Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Följsamhet av bakterier att plantera ytor uppmätta i laboratorium

doi: 10.3791/56599 Published: June 19, 2018

Summary

En enkel metod för att mäta och karaktärisera bakteriell vidhäftning till växter, särskilt rötter och groddar, beskrivs i denna artikel.

Abstract

Detta manuskript beskriver en metod att mäta bakteriell bindning till axenic växt ytor i mikroskopet ljus och med hjälp av livskraftiga blodkroppar. Växtmaterial som används inkluderar rötter, skott, blad och skära frukter. De metoder som beskrivs är billig, lätt och lämplig för små urvalsstorlekar. Bindande mäts i laboratorium och en mängd inkubation media och villkor kan användas. Effekten av hämmare kan bestämmas. Situationer som främjar och hämma bindningen kan också bedömas. I vissa fall är det möjligt att särskilja huruvida olika villkor ändra bindning primärt på grund av deras effekter på anläggningen eller på bakterier.

Introduction

Mätning av bakteriell bindning att plantera ytor har blivit viktiga i tre skilda situationer. Den första situationen är granskningen av överföringen av mänskliga patogener på växt ytor1,2,3. Målet här är att förhindra bakteriell bindning eller att ta bort eller döda bundna bakterier och därmed att minska överföring av sjukdom av växtmaterial. Den andra situationen är undersökningen av bindningen av växten patogener att plantera ytor4. Än en gång målet här är att förhindra bindning eller att ta bort eller döda bundna bakterier och därmed att minska sjukdom. Den tredje situationen är undersökningen av bindningen av symbiotiska eller växt-tillväxt-främja bakterier5,6. Målet här är att främja bakterie bindande och därigenom öka växtskydd och gröda avkastning.

Teknikerna för mätning av bakteriell bindning att plantera ytor som beskrivs i denna artikel är billigt och relativt enkelt att utföra. De enda krav är ett mikroskop och material i allmänhet återfinns i ett laboratorium för bakteriologi. Ett bad någon sonikator är användbar för vissa tekniker. De tekniker som beskrivs är utformade för bindande experiment som genomförs med hjälp av relativt små urvalsstorlekar. Mätningar av bindande görs i laboratorium, även om det kan vara möjligt att ändra några av dessa tekniker för användning i växthuset eller i fältet.

Dessa tekniker har använts för att mäta bakteriell bindning till rötter, groddar, skurna blad, skär frukterna och intakt körsbärstomater i laboratoriet7,8,9,10,11, 12,13,14,15. De har också använts för att mäta rot koloniseringen av växter som växer i jord eller sand i laboratoriet16. Tekniker har använts med många bakteriearter inklusive Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, och Pseudomonas fluorescens. En användbar Beskrivning av metoder för att bedöma samspelet mellan A. tumefaciens med ytor kan hittas i Morton och Fuqua (2012)17. I alla fall var inblandade urvalsstorlekarna små, vanligen mindre än 25-50 växter. De tekniker som beskrivs är lämplig för användning med mänskliga patogener som måste hållas innehöll under experimenten.

Protocol

1. beredning av Axenic växtmaterial

  1. Förbereda plantor som odlas i vatten.
    1. Placera ett litet antal frön (mindre än 30) i en 30, 50, 100 eller 150 mL glasbägare. Vi har använt tomat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, ärter, bönor, tobak, sallad och morot utsäde med detta protokoll.
      Obs: För att avgöra hur många frön kan steriliseras tillsammans utan kontaminering som sprider sig från ett frö till en annan, se steg 1.1.2.
    2. Täck fröna med 80% etanol och snurra kort. Låt fröna blöt i 1 min.
    3. Häll av etanolen och täck fröna med en lösning av 50% av volymen kommersiella blekmedel (NaClO) och 0,1% Triton x-100 i kranvatten. Låt fröna blöt i 20 min.
      Obs: Om fröna är stora, till exempel frön, kan det vara nödvändigt att förlänga blötläggning tid att helt döda svampen på utsäde ytan.
    4. Häll av blekmedel blandningen och tvätta fröna 3 gånger med sterilt vatten. Låt fröna blöt i vattnet för 1 min för varje tvätt.
    5. För att erhålla lägga axenic plantor en liten mängd sterilt vatten mellan 5 och 25 mL beroende på storleken på fröna. Häll frön och vatten i en steril petriskål för frögroning.
      Obs: Vattnet bör täcka botten av skålen men inte täcka fröna för att uppmuntra bildandet av rothår. Axenic beskriver en kultur där endast en enda art av organismen är närvarande.
    6. Inkubera i mörkret tills plantorna når önskad storlek mellan 1 cm och 10 cm (ca 5 dagar för tomat och A. thaliana och 1 till 3 dagar för alfalfa). För större frön använder en täckt steril behållare med en kapacitet på mer än 100 mL såsom en glasskål täckt med folie.
  2. Bestämma frekvensen av kontaminering av en viss utsädespartiet med mikroorganismer som förblir lönsamt eller inom frön efter surface-sterilisering.
    Obs: Detta är nödvändigt eftersom enstaka frön bära mikroorganismer under utsäde pälsen som inte kan dödas av surface-sterilisering. Använda frekvensen av smittade frön i ett fröparti för att avgöra hur många frön för att sterilisera på en gång utan en hög risk för gruppen av frön förorenas på grund av ett frö med bakterier eller svampar som överlever behandlingen.
    1. Utför steg 1.1.1 genom 1.1.3.
    2. Placera frön på ett näringsämne agar petriskål. Sätta 10-30 frön i varje maträtt avstånd dem så att de kan vara poängsätts individuellt. Tätning av rätter med tejp eller tätning film.
    3. Inkubera under 3-5 dagar vid 25 ° C scoring varje dag för synlig utväxt av mikroorganismer från frön.
  3. Förbereda plantor som odlas i sand. Plantor kan odlas i sand för användning i bakteriell vidhäftning experiment.
    1. Utför steg 1.1.1 genom 1.1.3.
    2. Sterilisera kvarts eller sea sand i autoklav. Båda dessa innehåller några organiska material. Om detta kommer att påverka experimentet, tvätta sanden genom att täcka den med två gånger sin volym av 0,1 M HCl. Mix för 10 min. Tillåt sanden för att bosätta sig och häll av vätskan. Skölj sanden 3 gånger med vatten, och en gång med 80% etanol följt av två ytterligare vatten sköljningar använder samma protokoll när det gäller den 0,1 M HCl. Sterilize tvättade sanden i autoklav.
    3. Sterilisera behållare genom att dränka dem i 50% blekmedel för 5 min och skölj dem 5 gånger med sterilt vatten genom nedsänkning. Låt dem torka och täta botten med tätning film. Filmen som erhålls från tillverkaren är generellt gratis av mikroorganismer på insidan sidan som bör placeras mot insidan av behållaren.
    4. Blanda den steril sanden med tillräckligt sterilt vatten och blöt det tillräckligt att sand pinnar tillsammans. Beloppet beror på hur torr sand är. Vanligtvis räcker 10-35% av volymen av sanden. Placera den våt sanden i behållaren ger tillräckligt djup för längden på rötter behövs och tillräckligt utrymme ovanför sanden för tillväxt av skott. De exakta avstånd beror på art och sort av växten som används.
    5. Plantera frön.
      1. Gör ett grunt hål i sanden med en steril glasstav bara tillräckligt djup för att placera utsädet under ytan av sanden (ungefär 1-5 mm). Placera utsädet i hålet. Täck den med ett tunt lager av sand. Försegla toppen av behållaren med tätning film för att förhindra förlust av vatten och ingången till ytterligare mikrober.
      2. Odla växterna i labbet under en lampa eller i växthuset vid en lämplig temperatur och dag-längd för art och sort av anläggningen. Använd rumstemperatur och 12 h ljus/mörk cykler för tomat, alfalfa eller Arabidopsis thaliana .
    6. Plantera plantor i ett hål i sanden (1-2 mm i diameter och djup nog att roten kommer att täckas med sand). Gör hålet med en steril glasstav. Guide roten försiktigt in i hålet med en steril rostfritt stål virknål om det behövs och fylla sidorna av hålet med sand.
  4. Alternativt, odla växter axenically på eller i agar som innehåller en blandning av salter såsom MS salter. Använd skott av axenic växter som odlas i agar direkt. Undvika rötter vuxit med agar som agar pinnar att både växt ytan och bakterier. Detta kan resultera i ett falskt intryck av bakteriell vidhäftning till växten ytan.

