1. הכנת חומר צמחי Axenic להכין בשתילים שגדלו במים. הכנס מספר קטן של זרעים (פחות מ 30) 30, 50, 100 או 150 מ”ל כוס זכוכית. השתמשנו עגבניות אספסת, תודרנית לבנה, אפונה, שעועית, טבק, חסה, גזר זרעים עם פרוטוקול זה.הערה: כדי לקבוע כמה זרעי יכולים להיות מעוקר יחד ללא זיהום מתפשט מזרע אחד למשנהו, ראה שלב 1.1.2. מכסה את הזרעים עם 80% אתנול, מערבולת בקצרה. תן את הזרעים משרים למשך 1 דקות. יוצקים את האתנול ולכסות את הזרעים עם פתרון של 50% על ידי אמצעי אחסון מסחרי מלבין (NaClO) ו- 0.1% טריטון X-100 במי ברז. תן את הזרעים משרים למשך 20 דקות.הערה: אם הזרעים גדולים, כגון זרעי שעועית, ייתכן צורך להאריך את הזמן השריית להרוג לחלוטין את הפטריות על פני הזרע. יוצקים את התערובת אקונומיקה ולשטוף את הזרעים 3 פעמים עם מים סטריליים. תן את הזרעים להשרות במים 1 דקות עבור כל כביסה. כדי להשיג השתילים axenic להוסיף כמות קטנה של מים סטרילי בין 5 ל 25 מ ל בהתאם לגודל של הזרעים. שופכים את הזרעים והמים לתוך צלחת פטרי סטריליות על נביטת הזרעים.הערה: המים צריכים לכסות את החלק התחתון של המנה אך אינו מכסה את הזרעים לעודד היווצרות של שערות השורש. Axenic מתאר תרבות שבה רק זן אחד של אורגניזם קיים. דגירה בחושך עד השתילים מגיעים לגודל הרצוי בין 1 ס מ 10 ס מ (כ- 5 ימים עגבניות, לבנה א ו- 1 עד 3 ימים על אספסת). זרעים גדולים יותר להשתמש במיכל סטרילי מקורה עם קיבולת של יותר מ- 100 מ ל כגון צלחת זכוכית מכוסה בנייר כסף. לקבוע את התדירות של זיהום של הרבה זרע מסוים עם מיקרואורגניזמים אשר נותרו קיימא על או בתוך הזרעים לאחר השטח-עיקור.הערה: דבר זה הכרחי מכיוון זרעים מזדמנים לשאת מיקרואורגניזמים תחת קליפת הזרע אשר יכול להרוג. השטח-עיקור. להשתמש את התדירות של זרעים מזוהמים הרבה זרע כדי לקבוע כמה זרעים לחטא בבת אחת ללא סיכון גבוה של הקבוצה של זרעים להיות מזוהמים בגלל זרע אחד עם חיידקים או פטריות אשר לשרוד את הטיפול. לבצע את השלבים 1.1.1 דרך 1.1.3. מניחים את הזרעים על אגר מזין צלחת פטרי. לשים 10-30 זרעים בכל צלחת ריווח אותם. כך הם can be הבקיע בנפרד. חותם את הכלים עם סרט איטום או קלטת. תקופת דגירה של 3-5 ימים-25 ° C הבקיע בכל יום עבור גלוי המוצלח מיקרואורגניזמים מהזרעים. להכין בשתילים שגדלו בחול. ניתן לגדל שתילים בחול לשימוש בניסויים אדהזיה חיידקי. לבצע את השלבים 1.1.1 דרך 1.1.3. לחטא חול קוורץ או ים ב החיטוי. שני אלה מכילים חומר אורגני. אם פעולה זו תשפיע על הניסוי, לשטוף את החול על ידי הסתרתה באמצעות פעמיים נפחו של 0.1 M HCl. לערבב במשך 10 דקות אפשר החול ליישב, יוצקים את הנוזל. יש לשטוף את החול 3 פעמים עם מים, ופעם עם 80% אתנול ואחריו שתי שטיפות מים נוספים באמצעות פרוטוקול אותו באשר 0.1 M HCl. Sterilize החול שטף החיטוי. לחטא מכולות מאת ששוטף את 50% מלבין במשך 5 דקות, לשטוף אותם 5 פעמים עם מים סטריליים על ידי צלילה. לאפשר להם להתייבש, חותם התחתון עם איטום הסרט. הסרט כפי להשיגה מהיצרן בדרך כלל ללא עלות של מיקרואורגניזמים מבפנים הצד אשר צריך להיות ממוקם מול בתוך המכולה. מערבבים החול סטרילי עם מים מספיק סטרילי כדי להרטיב את זה