1. beredning av Axenic växtmaterial Förbereda plantor som odlas i vatten. Placera ett litet antal frön (mindre än 30) i en 30, 50, 100 eller 150 mL glasbägare. Vi har använt tomat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, ärter, bönor, tobak, sallad och morot utsäde med detta protokoll.Obs: För att avgöra hur många frön kan steriliseras tillsammans utan kontaminering som sprider sig från ett frö till en annan, se steg 1.1.2. Täck fröna med 80% etanol och snurra kort. Låt fröna blöt i 1 min. Häll av etanolen och täck fröna med en lösning av 50% av volymen kommersiella blekmedel (NaClO) och 0,1% Triton x-100 i kranvatten. Låt fröna blöt i 20 min.Obs: Om fröna är stora, till exempel frön, kan det vara nödvändigt att förlänga blötläggning tid att helt döda svampen på utsäde ytan. Häll av blekmedel blandningen och tvätta fröna 3 gånger med sterilt vatten. Låt fröna blöt i vattnet för 1 min för varje tvätt. För att erhålla lägga axenic plantor en liten mängd sterilt vatten mellan 5 och 25 mL beroende på storleken på fröna. Häll frön och vatten i en steril petriskål för frögroning.Obs: Vattnet bör täcka botten av skålen men inte täcka fröna för att uppmuntra bildandet av rothår. Axenic beskriver en kultur där endast en enda art av organismen är närvarande. Inkubera i mörkret tills plantorna når önskad storlek mellan 1 cm och 10 cm (ca 5 dagar för tomat och A. thaliana och 1 till 3 dagar för alfalfa). För större frön använder en täckt steril behållare med en kapacitet på mer än 100 mL såsom en glasskål täckt med folie. Bestämma frekvensen av kontaminering av en viss utsädespartiet med mikroorganismer som förblir lönsamt eller inom frön efter surface-sterilisering.Obs: Detta är nödvändigt eftersom enstaka frön bära mikroorganismer under utsäde pälsen som inte kan dödas av surface-sterilisering. Använda frekvensen av smittade frön i ett fröparti för att avgöra hur många frön för att sterilisera på en gång utan en hög risk för gruppen av frön förorenas på grund av ett frö med bakterier eller svampar som överlever behandlingen. Utför steg 1.1.1 genom 1.1.3. Placera frön på ett näringsämne agar petriskål. Sätta 10-30 frön i varje maträtt avstånd dem så att de kan vara poängsätts individuellt. Tätning av rätter med tejp eller tätning film. Inkubera under 3-5 dagar vid 25 ° C scoring varje dag för synlig utväxt av mikroorganismer från frön. Förbereda plantor som odlas i sand. Plantor kan odlas i sand för användning i bakteriell vidhäftning experiment. Utför steg 1.1.1 genom 1.1.3. Sterilisera kvarts eller sea sand i autoklav. Båda dessa innehåller några organiska material. Om detta kommer att påverka experimentet, tvätta sanden genom att täcka den med två gånger sin volym av 0,1 M HCl. Mix för 10 min. Tillåt sanden för att bosätta sig och häll av vätskan. Skölj sanden 3 gånger med vatten, och en gång med 80% etanol följt av två ytterligare vatten sköljningar använder samma protokoll när det gäller den 0,1 M HCl. Sterilize tvättade sanden i autoklav. Sterilisera behållare genom att dränka dem i 50% blekmedel för 5 min och skölj dem 5 gånger med sterilt vatten genom nedsänkning. Låt dem torka och täta botten med tätning film. Filmen som erhålls från tillverkaren är generellt gratis av mikroorganismer på insidan sidan som bör placeras mot insidan av behållaren. Blanda den steril sanden med tillräckligt sterilt vatten och blöt det tillräckligt att sand pinnar tillsammans. Beloppet beror på hur torr sand är. Vanligtvis räcker 10-35% av volymen av sanden. Placera den våt sanden i behållaren ger tillräckligt djup för längden på rötter behövs och tillräckligt utrymme ovanför sanden för tillväxt av skott. De exakta avstånd beror på art och sort av växten som används. Plantera frön. Gör ett grunt hål i sanden med en steril glasstav bara tillräckligt djup för att placera utsädet under ytan av sanden (ungefär 1-5 mm). Placera utsädet i hålet. Täck den med ett tunt lager av sand. Försegla toppen av behållaren med tätning film för att förhindra förlust av vatten och ingången till ytterligare mikrober. Odla