2. beredning av annat växtmaterial

  1. Tvätta växtmaterial som odlas i växthus med vatten före användning för att minska antalet inhemska mikrober. Det kommer finnas bakterier och svampar på växterna. Protozoer kommer att finnas i jorden, på rötterna, och möjligen på bladen. Tvätt med blekmedel eller etanol kommer att förändra växt ytan och rekommenderas inte.
    1. Om efter vatten tvätt betydande antal mikrober förbli, behandla växter med utspädd flytande handtvål eller utspädd väteperoxid (0,01%) att ta bort eller döda mikrober. Detta är generellt mindre skadligt för växten än blekmedel eller etanol.
  2. Växtmaterial som köpt på en lokal marknad är svårt att sanera, välja material som inte verkar har varit föremål för lång lagring. Undvik delar av materialet som förefaller brun eller skadade.
    1. Tvätta med vatten och göra färska nedskärningar på ändarna av material som tidigare har tagits bort innan du använder den, om inte samspelet mellan test bakterierna med bakterier (och Eukaryoter) som kommer ha ansamlats på skär platser är av intresse. Tvätta inte med blekmedel eller etanol som de kommer att förändra växt ytan.
  3. Behandla såret platser. Såret webbplatser ger ofta bakterier tillträde till inre av plant material18.
    1. Blockera eller minska bakteriell fastsättning och rörelse genom, sår eller klippa webbplatser som skapas i förbereda materialet genom att doppa den skurna kanten i smält paraffin eller genom att måla webbplatsen med smält paraffin med en liten borste. Använd inte en spatel eller någon skarp implementera eftersom det kan skada vävnaden.
    2. Seal stem ärr på frukt såsom tomater med paraffin. Vissa bakterier kommer att simma in i området under paraffinet, men deras antal är i allmänhet små.
    3. Om bakteriell tas i såret platser av intresse, uppskattning avståndet som bakterier kan flytta bärs av vattenströmmar eller diffusion genom att observera förflyttning av ett färgämne tillsätts lösningen. Markera rörliga bakterier genom att införa en gen som kodar en fluorescerande protein såsom grönt fluorescerande protein (GFP) in i dem och spåra dem med fluorescensmikroskopi som beskrivs i steg 6.1.219.

3. beredning av bakterier

  1. Odla bakterier. Använd ett medium som närmast approximerar villkor bakterier sannolikt har exponerats för omedelbart före stöter växten i den verkliga världen utanför laboratoriet. Kol och kväve källor samt förekomsten av joner, särskilt divalenta katjoner (Ca, Mg, Fe, Mn och Zn) och fosfat, och pH-värdet i mediet är viktiga.
    1. Använd AB minimalmedium eller Luria buljong för A. tumefaciens och andra jord bakterier20. För E. coli, som kan ha sitt ursprung i tarmen, använda Luria buljong.
    2. Lägg till inducerare såsom rot exudat eller kommersiella växtextrakt såsom soytone eller sockerarter såsom sackaros eller xylos till medelstora21. Om dessa ämnen används som inducerare, lägga till en låg koncentration, till exempel 0,01%. Om de är Använd kolkällor, lägga en högre koncentration, till exempel 0,1%.
  2. Förbereda det bakteriella inokulatet. Späd ut bakterierna i sterilt vatten eller i det medium där ruvning kommer att genomföras och lägga till dem i växtmaterial. Den tillämpliga utspädningen diskuteras i steg 4.2 och 4.3.
    1. Ta bort tillväxt medier innan du använder bakterier, Centrifugera bakteriesuspensionen vid 10 000 x g i 2 min, Häll av supernatanten och återsuspendera bakterier av vortexa dem i samma medium som kommer att användas för inkubation med växtmaterial. Denna metod kan ta bort eller minska antalet eller mängd extracellulära material och bihang såsom exopolysaccharides, kapslar, flagellae eller pili. Om det är viktigt att dessa ytstrukturer förblir intakta, sedan helt enkelt späd bakterierna innan vaccinera dem eller använda en alternativ metod som beskrivs i steg 3.2.2.
    2. Som en alternativ metod att ta bort odlingsmedium, samla in bakterierna på nitrocellulosa eller polykarbonat filter med en porstorlek på 0,2 µm eller mindre. Tvätta bakterierna med inkubation medium och resuspendera dem av milda skakningar eller vortexa av filtret i en steril behållare av medium.