מספיק את המקלות חול יחד. הסכום יהיה תלוי כמה יבשים החול הוא. בדרך כלל 10-35% של אמצעי האחסון של החול מספיקה. מניחים על החול הרטוב בתוך המיכל המאפשר עומק מספיק עבור אורך שורשים צורך ומספיק מרחב מעל החול לצמיחה של הצילומים. המרחק המדויק תלוי מינים, מגוון של הצמח בשימוש. זרעי הצמח. תעשה חור רדוד בחול עם מוט זכוכית סטריליים רק עמוק מספיק. כדי למקם את הזרע מתחת לפני השטח של החול (בערך 1-5 מ”מ). מקם את הזרע לתוך החור. לכסות אותה עם שכבה דקה של חול. חותם העליון של המיכל עם איטום הסרט כדי למנוע אובדן מים וכניסה של חיידקים נוספים. לגדל את הצמחים במעבדה תחת אור או בחממה הטמפרטורה המתאימה, אורך יום מינים, מגוון רחב של צמחים. עגבניות, אספסת או תודרנית לבנה להשתמש בטמפרטורת החדר ומחזורי/כהה 12 שעות. שותלים שתילים בתוך בור בחול (1-2 מ מ קוטר, עמוקה מספיק כי השורש יהיה מכוסה בחול). . תרחיב את החור עם מוט זכוכית סטריליים… מדריך השורש בזהירות לתוך החור בעזרת קרס הסרוגה מפלדת סטרילי ואם צריך למלא את צידי החור בחול. לחלופין, לגדל צמחים axenically או אגר המכיל תערובת מלחים כגון MS זלץ. שימוש יורה של צמחים axenic גדל אגר ישירות. הימנע שורשים גדל עם אגר כפי אגר ומודבקת על פני הצמח והן את החיידקים. זה עלול לגרום רושם מוטעה של הידבקות חיידקים פני הצמח. 2. הכנת חומר אחר הצמח רחץ חומר צמחי גדל בחממה עם מים לפני השימוש כדי להפחית את מספר החיידקים הילידים. יהיו חיידקים ופטריות על הצמחים. חד-תאיים יהיה להציג באדמה, על השורשים, ואולי גם על העלים. כביסה עם אקונומיקה או אתנול תשנה את פני השטח של צמח, לא מומלץ. אם לאחר כביסה מים מספרי משמעותי של החיידקים נשארים, מתייחסים הצמחים עם סבון ידיים נוזלי מדולל או לדלל מי חמצן (0.01%) כדי להסיר או להרוג את החיידקים. . זה בדרך כלל פחות נזק למפעל יותר אקונומיקה או אתנול. כאשר חומר צמחי שנרכשו בשוק המקומי, קשה decontaminate, לבחור חומר אשר לא נראה שהיו אחסון ממושך. הימנע חלקי של החומר, אשר מופיעים חום או פגום. לשטוף אותה עם מים ולעשות חתכים טריים על הקצוות של חומר אשר בעבר היה לחתוך לפני השימוש בו, אלא אם כן האינטראקציות של החיידק מבחן עם חיידקים (ואת פרוקריוטים) אשר צברו באתרים חתך הן עניין. לא לשטוף עם אקונומיקה או אתנול כפי שהם תשנה את פני השטח של צמח. לטפל בפצע אתרים. הפצע אתרים לעיתים קרובות לספק חיידקים גישה אל הפנים של הצמח גשמי18. לחסום או להקטין את הקובץ המצורף חיידקי, ותנועה דרך, פצע או חתך אתרים שנוצרו בהכנת החומר בטבילת הקצה חתוך בפרפין מומסת או על-ידי צביעה באתר עם שעווה מומסת בעזרת מברשת קטנה. אל תשתמש במרית או כל יישום חדה כמו זה עלול לגרום נזק הרקמה. חותם נובע צלקות על פירות כגון עגבניות עם פרפין. חיידקים מסוימים לשחות לתוך האזור תחת הפרפין, אך מספרם קטן בדרך כלל. אם הערך חיידקי לתוך הפצע אתרים מעניינים, הערכת המרחק חיידקים שיכול להזיז נישא על ידי זרמי מים או דיפוזיה על ידי התבוננות בתנועת צבע להוסיף את הפתרון. סימון תאי חיידקים על ידי החדרת גנים קידוד החלבון הניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוכם ולאתר אותם באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות המתוארים שלב 6.1.219. 