測定し、特に根や芽、植物に細菌の付着を特徴付けるのための簡単な方法は、この資料に記載されています。
本稿では、光学顕微鏡では生菌を使用して無菌植物の表面に細菌の結合を測定する方法について説明します。使用される植物材料ではカット フルーツなど、根、芽、葉。説明する方法は安価な簡単に、そして小さなサンプル サイズに適しています。バインディングは実験室で測定、様々 なインキュベーション メディアや条件を使用できます。阻害薬の効果を判断できます。促進・抑制結合の状況も評価することができます。いくつかのケースで様々 な条件は植物や細菌に対する彼らの効果のために主にバインディングを変更するかどうかを区別することが可能です。
植物表面に細菌の結合の測定は、3 つの異なる状況で重要になりました。最初の状況は、植物表面1,2,3の人間の病原体の感染の検査です。削除または、バインドされた細菌を殺す細菌を防ぐためには、ここでの目標とこの植物材料によって病気の伝達を減らすため。2 番目の状況は、植物の表面4の植物病原体結合の検討です。もう一度ここでの目標はようにバインディングを削除またはバインドされた細菌を殺すとこの病気を減らすために。3 番目の状況は、共生または植物成長促進菌5,6の結合の検討です。ここでの目標はバインドとこうして増加植物の健康および作物に細菌を促進するために得られます。
この資料に記載されている表面を植物に細菌のバインディングの測定方法は、安価、比較的実施しやすい。唯一の要件は、顕微鏡と細菌学の研究室で一般に見つけられる材料に。いくつかのテクニックお風呂超音波発生装置が便利です。説明する手法は、実験の結果, 比較的小さなサンプル サイズを使用してバインドするため設計されています。結合量の測定は、温室やフィールドでの使用のためのこれらのテクニックの一部を変更することがありますが、研究室で作られています。
これらのテクニックは、根、もやし、カット葉細菌バインディング、カット フルーツ、および研究室7,8,9,10、11でそのままチェリー トマトを測定に使用されています。 12,13,14,15。彼らは土壌で育つ植物の根を植民地化を測定または研究室16で砂にも使用されています。テクニックなどアグロバクテリウム、ダイズ法、大腸菌、サルモネラ、 緑膿菌の fluorescens細菌の多くの種に使用されています。(2012 年)17モートンとフュークワA. 根頭がんしゅ病菌の表面との相互作用を評価する方法の有用な説明を見つけることが。すべてのケースで関係のサンプル サイズが小さく、一般的に未満 25 50 植物。説明する手法は、実験中に含まれている保持する必要がある人間の病原体で使用に適しています。
実験中に細菌が付着することが表面のすべてを認識することが重要です。生菌が行われる場合、ガラスにバインドすることができる細菌が過小評価される従ってガラス管、ピペットを使用します。寒天培地または土壌と寒天のいくつかの植物は育つ土壌が植物に残っている場合、細菌は植物ではなく、付着した材料にバインドできます。その一方で、根、特に植物の表面を洗浄取り外せます自然表面コーティングなど粘膜付着テストの結果をこのように変更と。
特定の細菌培養混合物に追加が実験中に生きているままにすることが重要です。こうして無料として接続されている細菌の生菌は日常的に行われなければなりません。いくつかの治療法や細菌の突然変異は細菌の増殖率を減らすまたは実際に細菌の人口のごく一部の死を引き起こす可能性があります。特別な汚れを使用しない限り、ライブとデッド細菌を顕微鏡で区別できない場合があります。生きている細菌から染料の排除によって決まるライブ/デッド細菌の有用な染色キットです。しかし、菌種の混合された人口が存在する場合、関心の種の生菌数は孵化がバクテリアの死で起因したかどうかを決定する最も簡単な方法をする可能性があります。
培地成分は細菌の生存と成長に影響を及ぼします。傷から解放され、サイトをカットの根滲出液等ささやかな細菌の成長をサポートするための基板を提供します。リン酸・窒素・鉄は、これらの条件で制限される傾向にあります。カルシウムやマグネシウムなどの 2価陽イオン接着に影響を与える可能性があります。いくつかのケースで密着性に影響を及ぼす炭素源。pH も重要であります。一般に根圏 pH は 5.5 と 6.5 の間です。
付いている抗生の抵抗細菌を使用して注意が必要です。最も頻繁に使用される抗生物質リファンピシン ・ ナリジクス酸であります。これらの抗生物質への抵抗は一般に染色体の遺伝子の突然変異 (RNA ポリメラーゼとジャイレース、それぞれ) 従って、簡単に別の負担に孵化の間に転送することはできません。また抵抗のこのタイプは劣化や抗生物質の変更されません。他の細菌にプラスミドを転送できない場合を除き、プラスミド由来の遺伝子マーカーを持つ細菌をマーキングはお勧めしません。抗生物質感受性菌は耐性菌に近いある場合抗生物質プレートに成長することはできなくなりますので、抗生剤の劣化や化学修飾による抗生の抵抗にはなりません。
このペーパーで説明する方法は、サンプルが (たとえば、実験人間の病原体を含む) に格納する必要があります小さなサンプル サイズや実験に適しています。(100 g の材料または 50 以上の植物) の上の大きいサンプルの大きさのため他の方法またはこれらの方法の抜本的な変更になります必要な10,19,32,19,33,34,35,36. 多数研究されている種以外の微生物の存在も重大問題が発生することができます。可能な解決策には手順 6.1.2 および 7.3 蛍光タンパク質や抗生物質耐性付いて細菌の使用が含まれます。しかし、関心の菌は他の微生物の大規模な人口で稀な個人これらのマーカーは研究されている細菌の数の明確な評価を許可するように適切なできません。
すべてのここで説明した方法は実験室ベースの方法です。マイナーな修正温室効果研究のため必要になります。大きな変更は、原生動物、昆虫および他の動物の捕食と気候の変化が実験のための定義された条件の規定を複雑にフィールド調査に必要可能性があります。将来的にこれらのメソッドは、植物の表面に 2 つ以上の微生物の相互作用を含むように拡張可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
著者は、実験のいくつかの援助のための数字は、カミーユ ・ マルタンとヒラリー ・ Samagaio の準備のためのスーザン ホイット フィールドを感謝します。
light microscope | any | N/A | phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required. |
seeds | any | N/A | make a note of the seed lot number and the cultivar |
bleach | any | N/A | |
bath sonicator | any scientific supply company | N/A | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
nutrient agar | Difco | 001-01-8 | |
soytone | Difco | 24360 | |
Sand | sea sand Fisher Scientific | S25 | |
sand | Sigma-Aldrich | S9887 | |
conetainers | Stuewe & Sons, Inc. | Ray-Leach cone-tainers | many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow |
parafilm | any scientific supply company | N/A | |
MS salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
parrafin | any | N/A | |
centrigfuge | any scientific company | N/A | to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed |
vortex mixer | any scientific company | ||
micrometer | ACCU-SCOPE Accessories | A3145 | |
Sedgwick-rafter counting cell | Hauser Scientific | HS3800 | |
probe-clip press-seal incubatin chamber | Sigma-Aldrich | Z359483 | |
rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
naladixic acid | Sigma-Aldrich | n8878 | |
Live/dead stain | In Vitrogen Molecular Bioprobes | L7007 |