växterna i labbet under en lampa eller i växthuset vid en lämplig temperatur och dag-längd för art och sort av anläggningen. Använd rumstemperatur och 12 h ljus/mörk cykler för tomat, alfalfa eller Arabidopsis thaliana . Plantera plantor i ett hål i sanden (1-2 mm i diameter och djup nog att roten kommer att täckas med sand). Gör hålet med en steril glasstav. Guide roten försiktigt in i hålet med en steril rostfritt stål virknål om det behövs och fylla sidorna av hålet med sand. Alternativt, odla växter axenically på eller i agar som innehåller en blandning av salter såsom MS salter. Använd skott av axenic växter som odlas i agar direkt. Undvika rötter vuxit med agar som agar pinnar att både växt ytan och bakterier. Detta kan resultera i ett falskt intryck av bakteriell vidhäftning till växten ytan. 2. beredning av annat växtmaterial Tvätta växtmaterial som odlas i växthus med vatten före användning för att minska antalet inhemska mikrober. Det kommer finnas bakterier och svampar på växterna. Protozoer kommer att finnas i jorden, på rötterna, och möjligen på bladen. Tvätt med blekmedel eller etanol kommer att förändra växt ytan och rekommenderas inte. Om efter vatten tvätt betydande antal mikrober förbli, behandla växter med utspädd flytande handtvål eller utspädd väteperoxid (0,01%) att ta bort eller döda mikrober. Detta är generellt mindre skadligt för växten än blekmedel eller etanol. Växtmaterial som köpt på en lokal marknad är svårt att sanera, välja material som inte verkar har varit föremål för lång lagring. Undvik delar av materialet som förefaller brun eller skadade. Tvätta med vatten och göra färska nedskärningar på ändarna av material som tidigare har tagits bort innan du använder den, om inte samspelet mellan test bakterierna med bakterier (och Eukaryoter) som kommer ha ansamlats på skär platser är av intresse. Tvätta inte med blekmedel eller etanol som de kommer att förändra växt ytan. Behandla såret platser. Såret webbplatser ger ofta bakterier tillträde till inre av plant material18. Blockera eller minska bakteriell fastsättning och rörelse genom, sår eller klippa webbplatser som skapas i förbereda materialet genom att doppa den skurna kanten i smält paraffin eller genom att måla webbplatsen med smält paraffin med en liten borste. Använd inte en spatel eller någon skarp implementera eftersom det kan skada vävnaden. Seal stem ärr på frukt såsom tomater med paraffin. Vissa bakterier kommer att simma in i området under paraffinet, men deras antal är i allmänhet små. Om bakteriell tas i såret platser av intresse, uppskattning avståndet som bakterier kan flytta bärs av vattenströmmar eller diffusion genom att observera förflyttning av ett färgämne tillsätts lösningen. Markera rörliga bakterier genom att införa en gen som kodar en fluorescerande protein såsom grönt fluorescerande protein (GFP) in i dem och spåra dem med fluorescensmikroskopi som beskrivs i steg 6.1.219. 3. beredning av bakterier Odla bakterier. Använd ett medium som närmast approximerar villkor bakterier sannolikt har exponerats för omedelbart före stöter växten i den verkliga världen utanför laboratoriet. Kol och kväve källor samt förekomsten av joner, särskilt divalenta katjoner (Ca, Mg, Fe, Mn och Zn) och fosfat, och pH-värdet i mediet är viktiga. Använd AB minimalmedium eller Luria buljong för A. tumefaciens och andra jord bakterier20. För E. coli, som kan ha sitt ursprung i tarmen, använda Luria buljong. Lägg till inducerare såsom rot exudat eller kommersiella växtextrakt såsom soytone eller sockerarter såsom sackaros eller xylos till medelstora21. Om dessa ämnen används som inducerare, lägga till en låg koncentration, till exempel 0,01%. Om de är Använd kolkällor, lägga en högre koncentration, till exempel 0,1%. Förbereda det bakteriella inokulatet. Späd ut bakterierna i sterilt vatten eller i det medium där ruvning kommer att genomföras och lägga till dem i växtmaterial. Den tillämpliga utspädningen diskuteras i steg 4.2 och 4.3. Ta bort tillväxt medier innan du använder bakterier, Centrifugera bakteriesuspensionen