3. הכנה של חיידקים מגדלים את החיידקים. שימוש בינוני המעריכה בצורה הקרובה ביותר את התנאים החיידקים נוטים להיחשף מיד לפני שנתקלת הצמח בעולם האמיתי מחוץ למעבדה. פחמן וחנקן מקורות כמו גם הנוכחות של יונים, קטיונים במיוחד דו ערכיים (Ca, Mg, Fe, Mn ו Zn) פוספט, וכן את ה-pH של המדיום חשובים. השתמש בינוני AB מינימלי או מרק לוריא tumefaciens א , חיידקים אחרים אדמה20. לשימוש e. coli, אשר עשוי לנבוע בבטן, מרק לוריא. להוסיף בינוני21inducers כגון שורש exudates או תמציות צמחים מסחרי כגון soytone או סוכרים כמו סוכרוז או xylose. אם חומרים אלה משמשים inducers, להוסיף ריכוז נמוך, כך למשל 0.01%. אם הם מקורות פחמן בשימוש, להוסיף ריכוז גבוה יותר, לדוגמה, 0.1%. הכינו את inoculum חיידקי. לדלל את החיידקים במים סטריליים או המדיום שבו הדגירה יבוצע ולהוסיף אותם לחומר הצמח. דילול המתאים נדון בשלבים 4.2 ו- 4.3. כדי להסיר את המדיה צמיחה לפני השימוש החיידקים, centrifuge את המתלים חיידקי ב g x 10,000 למשך 2 דקות, יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend את החיידקים על ידי vortexing אותם תוך המדיום אותו אשר ישמש עבור הדגירה עם החומר הצמח. שיטה זו עשויה להסיר או להפחית את מספר או כמות חומר חוץ-תאית, תוספות כגון exopolysaccharides, כמוסות, flagellae, ו/או pili. אם זה חשוב כי מבנים אלה פני השטח נותרו ללא פגע, ואז פשוט לדלל את החיידקים לפני מזריקים להם או להשתמש בשיטה חלופית שמתואר בשלב 3.2.2. כאמצעי חלופי כדי להסיר את מדיום הגידול, לאסוף את החיידקים על מסנן ניטרוצלולוזה או פוליקרבונט עם גודל הנקבוביות של 0.2 µm או פחות. רוחצים את החיידקים עם המדיום הדגירה את resuspend להם על ידי טלטול עדין או vortexing של המסנן במיכל סטרילי של המדיום. 4. חיסון של חיידקים לקבוע את מספר החיידקים כדי לקבל חיסון ביחס המדידה כדי לשמש כדי לקבוע אדהזיה חיידקי ואורך זמן הדגירה. עבור מחקרים מיקרוסקופיים שכללו הדגירה פעמים בפחות מיום 1 לחסן מספר גדול יחסית של חיידקים. מוסיפים כמות של תרבות להגיע ריכוז חיידקי הסופי של יותר מ- 106 חיידקים לכל mL. משכי זמן ארוכים יותר הדגירה להקטין את גודל inoculum חיידקי. עבור מחקרים שבהם אדהזיה חיידקי שהריווח נמדד על ידי ספירת קיימא, להוסיף כמות של תרבות להגיע ריכוז חיידקי הסופי של 103 לחיידקים6 10 לכל mL. הימנע הוספת חיידקים רבים כי חילוף החומרים שלהם משתנה ריכוז ה-pH או חמצן במדיום הדגירה. מודדים pH באמצעות נייר pH או אלקטרודה. למדוד ריכוז חמצן באמצעות אלקטרודה חמצן. עבור הצמחים גדלו בחול, לחסן בשלוש דרכים אפשריות. לחסן את הזרע עם החיידק לפני השתילה למסמס את הזרע עבור 1 דקות בהשעיה במים של חיידקים6 כ-10 לכל mL. לחסן את השורש על ידי הנבטת שתילים axenic כפי שמתואר בסעיף 1, כאשר השורש שתיל הוא בערך 1 ס”מ טובלים אותו או הצבת כל שתיל השעיה של חיידקים6 10 לכל מ ל מים 1 דקות. לחסן חול על ידי ערבוב החיידקים עם החול לפני השתילה לתת ריכוז סופי של חיידקים3 כ-10 לכל mL או השקיית שתיל עם השעיה של חיידקים6 10 לכל mL לאחר השתילה. 