4. inympning av bakterier

  1. Bestämma antalet bakterier att ympas med hänvisning till mätning för att bestämma bakteriell vidhäftning och längden på inkubationstiden.
  2. Inokulera relativt stort antal bakterier för mikroskopiska studier inkubation gånger mindre än 1 dag. Lägga till ett belopp av kultur att nå en slutlig bakteriell koncentration på mer än 106 bakterier per mL. Minska bakteriell inokulum för längre inkubationstider.
  3. För studier där bakteriell vidhäftning kommer att mätas genom livskraftiga blodkroppar, lägga till ett belopp av kultur att nå en slutlig bakteriell koncentration 103 till 106 bakterier per mL.
  4. Undvik att lägga till så många bakterier som deras metabolism förändringar pH eller syre koncentrationen inkubation medium. Mät pH med pH-papper eller en elektrod. Mäta syrehalten använder en syre-elektrod.
  5. För växter som odlas i sand, Inokulera i tre möjliga sätt.
    1. Ympa utsädet med bakterierna före plantering genom att blötlägga fröet till 1 min i en suspension i vatten ca 106 bakterier per mL.
    2. Inokulera roten med spira axenic plantor som beskrivs i avsnitt 1 och när plantan roten är ca 1 cm lång doppa den eller att placera hela plantan i en suspension av 106 bakterier per mL i vatten i 1 min.
    3. Inokulera sand genom att blanda bakterierna med sanden innan plantering för att ge en slutlig koncentration på cirka 103 bakterier per mL eller vattna plantan med en suspension av 106 bakterier per mL efter plantering.

5. inkubation av bakterierna med växtmaterial

  1. För inkubering i flytande media Inkubera bakterierna med växtmaterial i sterilt vatten eller sackaros och mineralsalter eller plantera vävnad odlingsmedium (t ex en 1:10 utspädning av MS salter)22,23.
    1. Använd en behållare som bakterierna inte klibbar. Försök att hålla växten ytan täckt kontinuerligt antingen genom nedsänkning eller vaggning. Kraftig agitation kan förhindra vidhäftning eller ens ta bort bakterier från växten ytan.
    2. Observera växtmaterialet i mikroskopet ljus efter varierande tidsintervall att avgöra när du ska stoppa ruvning och göra mätningar. En tidsförloppet för vidhäftning är ofta värdefullt med prover tagna varje 1 till 4 h eller varje dag beroende på hastigheten på interaktionen.
  2. För att odla i sand, gäller samma överväganden beskrivs för inkubering i flytande medium i steg 5.1.

6. mätning av vidhäftning med mikroskopi

  1. Gör mikroskopiska mätningar med Nomarski eller faskontrast optik för enkel visning av bakterier på ytor. Dock kan några ljusa fält Mikroskop med förstoring 20 X eller högre användas.
    1. Använd mikroskopisk observation för att avgöra om bakterierna är slumpmässigt fördelade eller på särskilda platser. Kontrollera även om de är bundna ensamma eller i kluster. Leta efter förekomsten av microcolonies tyder på bakteriell tillväxt eller brottsprovokation efter vidhäftning. Kontrollera huruvida bakterierna verkar utgöra en biofilm på ytan.
      Obs: En biofilm är ett stort antal bakterier bunden till ytan och omgiven av en extracellulär matrix23,24,25. Strukturen kan vara smidig och enhetlig eller ha en mer komplicerad arkitektur. Metoder för att studera biofilmer är associerad med växt ytor har varit beskrivs17.
    2. Använda bakterier med en fluorescerande markör etiketten. Om andra bakterier är närvarande och bakterier av intresse identifieras av en fluorescerande etikett t ex grönt fluorescerande protein, använda fluorescensmikroskopi för att bestämma förekomsten av märkta bakterier i kluster av andra bakterier26. För GFP, Använd ett filter med 490 nm excitation och 520 nm utsläpp.
      1. Kontrollera att taggen fluorescerande inte negativt påverkar bakterier genom att observera adherencen till axenic material av en lika blandning av vild typ bakterier och märkta bakterier av samma stam med både Nomarski och fluorescens optik. Om lysrör och mörka bakterierna är slumpmässigt blandade och närvarande i jämlike numrerar sedan etiketten inte interferera med analysen.
  2. Bestämma antalet bifogade bakterier.
    Obs: Det är mycket svårt att avgöra antalet bifogade bakterier i mikroskopet. När bindningen är ojämn växt ytor, är det i allmänhet inte möjligt att få en kvantitativ mätning. Svepelektronmikroskopi (inte diskuteras i denna artikel) kan användas för att göra sådana mätningar.
    1. När bakterierna är bundna till en slät yta såsom ett rot hår, räkna antalet bakterier bunden till kanten av roten håret per mm rot hårets längd. Var noga med för att använda rothår av ungefär samma storlek och form i jämföra mätningar.
    2. För att bestämma storleken på objekt i mikroskopet, använda en kommersiell bild med uppmätta markeringar på den. Observera och fotografera denna bild på samma inställningar som används för experimentella material och använda bilderna för att bestämma storleken på objekt i mikrofotografier.
  3. Förbereda provet för mikroskopi.
    1. Tvätta provet. Flytta provet till en droppe vatten eller inkubation medium på ett objektglas och observera det direkt.
      Obs: Detta har den fördelen att om det fanns ingen bakterietillväxt eller faktiska bakteriell döden det är osannolikt att många gratis bakterier. Ta avsaknad av gratis bakterier som en varningssignal om att det kan ha varit bakteriell dödsfall eller bakteriell bindning till behållaren där ruvning genomfördes. Effekten av tvätta provet visas i figur 1.
    2. Tvätta provet försiktigt i vatten eller inkubation medium genom att placera det i en flaska med vätska och vända injektionsflaskan försiktigt. Placera sedan provet i mikroskopet bilden i färska vätska för observation.
    3. Montera provet i vätskan med hjälp av en vanlig täckglas och objektglas.
      1. Om provet är tjock och så skulle göra en utbuktning under cover slip, Använd en press-apply täckglas. Dessa täckglas har en ring av gummi eller plast runt kanten på täckglaset. Placera vätska och prov i brunnen i täckglaset och sedan placera bilden ovanpå och tryck ner försiktigt för att försegla täckglaset till bild. Invertera och undersöka.
      2. Alternativt använda en alger räknar bild och täckglas på ett liknande sätt. Observera att bilder med detta djup generellt inte kan undersökas med ett objektiv som är större än 20 X förstoring.