vid 10 000 x g i 2 min, Häll av supernatanten och återsuspendera bakterier av vortexa dem i samma medium som kommer att användas för inkubation med växtmaterial. Denna metod kan ta bort eller minska antalet eller mängd extracellulära material och bihang såsom exopolysaccharides, kapslar, flagellae eller pili. Om det är viktigt att dessa ytstrukturer förblir intakta, sedan helt enkelt späd bakterierna innan vaccinera dem eller använda en alternativ metod som beskrivs i steg 3.2.2. Som en alternativ metod att ta bort odlingsmedium, samla in bakterierna på nitrocellulosa eller polykarbonat filter med en porstorlek på 0,2 µm eller mindre. Tvätta bakterierna med inkubation medium och resuspendera dem av milda skakningar eller vortexa av filtret i en steril behållare av medium. 4. inympning av bakterier Bestämma antalet bakterier att ympas med hänvisning till mätning för att bestämma bakteriell vidhäftning och längden på inkubationstiden. Inokulera relativt stort antal bakterier för mikroskopiska studier inkubation gånger mindre än 1 dag. Lägga till ett belopp av kultur att nå en slutlig bakteriell koncentration på mer än 106 bakterier per mL. Minska bakteriell inokulum för längre inkubationstider. För studier där bakteriell vidhäftning kommer att mätas genom livskraftiga blodkroppar, lägga till ett belopp av kultur att nå en slutlig bakteriell koncentration 103 till 106 bakterier per mL. Undvik att lägga till så många bakterier som deras metabolism förändringar pH eller syre koncentrationen inkubation medium. Mät pH med pH-papper eller en elektrod. Mäta syrehalten använder en syre-elektrod. För växter som odlas i sand, Inokulera i tre möjliga sätt. Ympa utsädet med bakterierna före plantering genom att blötlägga fröet till 1 min i en suspension i vatten ca 106 bakterier per mL. Inokulera roten med spira axenic plantor som beskrivs i avsnitt 1 och när plantan roten är ca 1 cm lång doppa den eller att placera hela plantan i en suspension av 106 bakterier per mL i vatten i 1 min. Inokulera sand genom att blanda bakterierna med sanden innan plantering för att ge en slutlig koncentration på cirka 103 bakterier per mL eller vattna plantan med en suspension av 106 bakterier per mL efter plantering. 5. inkubation av bakterierna med växtmaterial För inkubering i flytande media Inkubera bakterierna med växtmaterial i sterilt vatten eller sackaros och mineralsalter eller plantera vävnad odlingsmedium (t ex en 1:10 utspädning av MS salter)22,23. Använd en behållare som bakterierna inte klibbar. Försök att hålla växten ytan täckt kontinuerligt antingen genom nedsänkning eller vaggning. Kraftig agitation kan förhindra vidhäftning eller ens ta bort bakterier från växten ytan. Observera växtmaterialet i mikroskopet ljus efter varierande tidsintervall att avgöra när du ska stoppa ruvning och göra mätningar. En tidsförloppet för vidhäftning är ofta värdefullt med prover tagna varje 1 till 4 h eller varje dag beroende på hastigheten på interaktionen. För att odla i sand, gäller samma överväganden beskrivs för inkubering i flytande medium i steg 5.1. 6. mätning av vidhäftning med mikroskopi Gör mikroskopiska mätningar med Nomarski eller faskontrast optik för enkel visning av bakterier på ytor. Dock kan några ljusa fält Mikroskop med förstoring 20 X eller högre användas. Använd mikroskopisk observation för att avgöra om bakterierna är slumpmässigt fördelade eller på särskilda platser. Kontrollera även om de är bundna ensamma eller i kluster. Leta efter förekomsten av microcolonies tyder på bakteriell tillväxt eller brottsprovokation efter vidhäftning. Kontrollera huruvida bakterierna verkar utgöra en biofilm på ytan.Obs: En biofilm är ett stort antal bakterier bunden till ytan och omgiven av en extracellulär matrix23,24,25. Strukturen kan vara smidig och enhetlig eller ha en mer komplicerad arkitektur. Metoder för att studera biofilmer är associerad med växt ytor har varit beskrivs17. Använda bakterier med en fluorescerande markör etiketten. Om andra bakterier är närvarande och bakterier av intresse identifieras av en fluorescerande etikett t ex grönt fluorescerande protein, använda fluorescensmikroskopi för att bestämma förekomsten av märkta bakterier i kluster av andra bakterier26. För GFP, Använd ett filter med 490 nm excitation och 520 nm utsläpp. Kontrollera att taggen fluorescerande inte negativt påverkar bakterier genom att observera adherencen till axenic material av en lika blandning av vild typ bakterier och märkta bakterier av samma stam med både Nomarski och fluorescens optik. Om lysrör och mörka bakterierna är slumpmässigt blandade och närvarande i jämlike numrerar sedan etiketten inte interferera med analysen. Bestämma antalet bifogade bakterier.Obs: Det är mycket svårt att avgöra antalet bifogade bakterier i mikroskopet. När bindningen är ojämn växt ytor, är det i allmänhet inte möjligt att få en kvantitativ mätning. Svepelektronmikroskopi (inte diskuteras i denna artikel) kan användas för att göra sådana mätningar. När bakterierna är bundna till en slät yta såsom ett rot hår, räkna antalet bakterier bunden till kanten av roten håret per mm rot hårets längd. Var noga med för att använda rothår av ungefär samma storlek och form i jämföra mätningar. För att bestämma storleken på objekt i mikroskopet, använda en kommersiell bild med uppmätta markeringar på den. Observera och fotografera denna bild på samma inställningar som används för experimentella material och använda bilderna för att bestämma storleken på objekt i mikrofotografier. Förbereda provet för mikroskopi. Tvätta provet. Flytta provet till en droppe vatten eller inkubation medium på ett objektglas och observera det direkt.Obs: Detta har den fördelen att om det fanns ingen bakterietillväxt eller faktiska bakteriell döden det är osannolikt att många gratis bakterier. Ta avsaknad av gratis bakterier som en varningssignal om att det kan ha varit bakteriell dödsfall eller bakteriell bindning till behållaren där ruvning genomfördes. Effekten av tvätta provet visas i figur 1. Tvätta provet försiktigt i vatten eller inkubation medium genom att placera det i en flaska med vätska och vända injektionsflaskan försiktigt. Placera sedan provet i mikroskopet bilden i färska vätska för observation. Montera provet i vätskan med hjälp av en vanlig täckglas och objektglas. Om provet är tjock och så skulle göra en utbuktning under cover slip, Använd en press-apply täckglas. Dessa täckglas har en ring av gummi eller plast runt kanten på täckglaset. Placera vätska och prov i brunnen i täckglaset och sedan placera bilden ovanpå och tryck ner försiktigt för att försegla täckglaset till bild. Invertera och undersöka. Alternativt använda en alger räknar bild och täckglas på ett liknande sätt. Observera att bilder med detta djup generellt inte kan undersökas med ett objektiv som är större än 20 X förstoring. Figur 1 : Steg i utarbetandet av ett prov för att fastställa antalet bundna bakterier. A. tumefaciens bindning till tomat rothår (A, B och C) och nylontrådar (D, E och F). I prover som är monterad i vatten utan tvätt både bunden bakterier (svarta pilar) och gratis bakterier (vita pilar) kan ses (A och D). Efter tvätt bundna bakterier kvar men gratis bakterier inte längre presentera (B och E). Efter ultraljudsbehandling har bundna bakterierna tagits bort från urvalet ytan (C och F). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Om fluorescerande bakterier användes, granska provet i mikroskopet efter sanden har tagits bort. Rötterna av växter som odlas i sand är i allmänhet inte lämplig för mikroskopi som sand partiklarna störa observationen av bakterierna. Ta bort anläggningen från en tillväxt behållare enligt steg 7. Rötterna i en behållare med vatten och blanda försiktigt för att ta bort sanden som kvittar till botten av behållaren. Ta bort anläggningen från tvättvattnet och montera provet som i steg 6.3.3. 7. mätning av vidhäftning med livskraftiga cell räknas Bestämma antalet livskraftiga bifogade bakterier använder en någon sonikator. Ta bort obundna bakterier. Placera provet i en injektionsflaska med tillräckligt med vatten, tvätta buffert eller inkubation medium för att täcka växtmaterial och Vänd injektionsflaskan flera gånger. Om det fanns mer än 103 gratis bakterier per mL i första ruvning, utföra sekventiella sköljvattnet för att ta bort dem alla. Kontrollera i ett ljusmikroskop (se steg 6.3) att fastställa förekomsten av gratis bakterier. Tvätta tills det finns en betydande minskning av antalet gratis bakterier men kom ihåg att det finns en jämvikt mellan bundna och obundna bakterier så antalet gratis bakterier kan aldrig minska till noll. Ta bort provet från injektionsflaskan med tvättvätska med en pincett eller spatel. Bestämma antalet bundna bakterier i inkubationer av växter i vätska. Avbryta tvättas provet i en injektionsflaska och täck den med en uppmätt volym av vatten, inkubation medium eller tvätt buffert. Använd tillräckligt med vätska för att täcka provet. Placera injektionsflaskan i ett bad någon sonikator och Sonikera det för en min. Ta bort provet och undersöka det under mikroskopet ljus att avgöra huruvida de bundna bakterierna har avlägsnats från anläggningen. Borttagning av bakterier från ett urval av ultraljudsbehandling visas i figur 1. Om det finns fortfarande bunden bakterier finns fortsätta sonicating provet tills sådan en tid som ingen bunden bakterier kvar på prov ytan. Om de bundna bakterierna inte kan avlägsnas genom ultraljudsbehandling, Lägg till 1-10 mg/mL steril kvartssand och upprepa ultraljudsbehandling och mikroskopisk undersökning. Fastställa att förfarandet ultraljudsbehandling som visas mest effektiva i steg 7.1.3.2 inte minskar lönsamheten för bakterier genom att avbryta bakterier från en flytande kultur i lösningen som ska användas för ultraljudsbehandling (Lägg kvartssand, om det var nödvändigt). Bestämma antalet livskraftiga celler. Sonikera bakterierna och avgöra det livskraftiga celltalet igen.Obs: Om det finns en minskning av livskraftiga celltal, ändra förfarandet genom att ändra sammansättningen av den vätska eller ultraljudsbehandling tid tills behandlingen har ingen effekt på livskraftiga celltal. Bestämma att utspädning bufferten används för livskraftiga blodkroppar inte påverkar lönsamheten för bakterier som har inkuberats enligt de villkor som används genom att jämföra livskraftig blodkroppar med olika utspädning buffertar och/eller vatten. Bestämma antalet livskraftiga bifogade bakterierna med homogenisering. Placera provet i en steril mortel eller mixer eller annan homogenisering enhet. Täck den med en uppmätt volym av sterilt vatten, inkubation medium eller tvätta buffert27. Använda en volym som är tillräckliga för att täcka provet. Använd 100 mL för en mixer. Finfördela provet tills det är väl homogeniseras. Kontrollera pH-värdet efter homogenisering vara säker på att syra frigörs från växt vävnaden inte har orsakat en kraftig nedgång i pH under 7. Om pH-värdet har sjunkit använda en buffert som fosfatbuffert i homogenisering vätskan för att upprätthålla pH. Bestämma antalet livskraftiga celler. Använda bakterier markerade med antibiotikaresistens. I situationer där det finns mer än en typ av bakterie, markera bakteriestammar med spontan resistens mot antibiotika (vanligtvis rifampicin och nalidixic syra). Fastställa nivån på antibiotika att använda. Om det finns kulturer av andra organismer förväntas vara närvarande i ruvning tallrik dessa kulturer odlas enligt villkoren för den avsedda inkubationen med växter på plåtar som innehåller en serie koncentrationer av valda antibiotika. Fastställa den lägsta koncentration som inte medger tillväxt av någon av dessa organismer. Detta är den lägsta koncentrationen av antibiotika som behöver testa bakterierna är resistenta. Erhålla spontan antibiotikaresistenta mutanter. Växer en kultur av bakterier i rikt medium till sena logg eller stationär fas. Plattan 0,1 mL outspädd på en tallrik som innehåller önskad antibiotika vid en lämplig koncentration. Fastställa koncentrationerna att använda som beskrivs i steg 7.3.1.1. Hålla och rena bakterier som växer och därmed är resistenta mot antibiotika. Bestämma att antibiotikaresistens inte minskar tillväxten av bakterier genom att göra en tillväxtkurva i flytande medium av förälder och antibiotikaresistenta stammar. Bestämma att antibiotikaresistenta bakterier visar samma nivå av koloniseringen av axenic växtmaterial som parentalstammen, om detta är möjligt. Bestämma antalet livskraftiga bakterier bunden till växter som odlas i sand. Ta bort anläggningen från behållaren och sand. Ta bort växter från behållare genom att först ta bort tätande material på toppen och botten av behållaren. Placera behållaren över en steril papperslapp och försiktigt ta bort hela sand eller jord och växt som en stor avsmalnande cylinder genom att försiktigt knacka behållaren mot en yta att lossa materialet. Om det behövs, Använd en spatel eller stav för att lossa materialet runt kanterna går i genom botten av behållaren. När cylindern av sand eller jord som innehåller växten är gratis på papper, dela den i mitten att avslöja växtrötter. Om du vill ta prover av sand från nära kanten av behållaren samt nära roten. Detta kan vara användbart att fastställa spridning (och ackumulering och tillväxt) av bakterier. Mät längden på roten. Plocka upp roten och ta bort sand och bakterier följa löst till roten (odlingsbädden materialet) genom att doppa roten i en uppmätt volym av vatten eller buffert och försiktigt skaka den. Avgöra det livskraftiga celltalet av bakterier i den resulterande suspensionen av plätering på ett lämpligt medium såsom Luria agar. Detta motsvarar antalet bakterier löst associerade med roten. Ta bort tätt bundna bakterier av ultraljudsbehandling och bestämma deras antal enligt steg 7,1. Alternativt, för att avgöra på plats på roten av tätt bundna bakterier placera tvättade roten på ytan av en petriskål innehållande näringsagar eller annat lämpligt medium. Observera placeringen av bakteriekolonier i roten under de kommande 3 dagarna med en dissekera lupp eller förstoringsglas. Express resultat som antalet bakterier per planta, per cm2 yta, per cm rot längd eller per gram färsk vikt vävnad. Göra flera replikat på samma dag och även göra replikat på olika dagar med olika bakteriekulturer och olika massor av växtmaterial. 8. att bestämma om en effekt av inkubationsförhållanden på vidhäftning beror på en reaktion av bakterier eller anläggningen Använda döda eller avlivade växtmaterial. Utsätta plantan material till en mängd kemikalier, fixativ eller andra behandlingar såsom värme för att döda den. Tvätta växtmaterialet i vatten och inkubation medium efter användning av någon av dessa behandlingar. Sedan Inokulera bakterierna. Detta kommer inte att förstöra växten ytan men det kommer att göra det metaboliskt inaktiva så att det inte kan svara på bakterierna. Mäta bakteriell vidhäftning enligt beskrivningen i steg 6 eller 7. Också bestämma antalet livskraftiga celler tillsätts inkubering med växtmaterial i början av ruvning och antalet livskraftiga celler som finns i slutet av inkubering att garantera att inga giftiga kemikalier var närvarande under ruvningen. Använda dött material. Användning bakteriell adherencen till dött material att avgöra om en effekt som sågs på bakteriell adherence till växtmaterial är på grund av en effekt på växten eller bakterier. Välja ett dött material som binder bakterierna och som liknar växtmaterial studerade i form och storlek. Möjligheter inkluderar filtrerpapper av alla typer (cellulosa, nitrocellulosa, glasfiber, polykarbonat, etc.), trådar (nylon, bomull, polyester, glasull, etc.), glas eller plast coverslips, rostfritt stål kuponger och dialys membran. Tvätta livlös materialet noga i vatten och det medium där ruvning kommer att genomföras och sterilisera den före användning. De flesta av de material som anges i steg 8.2.1 är stabila till sterilisering i autoklav. Inkubera livlös materialet på de önskade villkor och poäng som beskrivs i steg 6 och 7. Ett exempel på användning av nylontrådar att bestämma att minskad bindning av A. tumefaciens till rothår vid hög kalcium koncentrationer sker (åtminstone delvis) en effekt av kalcium på bakterier visas i figur 428.