5. דגירה של החיידקים עם החומר צמח עבור הדגירה בתקשורת נוזלי, דגירה החיידקים עם החומר הצמח במים סטריליים או סוכרוז ו מינרלים מלחים או לשתול רקמות תרבות בינוני (כגון 1:10 דילול של מלחי MS)22,23. השתמש מכולה אשר אינן מתיישבות החיידקים. נסו לשמור על פני הצמח מכוסה ברציפות על-ידי צלילה או עצבנות עדין. עצבנות נמרצת עשויה למנוע הידבקות או אפילו להסיר חיידקים פני הצמח. לבחון את חומר צמחי במיקרוסקופ אור לאחר משתנה מרווחי זמן כדי לקבוע מתי להפסיק הדגירה, לבצע מדידות. קורס זמן של אדהזיה היא לעתים קרובות ערך עם דגימות שנלקחו כל h 1 עד 4 או כל יום בהתאם למהירות של האינטראקציה. כדי דגירה בחול, החל שאותם שיקולי המתוארות עבור הדגירה במדיום נוזלי בשלב 5.1. 6. מדידת אדהזיה באמצעות מיקרוסקופ לבצע מדידות מיקרוסקופיות עם אופטיקה Nomarski או שלב-ניגודיות כדי להקל על הצפייה של החיידק על משטחים. עם זאת, ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ שדה בהיר עם הגדלה של 20 X ומעלה. להשתמש תצפית מיקרוסקופית כדי לקבוע אם החיידק אקראית מבוזרת או ממוקם אתרים ספציפיים. גם לבדוק הם מחויבים ביחידים או באשכולות. חפשו את הנוכחות של microcolonies מציעה התפתחות חיידקים או מלכודת לאחר הידבקות. בדוק אם החיידק נראה יוצרים ממבנה biofilm על פני השטח.הערה: ממבנה biofilm הוא מספר רב של חיידקים שמאוגד אל פני השטח, מוקף24,23,25מטריצה חוץ-תאית. המבנה עשוי להיות חלק ובעל מראה אחיד או ארכיטקטורת יותר מסובך. שיטות לימוד biofilms המשויך משטחי המפעל כבר מתואר17. השתמש חיידקים עם סמן פלורסנט התגית. אם חיידקים אחרים קיימים חיידקים עניין מזוהים באמצעות תגית פלורסנט כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, להשתמש פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי לקבוע הנוכחות של החיידק מתויג אשכולות של חיידקים26. עבור ה-GFP, השתמש במסנן עם 490 nm עירור, 520 פליטה ננומטר. בדוק כי תגית פלורסנט הוא לא להשפיע לרעה את החיידקים על ידי התבוננות הדבקות חומר axenic של תערובת שווה של פראי סוג חיידקים ובקטריות מתויג של המתח אותו באמצעות אופטיקה Nomarski והן על ידי קרינה פלואורסצנטית. אם החיידק פלורסנט וחשוך באופן אקראי מעורב ובהווה במספרים שווים התג לא התערבו עם וזמינותו. לקבוע את מספר החיידקים המצורפת.הערה: קשה מאוד לקבוע את מספר החיידקים המצורפת במיקרוסקופ. כאשר הכריכה הוא אל משטחי המפעל לא סדיר, זה בדרך כלל לא ניתן לקבל מדידה כמותית. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (לא נדון במאמר זה) ניתן לבצע מדידות כאלה. כאשר החיידק מאוגדים משטח חלק כגון שיער שורש, לספור את מספר החיידקים מאוגד על הקצה של שורש השיער לכל אורך שיער השורש מ מ. לטפל כדי להשתמש שערות השורש של בערך באותו הגודל וצורה בהשוואה בין מדידות. כדי לקבוע את גודלו של אובייקטים במיקרוסקופ, להשתמש שקופית מסחרי עם סימנים נמדד על זה. להתבונן, לצלם בשקופית זו-באותן ההגדרות כמו משמש החומר ניסיוני ולהשתמש את התמונות המתקבלות כדי לקבוע את גודלו של אובייקטים photomicrographs. להכין את הדגימה במיקרוסקופ. לשטוף את הדגימה. להעביר את הדגימה טיפת מים או הדגירה בינוני בשקופית מיקרוסקופ, התבוננו בו ישירות.הערה: זה יש יתרון כי אם היה ללא התפתחות חיידקים או חיידקי מוות שם צפויים להיות חיידקים חינם רבים. לקחת את ההעדר של חיידקים חינם כאות אזהרה כי אולי היו מוות חיידקי או חיידקי מחייב המיכל שבו בוצע הדגירה. השפעת נטילת הדגימה מוצג באיור1. לשטוף את הדגימה בעדינות במדיום מים או דגירה על-ידי הצבת זה בקבוקון של נוזל, היפוך המבחנה בעדינות. אז במקום המדגם על השקופית מיקרוסקופ בנוזל טריים להשגחה. הר המדגם בנוזל שימוש רגילה כיסוי וגלוש מיקרוסקופ. אם המדגם הוא עבה ולכן יעשה בליטה מתחת בתגית לכסות, השתמש תגית הכיסוי press-apply. אלה שער גולשת יש טבעת גומי או פלסטיק סביב הקצה בתגית כיסוי. למקם את הדוגמה של נוזלים בתוך הבאר בתגית כיסוי למקם את השקופית למעלה ואז לחץ כלפי מטה בעדינות כדי לאטום בתגית כיסוי לשקופית. היפוך ולבחון. לחלופין להשתמש אצה ספירת שקופיות, מכסה בצורה דומה. שימו לב: שקופיות עם עומק הזה לא יכול להיבדק באופן כללי עם עדשת המטרה של יותר מ 20 X הגדלה. איור 1 : שלבים בהכנת מדגם לקביעת מספר חיידקים מאוגד. כריכת tumefaciens א שערות השורש עגבניות (A, B ו- C), חוטי ניילון (D, E ו- F). הדגימות רכוב במים ללא שטיפה שניהם מאוגד חיידקים (חיצים שחורים), חיידקים חינם (החצים הלבנים) ניתן לראות (A ו- D). לאחר כביסה שמאוגד החיידקים נשארים אבל החיידק חינם הם כבר לא מציגים (הפריצה). לאחר sonication החיידק מאוגד הוסרו מהמשטח מדגם (C ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. אם חיידקים פלורסנט שימשו, לבחון את הדגימה במיקרוסקופ לאחר החול הוסר. שורשי הצמחים גדלו בחול הם בדרך כלל לא מתאים מיקרוסקופ, כמו חלקיקי חול להפריע התצפית של החיידקים. הסר את הצמח מיכל גדילה לפי שלב 7. מקם את השורשים בתוך מיכל מים ומערבבים בעדינות כדי להסיר את החול השוקעים בתחתית המיכל. הסר את המפעל מן המים כביסה והר המדגם כמו שלב 6.3.3. 7. מדידת אדהזיה באמצעות הנייד קיימא נחשב לקבוע את המספר של קיימא חיידקים המצורף באמצעות של sonicator. להסיר את החיידקים לא מאוגד. מקם את הדגימה בקבוקון עם מספיק מים, שטיפת בינוני מאגר או הדגירה כדי לכסות את חומר צמחי, להפוך את המבחנה מספר פעמים. אם היו יותר מ- 103 חיידקים חינם לכל mL נוכח הדגירה הראשונית, לבצע כביסות רציפים כדי להסיר את כל אחד מהם. בדוק במיקרוסקופ אור (ראה שלב 6.3) כדי לקבוע הנוכחות של חיידקים חינם. לשטוף עד שיש צמצום משמעותי במספר של חיידקים בחינם אבל צריך לזכור כי יש איזון בין חיידקים המאוגדים והלא מאוגדים אז מספר החיידקים חינם מעולם לא עלולה להפחית לאפס. הסר את הדגימה בקבוקון כביסה נוזלי עם מלקחיים או מרית. לקבוע את מספר החיידקים המאוגדים ב- incubations של צמחים בנוזל. להשעות את הדגימה שטף בבקבוקון, לכסות אותו. עם נפח מדודה של מים, דגירה בינונית או מאגר כביסה. השתמש נוזלי מספיק כדי לכסות את הדגימה. הכנס את המבחנה sonicator אמבטיה, sonicate אותו על מין אחד. להסיר את הדגימה ונבדוק את זה תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע אם החיידק מאוגד הוסרה מן הצמח. הסרת חיידקים מן מדגם sonication מוצג באיור1. אם יש עדיין כרוך חיידקים נוכח המשך sonicating הדגימה עד כזה עם הזמן, כי אין בקטריות מאוגד נשארים על המשטח מדגם. אם לא ניתן להסיר את החיידקים המאוגד על-ידי sonication, להוסיף חול קוורץ עקר 1-10 מ”ג/מ”ל וחזור sonication ובדיקה מיקרוסקופית. לקבוע כי ההליך sonication המופיע היעיל ביותר בשלב 7.1.3.2 אינו מפחית את הכדאיות של החיידקים על ידי השעיית חיידקים מתרבות נוזלי בפתרון שישמש עבור sonication (הוספת חול קוורץ, אם זה היה הכרחי). לקבוע את ספירת התאים קיימא. Sonicate החיידק ולקבוע את ספירת התאים קיימא שוב.הערה: אם יש ירידה בספירת תאי בת קיימא, לשנות את ההליך על-ידי שינוי ההרכב של הזמן נוזל ו/או sonication עד הטיפול אינו משפיע על ספירת התאים קיימא. לקבוע כי המאגר דילול המשמש עבור ספירת קיימא אינו משפיע על הכדאיות של חיידקים אשר יש כבר מתפשט בתנאים בשימוש על-ידי השוואת תא קיימא ספירת עשה שימוש שונה דילול מאגרי ו/או מים. לקבוע את המספר של קיימא חיידקים המחוברים באמצעות המגון. מקם את הדגימה מרגמה סטרילי או בלנדר או התקן אחר המגון. . לכסות את זה עם נפח מדודה של מים סטריליים, דגירה בינונית או שטיפה מאגר27 השתמש נפח מספיק לכסות את הדגימה. לשימוש בבלנדר 100 מ. לטחון את הדגימה ובודקים אותו הוא טוב. בדוק את ה-pH לאחר המגון כדי לוודא כי חומצה שוחררו רקמת הצמח לא גרמה ירידה חדה ב- pH מתחת ל7. אם ה-pH ירד להשתמש בופר כמו מאגר פוספט בתוך הנוזל המגון כדי לשמור על רמת ה-pH. לקבוע את ספירת התאים קיימא. השתמש חיידקים שמסומנים עמידות לאנטיביוטיקה. במצבים בהם קיים סוג אחד או יותר של חיידק, לסמן זני חיידקים באמצעות התנגדות ספונטנית אנטיביוטיקה (בדרך כלל ריפאמפיצין, חומצה nalidixic). לקבוע את רמת של אנטיביוטיקה לשימוש. אם תרבויות אחרות האורגניזמים צפוי להיות נוכח הדגירה זמינים, צלחת תרבויות אלה גדלו בתנאים של הדגירה המיועד עם צמחים על צלחות המכיל מגוון של ריכוזים של הנבחרת לאנטיביוטיקה. לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר אשר אינו מאפשר צמיחה של כל האורגניזמים. זהו הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שבה החיידק המבחן צריך להיות עמיד. להשיג ספונטנית מוטנטים עמידים בפני אנטיביוטיקה. לגדול תרבות של החיידקים בינוני עשיר יומן מאוחר או שלב נייח. צלחת מדולל לצלחת המכילה אנטיביוטיקה הרצוי-הריכוז המתאים 0.1 מ”ל. לקבוע ריכוז לשימוש כפי שמתואר בשלב 7.3.1.1. תמשיך ולטהר את החיידקים אשר גדלים, ולכן הם עמידים בפני האנטיביוטיקה. לקבוע כי עמידות לאנטיביוטיקה ואינו מקטין את הצמיחה של החיידקים על-ידי ביצוע עיקול צמיחה בינוני נוזלי של האב, זנים עמידים לאנטיביוטיקה. לקבוע כי חיידקים עמידים בפני אנטיביוטיקה להראות באותה הרמה של קולוניזציה של חומר צמחי axenic כמו המתח האב, אם זה אפשרי. לקבוע את מספר החיידקים קיימא מאוגדים הצמחים גדלו בחול. הסר את הצמח מיכל וחול. כדי להסיר צמחים מכולות, להסיר תחילה את חומר האטימה בחלק העליון והתחתון של הגורם המכיל. הצב את המכולה על פיסת נייר סטרילי ולהסיר בעדינות את כולו חול או אדמה ואת המפעל בתור אחד גליל מחודדות גדולות על ידי דפיקות בעדינות את המיכל נגד משטח כדי לשחרר את החומר. במידת הצורך, השתמש מרית או מוט כדי לשחרר את החומר בקצוות נכנס דרך החלק התחתון של המיכל. כאשר הצילינדר של חול או אדמה המכילים את הצמח חינם על הנייר, נתחלק באמצע כדי לגלות את שורש הצמח. אם רצונך בכך, לקחת דגימות של החול מ סמוך לקצה של המכולה, כמו גם ליד הבסיס. זה עשוי להיות שימושי כדי לקבוע את התפשטות (ואת הצטברות וצמיחה) של החיידק. למדוד את האורך של השורש. לאסוף את השורש ולהסיר את חול ובקטריות הקפדה באופן רופף על השורש (החומר rhizosphere) על ידי טבילה לשורש נפח מדודה של מים או מאגר וניער אותו בעדינות. לקבוע את ספירת התאים קיימא של חיידקים הנוצרת ההשעיה על ידי ציפוי מדיום מתאים כגון לוריא אגר. זה מייצג את מספר חיידקים הקשורים באופן רופף עם השורש. להסיר את החיידקים בחוזקה מאוגד על-ידי sonication ולקבוע את המספרים שלהם כפי שמתואר בשלב 7.1. לחלופין, כדי לקבוע מיקום הבסיס של החיידק בחוזקה מאוגד למקם השורש שטף על פני צלחת פטרי המכילה אגר מזין או מדיום מתאים אחר. לבחון את המיקום של מושבות חיידקים על השורש בימים 3 באמצעות זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ ויבתר. מבטאים את תוצאות כמו מספר חיידקים לכל צמח, לכל ס מ2 של פני השטח, לכל אורך השורש ס מ או לפי משקל גרם טריים של רקמות. לעשות משכפל מרובים באותו יום, גם משכפל בימים שונים באמצעות תרביות חיידקים שונים, שונים והרבה חומר צמחי. 8. קביעת אם השפעה של דגירה תנאים על הדבקות היא עקב תגובה של החיידק או הצמח שימוש בחומרי צמח מת או נהרג. נושא את הצמח גשמי למגוון רחב של כימיקלים, כתות ומייצבים או טיפולים אחרים כגון חום על מנת להרוג אותו. לשטוף את החומר צמח ביסודיות במדיום מים, דגירה לאחר השימוש של כל הטיפולים האלה. ואז לחסן את החיידקים. . זה לא יהרוס את פני השטח של צמח אבל זה יגרום סמויה פעיל כך זה יכול להגיב על החיידקים. למדוד אדהזיה חיידקי כמתואר בצעדים 6 או 7. גם לקבוע את מספר התאים קיימא הוסיף אינקובציית החומר הצמח בתחילת הדגירה ולאחר מספר התאים קיימא נוכח בסוף הדגירה כדי להבטיח כי כימיקלים רעילים לא נכחו בזמן הדגירה. השתמש בחומר דומם. ההקפדה חיידקי שימוש בחומר דומם כדי לקבוע אם אפקט ראיתי על הדבקות חיידקים לשתול חומר הוא השפעה על הצמח או החיידקים. לבחור של חומר דומם אשר מאגד החיידקים, בדומה הצורה והגודל חומר צמחי למד. האפשרויות כוללות מסנן המסמכים של כל סוגי (תאית, ניטרוצלולוזה, פיברגלס, לוחות פוליקרבונט, וכו ‘), הליכי משנה (ניילון, כותנה, פוליאסטר, צמר זכוכית, וכו ‘.), זכוכית או פלסטיק coverslips, פלדת אל-חלד קופונים ואת דיאליזה ממברנות. לשטוף את החומר הדומם ביסודיות בתוך מים, המדיום שבו הדגירה יבוצע ולחטא אותו לפני השימוש. רוב החומרים ברשימה בשלב 8.2.1 יציבים כדי עיקור על-ידי autoclaving. דגירה החומר הדומם המוליד תחת התנאים הרצויים והניקוד כפי שתואר בשלבים 6 ו- 7. דוגמה של השימוש של חוטי ניילון כדי לקבוע כי מתבצע האיגוד מופחתת של tumefaciens א ל שערות השורש בריכוזים סידן גבוהה (לפחות בחלקו) כדי השפעה של סידן על החיידק מוצגת באיור 428.