Figure 1
Figur 1 : Steg i utarbetandet av ett prov för att fastställa antalet bundna bakterier. A. tumefaciens bindning till tomat rothår (A, B och C) och nylontrådar (D, E och F). I prover som är monterad i vatten utan tvätt både bunden bakterier (svarta pilar) och gratis bakterier (vita pilar) kan ses (A och D). Efter tvätt bundna bakterier kvar men gratis bakterier inte längre presentera (B och E). Efter ultraljudsbehandling har bundna bakterierna tagits bort från urvalet ytan (C och F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Om fluorescerande bakterier användes, granska provet i mikroskopet efter sanden har tagits bort. Rötterna av växter som odlas i sand är i allmänhet inte lämplig för mikroskopi som sand partiklarna störa observationen av bakterierna.
    1. Ta bort anläggningen från en tillväxt behållare enligt steg 7. Rötterna i en behållare med vatten och blanda försiktigt för att ta bort sanden som kvittar till botten av behållaren.
    2. Ta bort anläggningen från tvättvattnet och montera provet som i steg 6.3.3.

7. mätning av vidhäftning med livskraftiga cell räknas

  1. Bestämma antalet livskraftiga bifogade bakterier använder en någon sonikator.
    1. Ta bort obundna bakterier. Placera provet i en injektionsflaska med tillräckligt med vatten, tvätta buffert eller inkubation medium för att täcka växtmaterial och Vänd injektionsflaskan flera gånger.
      1. Om det fanns mer än 103 gratis bakterier per mL i första ruvning, utföra sekventiella sköljvattnet för att ta bort dem alla. Kontrollera i ett ljusmikroskop (se steg 6.3) att fastställa förekomsten av gratis bakterier.
      2. Tvätta tills det finns en betydande minskning av antalet gratis bakterier men kom ihåg att det finns en jämvikt mellan bundna och obundna bakterier så antalet gratis bakterier kan aldrig minska till noll.
    2. Ta bort provet från injektionsflaskan med tvättvätska med en pincett eller spatel.
    3. Bestämma antalet bundna bakterier i inkubationer av växter i vätska.
      1. Avbryta tvättas provet i en injektionsflaska och täck den med en uppmätt volym av vatten, inkubation medium eller tvätt buffert. Använd tillräckligt med vätska för att täcka provet. Placera injektionsflaskan i ett bad någon sonikator och Sonikera det för en min.
      2. Ta bort provet och undersöka det under mikroskopet ljus att avgöra huruvida de bundna bakterierna har avlägsnats från anläggningen. Borttagning av bakterier från ett urval av ultraljudsbehandling visas i figur 1. Om det finns fortfarande bunden bakterier finns fortsätta sonicating provet tills sådan en tid som ingen bunden bakterier kvar på prov ytan. Om de bundna bakterierna inte kan avlägsnas genom ultraljudsbehandling, Lägg till 1-10 mg/mL steril kvartssand och upprepa ultraljudsbehandling och mikroskopisk undersökning.
      3. Fastställa att förfarandet ultraljudsbehandling som visas mest effektiva i steg 7.1.3.2 inte minskar lönsamheten för bakterier genom att avbryta bakterier från en flytande kultur i lösningen som ska användas för ultraljudsbehandling (Lägg kvartssand, om det var nödvändigt). Bestämma antalet livskraftiga celler. Sonikera bakterierna och avgöra det livskraftiga celltalet igen.
        Obs: Om det finns en minskning av livskraftiga celltal, ändra förfarandet genom att ändra sammansättningen av den vätska eller ultraljudsbehandling tid tills behandlingen har ingen effekt på livskraftiga celltal.
      4. Bestämma att utspädning bufferten används för livskraftiga blodkroppar inte påverkar lönsamheten för bakterier som har inkuberats enligt de villkor som används genom att jämföra livskraftig blodkroppar med olika utspädning buffertar och/eller vatten.
  2. Bestämma antalet livskraftiga bifogade bakterierna med homogenisering.
    1. Placera provet i en steril mortel eller mixer eller annan homogenisering enhet. Täck den med en uppmätt volym av sterilt vatten, inkubation medium eller tvätta buffert27. Använda en volym som är tillräckliga för att täcka provet. Använd 100 mL för en mixer.
    2. Finfördela provet tills det är väl homogeniseras. Kontrollera pH-värdet efter homogenisering vara säker på att syra frigörs från växt vävnaden inte har orsakat en kraftig nedgång i pH under 7. Om pH-värdet har sjunkit använda en buffert som fosfatbuffert i homogenisering vätskan för att upprätthålla pH.
    3. Bestämma antalet livskraftiga celler.
  3. Använda bakterier markerade med antibiotikaresistens.
    1. I situationer där det finns mer än en typ av bakterie, markera bakteriestammar med spontan resistens mot antibiotika (vanligtvis rifampicin och nalidixic syra).
      1. Fastställa nivån på antibiotika att använda. Om det finns kulturer av andra organismer förväntas vara närvarande i ruvning tallrik dessa kulturer odlas enligt villkoren för den avsedda inkubationen med växter på plåtar som innehåller en serie koncentrationer av valda antibiotika. Fastställa den lägsta koncentration som inte medger tillväxt av någon av dessa organismer. Detta är den lägsta koncentrationen av antibiotika som behöver testa bakterierna är resistenta.
      2. Erhålla spontan antibiotikaresistenta mutanter. Växer en kultur av bakterier i rikt medium till sena logg eller stationär fas. Plattan 0,1 mL outspädd på en tallrik som innehåller önskad antibiotika vid en lämplig koncentration. Fastställa koncentrationerna att använda som beskrivs i steg 7.3.1.1. Hålla och rena bakterier som växer och därmed är resistenta mot antibiotika.
      3. Bestämma att antibiotikaresistens inte minskar tillväxten av bakterier genom att göra en tillväxtkurva i flytande medium av förälder och antibiotikaresistenta stammar. Bestämma att antibiotikaresistenta bakterier visar samma nivå av koloniseringen av axenic växtmaterial som parentalstammen, om detta är möjligt.
  4. Bestämma antalet livskraftiga bakterier bunden till växter som odlas i sand.
    1. Ta bort anläggningen från behållaren och sand. Ta bort växter från behållare genom att först ta bort tätande material på toppen och botten av behållaren. Placera behållaren över en steril papperslapp och försiktigt ta bort hela sand eller jord och växt som en stor avsmalnande cylinder genom att försiktigt knacka behållaren mot en yta att lossa materialet.
      1. Om det behövs, Använd en spatel eller stav för att lossa materialet runt kanterna går i genom botten av behållaren.
    2. När cylindern av sand eller jord som innehåller växten är gratis på papper, dela den i mitten att avslöja växtrötter. Om du vill ta prover av sand från nära kanten av behållaren samt nära roten. Detta kan vara användbart att fastställa spridning (och ackumulering och tillväxt) av bakterier.
    3. Mät längden på roten. Plocka upp roten och ta bort sand och bakterier följa löst till roten (odlingsbädden materialet) genom att doppa roten i en uppmätt volym av vatten eller buffert och försiktigt skaka den. Avgöra det livskraftiga celltalet av bakterier i den resulterande suspensionen av plätering på ett lämpligt medium såsom Luria agar. Detta motsvarar antalet bakterier löst associerade med roten.
  5. Ta bort tätt bundna bakterier av ultraljudsbehandling och bestämma deras antal enligt steg 7,1.
  6. Alternativt, för att avgöra på plats på roten av tätt bundna bakterier placera tvättade roten på ytan av en petriskål innehållande näringsagar eller annat lämpligt medium. Observera placeringen av bakteriekolonier i roten under de kommande 3 dagarna med en dissekera lupp eller förstoringsglas.
  7. Express resultat som antalet bakterier per planta, per cm2 yta, per cm rot längd eller per gram färsk vikt vävnad. Göra flera replikat på samma dag och även göra replikat på olika dagar med olika bakteriekulturer och olika massor av växtmaterial.

8. att bestämma om en effekt av inkubationsförhållanden på vidhäftning beror på en reaktion av bakterier eller anläggningen

  1. Använda döda eller avlivade växtmaterial.
    1. Utsätta plantan material till en mängd kemikalier, fixativ eller andra behandlingar såsom värme för att döda den. Tvätta växtmaterialet i vatten och inkubation medium efter användning av någon av dessa behandlingar. Sedan Inokulera bakterierna. Detta kommer inte att förstöra växten ytan men det kommer att göra det metaboliskt inaktiva så att det inte kan svara på bakterierna.
    2. Mäta bakteriell vidhäftning enligt beskrivningen i steg 6 eller 7. Också bestämma antalet livskraftiga celler tillsätts inkubering med växtmaterial i början av ruvning och antalet livskraftiga celler som finns i slutet av inkubering att garantera att inga giftiga kemikalier var närvarande under ruvningen.
  2. Använda dött material.
    1. Användning bakteriell adherencen till dött material att avgöra om en effekt som sågs på bakteriell adherence till växtmaterial är på grund av en effekt på växten eller bakterier. Välja ett dött material som binder bakterierna och som liknar växtmaterial studerade i form och storlek. Möjligheter inkluderar filtrerpapper av alla typer (cellulosa, nitrocellulosa, glasfiber, polykarbonat, etc.), trådar (nylon, bomull, polyester, glasull, etc.), glas eller plast coverslips, rostfritt stål kuponger och dialys membran.
    2. Tvätta livlös materialet noga i vatten och det medium där ruvning kommer att genomföras och sterilisera den före användning. De flesta av de material som anges i steg 8.2.1 är stabila till sterilisering i autoklav.
    3. Inkubera livlös materialet på de önskade villkor och poäng som beskrivs i steg 6 och 7. Ett exempel på användning av nylontrådar att bestämma att minskad bindning av A. tumefaciens till rothår vid hög kalcium koncentrationer sker (åtminstone delvis) en effekt av kalcium på bakterier visas i figur 428.

Representative Results

A. tumefaciens colonizes rotytor. För att avgöra huruvida bakteriell produktion av cellulosa spelar en roll i roten kolonisation, effekterna av bakteriell mutationer som hindrar cellulosa syntes var undersökt16. Metoder som beskrivs i steg 1.3 och 7,1 användes. Tomat frön var ytan steriliseras och grodde i sterilt vatten. När rötterna var cirka 2 cm långa var de doppad i en suspension av 105 bakterier per mL och planterade i pastöriserad jord i behållare. Växterna har vuxit under 14 dagar vid 25 ° C på en 12 h ljus/12 h mörka cykel. Efter den angivna tider växterna togs bort från behållarna. Rötterna var tvättas och sonicated i ett bad någon sonikator ta bort bunden bakterier. Bakteriella nummer bestämdes med hjälp av livskraftiga blodkroppar. Figur 2 visar effekten av två olika cellulosa-minus mutationer på möjligheten för bakterierna att kolonisera tomat rötter. Trots standardavvikelserna för vissa mätningar var så hög som 0,9 log10 (ett vanligt problem med denna typ av mätning) minskningen i bindning av cellulosa-minus mutanter är tydligt och vi kan konstatera att bakteriell produktion av cellulosa hjälpmedel bakterierna koloniseringen av tomat rötter.

Figure 2
Figur 2 : Root koloniseringen av vildtyp och cellulosa-minus mutanter av A. tumefaciens. Log10 totala antalet bakterier per cm rot längd återhämtat sig från tomat rötter inokuleras med vildtyp A. tumefaciens stam C58 och cellulosa-minus mutanter C58:1 och C58:A60. De nummer som visas är medel från minst fyra separata experiment. Staplarna visar standardavvikelser av hjälpmedlet. Rötterna var inokuleras genom att doppa dem i en suspension av 105 bakterier per mL för en min. Växterna har odlats i behållare och löst vidhäftande bakterierna togs bort genom att tvätta rötterna i tvätt buffert i en injektionsflaska av glas. Hårt fastsittande bakterier togs bort med hjälp av ett bad någon sonikator och resulterande upphängning förkromad för att fastställa livskraftiga blodkroppar16. Denna siffra har ändrats från Matthysse och McMahan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Rollen som exopolysaccharides i bindningen av E. coli och andra bakterier till alfalfagroddar undersöktes. Vissa utbrott av diarrheal sjukdom orsakad av E. coli O157: H7 har spårats till förorenade alfalfagroddar. Bindningen av vildtyp bakterier och mutanter inte göra olika exopolysaccharides mättes med hjälp av de metoder som beskrivs i steg 1.1, 5.1 och 7,2. Alfalfagroddar var ytan steriliseras och grodde för en dag i sterilt vatten vid 25 ° C i mörker. Fyra skott med bifogade frö rockar placerades i sterila plast rätter som innehåller 5 mL vatten. Bakterier som odlas i Luria buljong har lagts till en slutlig koncentration på cirka 5 x 103 per mL. Inokulerade bladen inkuberades vid 25 ° C i mörker i 3 dagar. Bladen var tvättas två gånger i 5 mL sterilt vatten i en injektionsflaska av kraftig inversion och homogeniseras i tvätt buffert med en motordriven Teflon glas Homogenisatorer. Tidigare experiment med bakterier märkt med en plasmid bära genen för GFP visade inga internaliserade bakterier även om ytan bakterier observerades enkelt. Resultaten redovisas i tabell 1. Två stammar av E. coli O157: H7 undersöktes. I båda stammar visades produktion av poly-β-1,6-glukuronsyra acid(PGA) att det största bidraget till bindningen av patogena E. coli att plantera ytor. Colonic syra spelade också en betydande roll i bindningen. Medan minskningen av bindning i cellulosa-minus mutanter var betydande var det inte så stor som för de andra två polysackarider.

Effekter av mutationer i gener som Exopolysaccharide produktion på bindande av E. coli O157: H7 groddar och öppna frö rockar
Bakteriestam Mutation eller genotyp (relevanta fenotyp) Log10 antal bakterier bundna per spira eller utsäde päls
Alfalfa groddarb Öppna frö rockar
86-24 Ingen (vildtyp) 4.7 ± 0,6 5.6 ± 0,2
8624N yhjN (cellulosa-minus) 2.9 ± 0,7c 3,5 ± 0,6c
8624C wcaD (colonic syra-minus) 1.8 ± 0,7c 2.4 ± 0,5c
8624P pgaC (PGA-minus) < 1.0c 1,0 ± 1.0c
DEC4A Ingen (vildtyp) 5.6 ± 0,2 6.1 ± 0,3
DEC4AN yhjN (cellulosa-minus) 4,8 ± 0,8d 4.1 ± 0,8d
DEC4AC wcaD (colonic syra-minus) 3,9 ± 0,5c 4,8 ± 0,8d
DEC4AP pgaC (PGA-minus) < 1.0c 1.2 ± 0,7c
ett medelvärde ± standardavvikelse för minst tre mätningar av antalet (log10) bakterier bundna efter 3 dagar.
b groddar spolades före mätning.
c avsevärt skiljer sig från den vilda typ: P < 0,01.
d avsevärt skiljer sig från den vilda typ: P < 0,05.
Den här tabellen har ändrats från Matthysse, Deora, Mishra och Torres10.

Tabell 1: effekter av mutationer i gener som exopolysaccharide produktion på bindningen av E. coli O157: H7 till groddar. För att avgöra betydelsen av olika exopolysaccharides och lipopolysackarid i bindningen av patogena E. coli O157: H7-stammar till alfalfagroddar, bindningen av en uppsättning av mutanter till groddar och öppna frö rockar undersöktes med hjälp av metoder beskrivs i steg 6. Resultaten visade att poly-ß-1, 6 -N-acetyl-D-glukosamin (PGA) verkar vara viktigt för bindning till groddar och det både cellulosa och colanic syran krävs för maximal bindning av E. coli O157. Den här tabellen har ändrats från Matthysse, Deora, Mishra och Torres10.

För att avgöra om tillverkningen av PGA är tillräcklig för att orsaka bakteriell bindning att plantera ytor, en plasmid (pMM11) bär den klonade operon kodning gener krävs för PGA infördes produktion i två olika bakterier som inte skulle normalt kunna binda till tomat rötter10. A. tumefaciens A1045 är en mutant av vildtyp stammen C58 som underlåter att göra cykliska-β-1,2-glukan och underlåter också att binda för att plantera ytor29. Sinorhizobium meliloti 1021 som bildar roten knölar på alfalfa misslyckas att binda till icke-baljväxter inklusive tomat12. Metoder som beskrivs i steg 1.1, 5.1, 6.3 och 7,1 användes för att avgöra om förmågan att göra PGA generellt ökad bakteriell bindning till rotytor. Tomat frön var ytan steriliseras och grodde i sterilt vatten. Rötterna var skuren i segment 1 cm i längd och placeras i sterilt vatten och bakterier var vaccinerat. När dessa två arter av bakterier växer i olika takt, mättes bindande vid olika tidpunkter för ungefär lika mängder bakterietillväxt. Förekomsten av de plasmiden pMM11 orsakade en liknande betydande ökning i antalet bundna bakterier av båda arter (tabell 2)10. En betydande ökning av bindande sågs också i ljusmikroskop men bindningen var mycket olika för de två arterna (figur 3). A. tumefaciens A1045 bunden som enskilda bakterier till rotytan. S. meliloti bunden i stora kluster där endast några av bakterierna fästes direkt till roten och majoriteten av bakterierna fästes till andra bakterier. Detta exempel visar att enkelt analysera antalet bakterier bunden utan inklusive mikroskopiska observationer kan ge ett missvisande intryck av resultaten av ett experiment. Men båda metoderna (livskraftiga blodkroppar och mikroskopiska observationer) visar att pMM11 ökade bakteriell bindning till tomat rötter, var typen av bindning som orsakas av produktion av PGA olika för de två bakteriearter10.

Effekten av de plasmiden pMM11 på bindning av bakterier till tomat rötter
Bakteriestam Plasmid Antalet bakterier bunden per mm rot längd
A. tumefaciens A1045en ingen 0,25 x 103 ± 0,25 x 103
pBBR1mcs (vektor) 0,25 x 103 ± 0,25 x 103
pMM11 (PGA syntes) 10 x 103 ± 0,25 x 103
S. meliloti 1021b ingen ingen upptäckt
pBBR1mcs (vektor) ingen upptäckt
pMM11 (PGA syntes) 50 x 103 ± 5 x 103
en bakteriell bindning mättes efter 2 timmar
var b bakterie bindande åtgärd efter 18 timmar
Den här tabellen har ändrats från Matthysse, Deora, Mishra och Torres10.

Tabell 2: effekten av en plasmid bär gener för syntesen av PGA på bindningen av A. tumefaciens A1045 och S. meliloti 1021 till tomat rot segment. För att undersöka möjligheten av poly-β-1, 6 -N-acetyl-D-glukosamin (PGA) att främja bindning av bakterier att plantera rötter, effekten av en plasmid som ger möjlighet att göra PGA (pMM11) på bindningen av två bakteriestammar växt-associerade till tomat rötter undersöktes. Varken stam av bakterier visade signifikant bindning till tomat rötter i avsaknad av Plasmiden eller i närvaro av Plasmiden utan de gener som kodar PGA syntes (pBBR1mcs). Tillägg av Plasmiden bär PGA syntes gener ökad bindning av båda typer av bakterier. Eftersom A. tumefaciens växer snabbare än S. meliloti bindande mättes efter 2 h inkubation för A. tumefaciens och efter 18 h för S. meliloti. De tekniker som används är de som beskrivs i steg 7. Den här tabellen har ändrats från Matthysse, Deora, Mishra och Torres10.

Figure 3
Figur 3 : Effekten av den plasmiden pMM11 bär PGA biosyntes generna på bindningen av A. tumefaciens A1045 och S. meliloti 1021 till tomat rothår. Bindning till tomat rothår a) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 och D) S. meliloti 1021 pMM11. Även om ökningen i bindningen av de två bakteriearter är ungefär liknande är detaljer i bindningen som kan ses i mikroskopet ljus helt olika. De tekniker som används är de som beskrivs i steg 6. Denna siffra har ändrats från Matthysse, Deora, Mishra och Torres10Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Det är ibland möjligt att använda bindning till icke-biologiska ytor till stöd i särskilja bidraget av bakterier och av växten i en särskild interaktion. Den unipolar polysaccharide(UPP) av A. tumefaciens har visat sig kunna medla bakteriell bindning till en mängd både biologiska och icke-biologiska ytor30. Kalcium observerades för att hämma bindningen av A. tumefaciens att plantera ytor medieras av de UPP28. För att bestämma huruvida hämning av kalciumjoner av bakteriell bindning att plantera ytor på grund av en effekt på bakterier eller på växten ytan, undersöktes bindning av bakterier till nylontrådar. Teknikerna som beskrivs i steg 8,2 användes. Tomat frön var ytan steriliseras och grodde i vatten som beskrivs i steg 1. Bakterierna har vuxit i minimal medium med sackaros och lagts till tomat rötter eller nylontrådar med en slutlig koncentration på cirka 105/ml enligt steg 5.1. Effekten av extra CaCl2 på bakteriell bindning till tomat rötter och nylontrådar undersöktes i mikroskopet. Figur 4 visar en liknande hämning av bindningen av kalcium använder antingen yta tyder på att effekten av kalcium är primärt på bakterier10.

Figure 4
Figur 4 : Effekten av kalcium på bindningen av A. tumefaciens tomat rothår och nylontrådar. A. tumefaciens var inkuberas med tomat rötter (A och B) eller nylontrådar (C och D) för 24 h i en 1:10 utspädning av MS salter och en 1:20 utspädning av AB minimalmedium, 0,4% sackaros (A och C) eller i en 1:10 utspädning av MS salter och 1:20 utspädning av AB minimalmedium , 0.4% sackaros som innehåller 60 mM CaCl2 (B och D)31. Den tillagda CaCl2 hämmade bakteriell bindning till både rötter och nylontrådar som tyder på att hämning berodde främst på en effekt på bakterier i stället för på anläggningen ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det är viktigt att vara medveten om alla de ytor som bakterier kan följa under experimentet. Således bakterier som kan binda till glas kan vara underskattad om livskraftiga blodkroppar görs med hjälp av glasrör och pipetter. Om växter odlas i agar eller jord och några av agar eller jord kvar på plantorna kan sedan bakterierna binda det vidhäftande materialet i stället för växterna. Däremot, tvätta växt ytan, särskilt när det gäller rötter, kan ta bort naturliga ytbeläggningar såsom slemhinnor och därmed förändra resultaten av följsamhet tester.

Det är viktigt att vara säker på att de bakterier som lagts till blandningen inkubation förbli vid liv under experimentet. Således göras rutinmässigt livskraftig blodkroppar av gratis samt bifogade bakterier. Vissa behandlingar eller bakteriell mutationer kan minska bakteriell tillväxt eller faktiskt orsaka döden av en bråkdel av den bakteriella populationen. Levande och döda bakterier kanske inte distinguishable i mikroskopet om inte speciella fläckar används. Det finns en användbar fläcken kit för live/dead bakterier som beror på uteslutandet av färgämnen från levande bakterier. Om en blandad befolkning av bakteriearter finns sedan livskraftig blodkroppar av arter av intresse är dock sannolikt att vara den enklaste metoden att bestämma om ruvningen har resulterat i bakteriell död.

Medium sammansättning kommer att påverka bakteriella överlevnad och tillväxt. Root exsudat och material släppt från såret och skär platser kommer att ge substrat för att stödja blygsamma bakterietillväxt. Fosfat, kväve och järn tenderar att vara begränsande i dessa villkor. Divalenta katjoner såsom kalcium och magnesium kan påverka vidhäftningen. I vissa fall kan kolkälla påverka vidhäftningen. pH frågor också. I allmänhet är odlingsbädden pH mellan 5,5 och 6,5.

Det är nödvändigt att vara försiktig i att använda bakterier markerade med antibiotikaresistens. De antibiotika som oftast används är rifampicin och nalidixic syra. Resistens mot dessa antibiotika är i allmänhet på grund av mutationer i kromosomala gener (RNA-polymeras och gyras, respektive) och således kan inte enkelt överföras till en annan stam under ruvningen. Även leder denna typ av resistens inte i nedbrytning eller modifiering av antibiotika. Markera bakterier med en plasmid-burna genen markör rekommenderas inte såvida inte plasmiden inte kan överföras till alla andra bakterier. Antibiotikaresistens måste inte vara på grund av nedbrytning eller kemisk modifiering av antibiotikummen som antibiotika känsliga bakterier kommer sedan att kunna växa på antibiotika tallrikar om de ligger nära de resistenta bakterierna.

De metoder som beskrivs i detta dokument är användbara för små urvalsstorlekar och/eller experiment där proverna måste finnas (exempelvis experiment med mänskliga patogener). För stor urvalsstorlek (över 100 g material eller mer än 50 växter) skulle andra metoder eller drastisk ändring av dessa metoder vara behövs10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. förekomsten av stora mängder mikroorganismer än de arter som studeras kan också innebära betydande problem. Möjliga lösningar inkluderar användning av bakterier som markerats med en fluorescerande protein eller antibiotikaresistens enligt beskrivningen i steg 6.1.2 och 7.3. När bakterierna av intresse är sällsynta individer i en stor population av andra mikroorganismer kan dessa markörer dock inte tillräcklig för att göra en entydig bedömning av antalet bakterier som studeras.

Alla de metoder som beskrivs här är baserat laboratoriemetoder. Mindre ändringar skulle behövas för växthusgaser studier. Fler större modifieringar sannolikt kommer att krävas för fältstudier där protozoer, insekter och andra djur predation och klimat variation komplicerar tillhandahållandet av definierade villkor för experiment. Dessa metoder kan framöver utökas med samspelet mellan två eller fler mikroorganismer på anläggningen ytan.

Disclosures

Författaren förklarar att hon har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Författaren tack Susan Whitfield för förberedelse av siffror och Camille Martin och Hillary Samagaio för hjälp med några av experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
light microscope any N/A phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.
seeds any  N/A make a note of the seed lot number and the cultivar
bleach any N/A
bath sonicator any scientific supply company N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
nutrient agar  Difco  001-01-8
soytone Difco  24360
Sand sea sand Fisher Scientific S25
sand  Sigma-Aldrich S9887
conetainers Stuewe & Sons, Inc. Ray-Leach cone-tainers many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow
parafilm any scientific supply company N/A
MS salts Sigma-Aldrich M5524
parrafin any N/A
centrigfuge any scientific company N/A to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed
vortex mixer any scientific company
micrometer ACCU-SCOPE Accessories A3145
Sedgwick-rafter counting cell Hauser Scientific HS3800
probe-clip press-seal incubatin chamber Sigma-Aldrich Z359483
rifampicin Sigma-Aldrich R3501
naladixic acid Sigma-Aldrich n8878
Live/dead stain In Vitrogen Molecular Bioprobes L7007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).
  2. Beuchat, L. R. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables. Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).
  3. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  4. Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).
  5. Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).
  6. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).
  7. Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits. Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).
  8. Fuqua, C., Matthysse, A. G. Methods for studying bacterial biofilms associated with plants. Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).
  9. Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).
  10. Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).
  11. Matthysse, A. G., et al. The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).
  12. Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).
  13. Matthysse, A. G. Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells. Protoplasma. 183, 131-136 (1994).
  14. Matthysse, A. G., McMahan, S. The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).
  15. Jeter, C., Matthysse, A. G. Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).
  16. Matthysse, A. G., McMahan, S. Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).
  17. Morton, E. R., Fuqua, C. Phenotypic analyses of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 3 (2012).
  18. Brandl, M. T. Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).
  19. Franz, E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1 (2012).
  21. Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).
  22. Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).
  23. Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).
  24. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  25. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  26. Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).
  27. Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).
  28. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, 252 (2014).
  29. Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells. J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).
  30. Tomlinson, A. D., Fuqua, C. Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).
  31. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, (2014).
  32. Wright, K. M., et al. The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots. Phytopathology. 103, 333-340 (2013).
  33. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  34. Erickson, M. C., et al. Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions. J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).
  35. McKellar, R. C., et al. Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce. Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).
  36. Wu, F. M., et al. Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).
Följsamhet av bakterier att plantera ytor uppmätta i laboratorium
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).More

Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter