרים ברשימה בשלב 8.2.1 יציבים כדי עיקור על-ידי autoclaving.
    3. דגירה החומר הדומם המוליד תחת התנאים הרצויים והניקוד כפי שתואר בשלבים 6 ו- 7. דוגמה של השימוש של חוטי ניילון כדי לקבוע כי מתבצע האיגוד מופחתת של tumefaciens א ל שערות השורש בריכוזים סידן גבוהה (לפחות בחלקו) כדי השפעה של סידן על החיידק מוצגת באיור 428.

Representative Results

א tumefaciens והצנרות שורש משטחים. על מנת לקבוע אם ייצור חיידקי תאית ממלאת תפקיד שורש קולוניזציה, ההשפעות של מוטציות חיידקי אשר למנוע תאית סינתזה היו בחן16. מהטכניקות שתוארו בשלבים 1.3 ו- 7.1 שימשו. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים סטריליים. כאשר השורשים היו כ 2 ס מ היו טבול השעיה של חיידקים5 10 לכל mL, נטועים בקרקע מפוסטר במיכלים. הצמחים היו בוגרים למשך 14 ימים ב- 25 ° C על 12 שעות אור/12 h מחזור כהה. לאחר הצביעו פעמים הצמחים הוסרו מן המכולות. השורשים היו נשטפים, sonicated ב sonicator אמבט להסרת חיידקים מאוגד. מספרים חיידקי היו נחושים באמצעות ספירת קיימא. איור 2 מציג את ההשפעה של שתי מוטציות תאית-חיסור שונים על היכולת של החיידקים לישוב עגבניות שורשים. למרות סטיות תקן של כמה מדידות גבוה ככל 0.9 כניסה10 (בעיה נפוצה עם סוג זה של מדידה) צמצום באיגוד המוטציות תאית-חיסור עולה בבירור, נוכל להסיק כי ייצור חיידקי תאית מסייעת החיידקים הקולוניזציה של עגבניות שורשים.

Figure 2
איור 2 : שורש קולוניזציה לפי סוג הפרוע תאית-חיסור מוטציות של tumefaciens א. יומן10 המספר הכולל של חיידקים לכל ס מ אורך הבסיס התאוששה עגבניות שורשים מחוסן עם פראי סוג tumefaciens א זן C58, מוטציות תאית-מינוס C58:1 ו- C58:A60. המספרים המוצגים הם אמצעי לפחות ארבעה ניסויים נפרדים. ברים מצביעים על סטיות תקן של האמצעים. שורשים חוסנו בטבילת אותם בהשעיה של חיידקים5 10 לכל mL במשך דקה אחת. הצמחים גדלו במיכלים, החיידקים באופן רופף חסיד הוסרו על ידי שטיפת השורשים ב שטיפת מאגר בקבוקון זכוכית. חיידקים חסיד הדוק הוסרו באמצעות sonicator אמבטיה וכתוצאה מכך התליה מצופה כדי לקבוע תא קיימא נחשב16. איור זה השתנה מ Matthysse ו McMahan. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תפקידו של exopolysaccharides באיגוד של e. coli , חיידקים אחרים כדי נבטי אלפלפה נבדק. כמה התפרצויות של מחלת diarrheal עקב e. coli O157:H7 יש כבר לייחס נבטי אלפלפה מזוהמים. איגוד של פראי-סוג חיידקים, מוטציות לא מצליח לעשות exopolysaccharides שונות נמדדה באמצעות השיטות המתוארות שלבים 1.1, 5.1 ו- 7.2. נבטי אלפלפה היו פני מחוטא, מונבטים ליום אחד במים סטריליים 25 ° c בחושך. נבטים 4 עם מעילים הזרע מצורף הונחו במנות פלסטיק סטרילית, המכיל 5 מ ל מים. חיידקים גדל מרק לוריא נוספו ריכוז סופי של 5 x 103 לכל mL. נבטים חוסנו היו הדגירה 25 ° c בחושך למשך 3 ימים. הנבטים היו לשטוף פעמיים ב 5 מ ל מים סטריליים בקבוקון על-ידי היפוך נמרצת, הומוגני ב שטיפת המאגר באמצעות מהמגן זכוכית מבוססת על מנוע של טפלון. ניסויים קודמים באמצעות חיידקים שמסומנים פלסמיד נושא גן ה-GFP הראה אין בקטריות למביטה למרות משטח חיידקים נצפו בקלות. התוצאות מוצגות בטבלה1. נבדקו שני זנים של החיידק O157:H7. לשני הזנים הופיעה הייצור של poly-β-1, 6-גלוקורונית acid(PGA) כדי לבצע את התרומה הגדולה הכריכה של פתוגניים החיידק לשתול משטחים. שטיפת המעי הגס חומצה גם מילא תפקיד משמעותי באיגוד. בזמן הירידה מחייב בתאית-חיסור מוטציות היה משמעותי לא היה גדול כמו זה עבור שני סוכרים אחרים.

ההשפעות של מוטציות בגנים הפקה Exopolysaccharide על כריכה של אי O157:H7 קולי כדי נבטים ומעילים זרע פתוח
זן חיידקי מוטציה או גנוטיפ (רלוונטי פנוטיפ) יומן מספר10 של חיידקים מאוגד לכל נבט או זרע המעיל
נבטי אלפלפהb מעילים זרע פתוח
86-24 אף אחד (סוג הפרוע) 4.7 ± 0.6 5.6 ± 0.2
8624N yhjN (תאית-מינוס) 2.9 ± 0.7c 3.5 ± 0.6c
8624C wcaD (חומצה חוקן-מינוס) 1.8 ± 0.7c 2.4 ± 0.5c
P 8624 pgaC (PGA-מינוס) < 1.0c ± 1.0 1.0c
DEC4A אף אחד (סוג הפרוע) 5.6 ± 0.2 6.1 ± 0.3
DEC4AN yhjN (תאית-מינוס) 4.8 ± 0.8d 4.1 ± 0.8d
DEC4AC wcaD (חומצה חוקן-מינוס) 3.9 ± 0.5c 4.8 ± 0.8d
DEC4AP pgaC (PGA-מינוס) < 1.0c 1.2 ± 0.7c
זאת אומרת ± סטיית תקן של מינימום של שלוש מדידות של המספר (יומן10) של חיידקים מאוגד לאחר 3 ימים.
b נבטים נשטפו לפני המדידה.
c שונה באופן מהותי מן הסוג הפרוע: P < 0.01.
שונה באופן משמעותי מן הסוג בר d: P < 0.05.
טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.

טבלה 1: ההשפעות של מוטציות בגנים הפקה exopolysaccharide על הכריכה של E. coli O157:H7 כדי נבטים. על מנת לקבוע את התפקיד של exopolysaccharides השונות ליפופוליסכריד באיגוד של פתוגניים החיידק זנים O157:H7 כדי נבטי אלפלפה, הכריכה של קבוצת מוטציות נבטים, מעילים זרע פתוח נבדקה באמצעות השיטות תיאר בשלב 6. התוצאות הראו כי פולי-ß-1, 6 -N-acetyl-D-גלוקוזאמין (PGA) שנראה חיוני מחייב נבטים, כי חומצה תאית והן colanic נדרשים עבור איגוד המרבי של e. coli O157. טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.

על מנת לקבוע אם הייצור של PGA הוא מספיק כדי לגרום את איגוד חיידקי לשתול משטחים, פלסמיד (pMM11) נושאת את אופרון משובטים קידוד הגנים הדרושים עבור PGA ייצור הוכנס שני חיידקים שונים אשר לא בדרך כלל תוכל לאגד עגבניות שורשים10. Tumefaciens א A1045 הוא מוטנט של המתח פראי סוג C58 אשר נכשל ביצירת גלוקן מחזורית-β-1, 2, נכשל גם לאגד לשתול משטחים29. Sinorhizobium meliloti 1021 המהווה פקעיות על אספסת נכשל לאגד ללא קטניות כולל עגבניות12. השיטות המתוארות שלבים 1.1, 5.1, 6.3 ו- 7.1 שימשו כדי לקבוע אם היכולת לגרום PGA בדרך כלל מוגברת איגוד חיידקי שורש משטחים. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים סטריליים. שורשים היו חותכים למקטעים 1 ס מ אורך והושמו במים סטריליים, החיידקים חוסנו. ככל ששני המינים האלה של חיידקים גדלים בקצב שונה, איגוד נמדדה בזמנים שונים כדי לאפשר שווה בערך כמויות של התפתחות חיידקים. הנוכחות של pMM11 פלסמיד נגרמת עלייה משמעותית דומה במספר של חיידקים מאוגד של שני מינים (טבלה 2)10. עלייה משמעותית באיגוד נראתה גם במיקרוסקופ אור אך האיגוד היה מאוד שונה אצל שני המינים (איור 3). Tumefaciens א A1045 מאוגדים כמו בודדים חיידקים פני השורש. Meliloti ס מאוגדים באשכולות גדולים שבהם רק אחדים של החיידק היה מחובר ישירות לספריית הבסיס של רוב החיידקים צורפו לחיידקים אחרים. דוגמה זו מראה כי פשוט לנתח את המספרים של חיידקים מאוגדים ללא כולל תצפיות מיקרוסקופיות יכול לתת רושם מטעה של תוצאות ניסוי. למרות שתי השיטות (ספירת קיימא ותצפיות מיקרוסקופיים) להציג שאת pMM11 מוגבר מחייב חיידקי לשורשים עגבניות, סוג הכריכה הנגרמת על ידי הייצור של PGA היה שונה אצל שני המינים חיידקי10.

השפעת pMM11 פלסמיד על איגוד של החיידק לשורשים עגבניות
זן חיידקי פלסמיד מספר החיידקים מאוגד לכל אורך השורש מ מ
א tumefaciens A1045 אף אחד 0.25 x3 10 ± 0.25 x 103
pBBR1mcs (וקטורית) 0.25 x3 10 ± 0.25 x 103
pMM11 (סינתזה PGA) 10 x 10-3 -± 0.25 x 10-3
ס meliloti 1021b אף אחד אף אחד לא זיהה
pBBR1mcs (וקטורית) אף אחד לא זיהה
pMM11 (סינתזה PGA) 50 x 10-3 -± 5 x 10-3
איגוד חיידקי, נמדדה לאחר שעתיים
b איגוד חיידקי היה מדד אחרי 18 שעות
טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.

בטבלה 2: השפעת פלסמיד נושא הגנים לסינתזה של PGA על הכריכה של Tumefaciens א A1045, meliloti ס 1021 אל פלחי עגבניה שורש. כדי לבחון את היכולת של פולי-ß-1, 6 -N-acetyl-D-גלוקוזאמין (PGA) כדי לקדם את הכריכה של חיידקים לטעת שורשים, השפעת פלסמיד היוועצות היכולת לגרום PGA (pMM11) על הכריכה של שני זנים של חיידקים הקשורים צמח עגבניות שורשים נבדק. גם זן של חיידקים הראו משמעותי מחייב לשורשים עגבניות בהיעדרו של פלסמיד או בנוכחות של פלסמיד ללא הגנים קידוד PGA סינתזה (pBBR1mcs). התוספת של פלסמיד נושא הגנים סינתזה PGA גדל לכריכה על ידי שני סוגי חיידקים. כי tumefaciens א גדל מהר יותר meliloti ס מחייב נמדדה אחרי שעתיים של דגירה עבור tumefaciens א ואחרי 18 h עבור ס meliloti. הטכניקות בשימוש הם מהמתואר בשלב 7. טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.

Figure 3
איור 3 : השפעת pMM11 פלסמיד נושא הגנים ביוסינטזה PGA על הכריכה של A1045 tumefaciens א ו ס meliloti 1021 כדי שערות השורש עגבניות. A1045 tumefaciens א מחייב עגבניות שערות השורש של A), B) A1045 tumefaciens א pMM11, C) meliloti ס 1021, ו- D) pMM11 ס meliloti 1021. למרות העלייה קשירה של שני המינים חיידקי הוא בערך דומה בפרטים של האיגוד כפי שנראה במיקרוסקופ אור מעט שונים. הטכניקות בשימוש הם מהמתואר בשלב 6. איור זה השתנה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

זה לפעמים ניתן להשתמש מחייב הלא-ביולוגיים משטחים לסייע בהבחנה התרומה של החיידקים, של הצמח באינטראקציה מסוימת. Polysaccharide(UPP) unipolar של tumefaciens א הוכח כדי להיות מסוגל לתווך איגוד חיידקי למגוון של שני משטחים ביולוגי, הלא-ביולוגיים30. הסידן נצפתה כדי לעכב את הכריכה של tumefaciens א לשתול משטחים בתיווכו של UPP28. על מנת לקבוע עיכוב על ידי יונים של סידן של איגוד חיידקי לשתול משטחים עקב אפקט על החיידק או על פני הצמח, נבחנה הכריכה של חיידקים חוטי ניילון. הטכניקות מתאר בשלב 8.2 שימשו. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים כפי שמתואר בשלב 1. החיידקים היו גדל בינונית מזערי עם סוכרוז, להוסיף עגבניות שורשים או חוטי ניילון-ריכוז סופי של 10 /mL5כפי שמתואר בשלב 5.1. השפעת CaCl הוסיף2 על איגוד חיידקי עגבניות שורשים, חוטי ניילון נבדק במיקרוסקופ. איור 4 מראה של עיכוב דומה של איגוד על ידי סידן באמצעות או משטח רומז ההשפעה של סידן היא בעיקר על חיידקים10.

Figure 4
איור 4 : ההשפעה של סידן על הכריכה של tumefaciens א שערות השורש עגבניות, חוטי ניילון. Tumefaciens א , נדגרה עם שורשים עגבניות (A ו- B) או חוטי ניילון (C ו- D) במשך 24 שעות ביממה ב- 1:10 דילול של מלחי MS ו- 1:20 דילול של AB בינונית מזערי, 0.4% סוכרוז (A ו- C) או ב- 1:10 דילול של מלחי MS ו- 1:20 לדילול בינונית מזערי אלב , 0.4% סוכרוז המכיל 60 מ מ CaCl2 (B ו- D)31. CaCl הוסיף2 עכבות איגוד חיידקי שורשים והן חוטי ניילון רומז כי עיכוב היה בעיקר בשל אפקט על החיידק ולא על השטח המפעל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

חשוב להיות מודעים כל של משטחים שעליהם חיידקים יכולים לדבוק במהלך הניסוי. לפיכך חיידקים המסוגלים מחייב זכוכית יכול לזלזל אם קיימא תא ספירת נעשים באמצעות צינורות זכוכית ופיפטות. אם הצמחים גדלים ב אגר או אדמה וחלק אגר או אדמה נשאר על הצמחים ואז החיידק עלול להיקשר לחומר adhering, ולא את הצמחים. מצד שני, נטילת משטח המפעל, במיוחד במקרה של שורשים, יכול להסיר את ציפוי פני שטח טבעי כגון ריריות ובכך לשנות את התוצאות של בדיקות הדבקות.

חשוב להיות בטוחים כי החיידק מוסיפים את הדגירה יישארו בחיים במהלך הניסוי. לכן ספירת קיימא של חיידקים חינם, כמו גם המצורף באופן שגרתי לבצעו. כמה טיפולים או מוטציות חיידקי עלולה להפחית את קצב התפתחות חיידקים או באמת לגרום למותו של שבריר של האוכלוסייה חיידקי. חיידקים מתים וחיים לא ניתן להבדיל במיקרוסקופ אלא אם כתמי מיוחדים משמשים. יש ערכת הכתם שימושי עבור חיידקים חיים/מתים אשר תלויה החרגה של צבעי מן החיידקים החיים. אם קיימת אוכלוסייה מעורבת של חיידקים ואז ספירת קיימא המינים של ריבית זאת, עשוי להיות השיטה הקלה ביותר לקבוע אם הדגירה הביאה מוות חיידקי.

קומפוזיציה בינונית השפעה הישרדות חיידקי וצמיחה. שורש תפליט וחומרים שוחרר מן הפצע ולחתוך אתרים תספק המצע לתמוך צנוע התפתחות חיידקים. פוספט, חנקן ו ברזל נוטים להיות הגבלת בתנאים אלו. קטיונים דו ערכיים כגון סידן ומגנזיום עשויים להשפיע אדהזיה. בחלק מהמקרים מקור פחמן יכול להשפיע על הדבקה. pH גם בענייני. באופן כללי ה-pH של rhizosphere הוא בין 5.5 ו- 6.5.

יש להיזהר בשימוש חיידקים שמסומנים עמידות לאנטיביוטיקה. האנטיביוטיקה הנפוצים ביותר הם ריפאמפיצין וחומצה nalidixic. עמידות לאנטיביוטיקה אלה בדרך כלל עקב מוטציות בגנים כרומוזומלית (RNA פולימראז ו gyrase, בהתאמה), ולכן לא בקלות ניתן להעביר לאמץ עוד בתקופת הדגירה. סוג זה של התנגדות גם לא תוצאה של השפלה או שינוי של האנטיביוטיקה. סימון חיידקים עם סמן גנטי בעקיצות פלסמיד אינו מומלץ אלא אם לא ניתן להעביר את פלסמיד לחיידקים אחרים. ההתנגדות לאנטיביוטיקה אסור עקב השינוי השפלה או כימית של האנטיביוטיקה כמו חיידקים רגישים לאנטיביוטיקה יוכלו לגדול על צלחות אנטיביוטי אם הם ממוקמים קרוב חיידקים עמידים.

בשיטות המתוארות במאמר זה שימושיים עבור גודל מדגם קטן ו/או ניסויים שבו הדגימות צריך להיות כלול (לדוגמה, בניסויים המערבים פתוגנים אנושי). במדגמים גדולים (מעל 100 גרם של חומר או צמחים יותר מ-50) בשיטות אחרות או שינוי דרסטי של שיטות אלה יהיה צורך10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. הנוכחות של מספרים גדולים של מיקרואורגניזמים חוץ המין נחקר יכול גם להוות בעיות משמעותיות. פתרונות אפשריים כוללים את השימוש חיידקים מסומן עם חלבון פלואורסצנטי או עמידות לאנטיביוטיקה, כפי שתואר בשלבים 6.1.2 ו- 7.3. עם זאת, כאשר החיידק עניין הם אנשים נדירים בקרב אוכלוסיה גדולה של מיקרואורגניזמים אחרים סמנים אלה לא ניתן מספיק כדי לאפשר הערכה ברורה וחד משמעית של המספרים של החיידק נחקר.

כל אחת מהשיטות המתוארות כאן הן שיטות מעבדה מבוסס. שינויים מזעריים יידרש ללימודי החממה. שינויים נוספים צפויים להיות הנדרשים ללימודי שדה שבו חד-תאיים, חרקים, בעלי חיים אחרים טריפה והאקלים וריאציה לסבך את מתן תנאים שהוגדרו עבור הניסויים. בעתיד שיטות אלה יורחב לכלול פעולת הגומלין בין שני אורגניזמים על פני הצמח.

Disclosures

המחבר מצהיר שיש לה אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

המחבר תודה סוזן ויטפילד הכנה של דמויות, קמיל מרטין, הילארי Samagaio לקבלת סיוע בחלק מהניסויים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
light microscope any N/A phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.
seeds any  N/A make a note of the seed lot number and the cultivar
bleach any N/A
bath sonicator any scientific supply company N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
nutrient agar  Difco  001-01-8
soytone Difco  24360
Sand sea sand Fisher Scientific S25
sand  Sigma-Aldrich S9887
conetainers Stuewe & Sons, Inc. Ray-Leach cone-tainers many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow
parafilm any scientific supply company N/A
MS salts Sigma-Aldrich M5524
parrafin any N/A
centrigfuge any scientific company N/A to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed
vortex mixer any scientific company
micrometer ACCU-SCOPE Accessories A3145
Sedgwick-rafter counting cell Hauser Scientific HS3800
probe-clip press-seal incubatin chamber Sigma-Aldrich Z359483
rifampicin Sigma-Aldrich R3501
naladixic acid Sigma-Aldrich n8878
Live/dead stain In Vitrogen Molecular Bioprobes L7007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).
  2. Beuchat, L. R. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables. Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).
  3. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  4. Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).
  5. Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).
  6. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).
  7. Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits. Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).
  8. Fuqua, C., Matthysse, A. G. Methods for studying bacterial biofilms associated with plants. Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).
  9. Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).
  10. Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).
  11. Matthysse, A. G., et al. The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).
  12. Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).
  13. Matthysse, A. G. Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells. Protoplasma. 183, 131-136 (1994).
  14. Matthysse, A. G., McMahan, S. The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).
  15. Jeter, C., Matthysse, A. G. Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).
  16. Matthysse, A. G., McMahan, S. Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).
  17. Morton, E. R., Fuqua, C. Phenotypic analyses of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 3 (2012).
  18. Brandl, M. T. Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).
  19. Franz, E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1 (2012).
  21. Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).
  22. Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).
  23. Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).
  24. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  25. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  26. Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).
  27. Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).
  28. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, 252 (2014).
  29. Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells. J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).
  30. Tomlinson, A. D., Fuqua, C. Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).
  31. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, (2014).
  32. Wright, K. M., et al. The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots. Phytopathology. 103, 333-340 (2013).
  33. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  34. Erickson, M. C., et al. Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions. J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).
  35. McKellar, R. C., et al. Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce. Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).
  36. Wu, F. M., et al. Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).
דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).More

Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter