1. forberedelse av Axenic plantemateriale Forberede planter dyrket i vann. Sett et lite antall frø (mindre enn 30) i en 30, 50, 100 eller 150 mL glass kanne. Vi har brukt tomat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, ert, bønne, tobakk, salat og gulrot frø med denne protokollen.Merk: For å fastslå hvor mange frø kan steriliseres sammen uten forurensning sprer seg fra ett frø til en annen, kan du se trinn 1.1.2. Dekk frøene med 80% etanol og swirl kort. La frøene suge 1 min. Hell av etanol og dekk frøene med 50% av volumet kommersielle blekemiddel (NaClO) og 0,1% Triton X-100 i vann fra springen. La frøene suge for 20 min.Merk: Hvis frøene er stor, som bønne frø, kan det være nødvendig å forlenge soaking tiden helt drepe sopp på frø overflaten. Hell av blekemiddel blandingen og vask frøene 3 ganger med sterilt vann. La frøene suge i vannet for 1 min for hver vask. For å få legge axenic frøplanter en liten mengde sterilt vann mellom 5 og 25 mL avhengig av frø. Hell frø og vann i et sterilt Petriskål for frø spiring.Merk: Vannet skal dekke bunnen av parabolen men ikke dekk frøene for å stimulere dannelsen av rot hår. Axenic beskriver en kultur der bare én art av organismen finnes. Inkuber i mørket til seedlings nå ønsket størrelse mellom 1 cm og 10 cm (ca 5 dager for tomat og A. thaliana og 1-3 dager for alfalfa). For større frø bruk en dekket sterile containeren med en kapasitet på mer enn 100 mL som et glass rett dekkes med folie. Bestemme frekvensen av forurensning av bestemt frø mye med mikroorganismer som fortsatt levedyktig på eller innenfor frøene etter overflate-sterilisering.Merk: Dette er nødvendig fordi sporadisk frø bærer mikroorganismer under frø jakke som ikke kan bli drept av overflaten sterilisering. Bruk antallet forurensede frø frø mye for å bestemme hvor mange frø for å sterilisere samtidig uten en høy risiko for gruppen av frø blir forurenset på grunn av ett frø med bakterier eller sopp som overleve behandling. Utfør trinn 1.1.1 gjennom 1.1.3. Plass frø på en nærings agar Petriskål. Legge 10-30 frø i hver rett mellomrom dem ut slik at de kan være scoret individuelt. Forsegle retter med bånd eller tetting film. Inkuber for 3-5 dager ved 25 ° C scoring hver dag for synlig utvekst av mikroorganismer fra frø. Forberede planter dyrket i sanden. Stiklinger kan dyrkes i sand for bruk i bakteriell vedheft eksperimenter. Utfør trinn 1.1.1 gjennom 1.1.3. Sterilisere kvarts eller havet sand i autoclave. Begge disse inneholde noen organisk materiale. Hvis dette vil påvirke eksperimentet, vask sanden av dekker det med to ganger volumet av 0.1 M HCl. blanding for 10 min. Tillat sanden å bosette seg og hell av væske. Skyll sanden 3 ganger med vann, og en gang med 80% etanol etterfulgt av to flere skyllinger bruker den samme protokollen som den 0.1 M HCl. Sterilize vasket sand i autoclave. Sterilisere beholdere av submerging dem i 50% blekemiddel i 5 minutter og skyll 5 ganger med sterilt vann ved neddykking. La dem tørke og forsegle bunnen med tetting film. Filmen som hentes fra produsenten er vanligvis gratis mikroorganismer på innsiden siden som skal plasseres mot innsiden av beholderen. Bland sterilt sanden med nok sterilt vann våt det nok at sand pinner sammen. Beløpet avhenger av hvordan tørr sand er. 10-35% av volumet av sand er vanligvis tilstrekkelig. Plass våt sand i beholderen tillater tilstrekkelig dybde for lengden av røtter nødvendig og tilstrekkelig plass over sanden for vekst av skyte. Den nøyaktige avstanden avhenger av arter og rekke anlegget brukes. Plante frø. Lage et grunt hull i sanden med sterilt glass stang bare dypt nok å plassere frø under overflaten av sand (cirka 1-5 mm). Plass frø i hullet. Dekke den med et tynt lag av sand. Forsegle toppen av beholderen med tetting filmen for å hindre tap av vann og av flere mikrober. Dyrke planter i laboratoriet under en lys eller i drivhuset på en passende temperatur og lengden på dagen for arter og utvalg av anlegget. For tomat bruke alfalfa, eller Arabidopsis thaliana romtemperatur og 12t lys/mørke sykluser. Plante planter i et hull i sanden (1-2 mm i diameter og dyp nok at roten vil bli dekket med sand). Lage hull med sterilt glass stang. Guide roten nøye inn i hull med sterilt rustfritt stål heklenål om nødvendig, og fylle sidene av hullet med sand. Alternativt, dyrke planter axenically på eller i agar som inneholder en salter blanding som MS salter. Bruk skyter axenic planter dyrket i agar direkte. Unngå røtter dyrket med agar som agar stikker til både plante overflaten og bakterier. Dette kan resultere i et falskt inntrykk av bakteriell vedheft til overflaten anlegget. 2. forberedelse av andre plantemateriale Vask plantemateriale dyrket i drivhus med vann før bruk for å redusere antall urfolk mikrober. Det blir bakterier og sopp på planter. Protozoer vil være tilstede i jord, røttene, og kanskje på bladene. Vaskemaskin blekemiddel eller etanol vil endre anlegget overflaten og anbefales ikke. Hvis etter vann vask betydelig antall mikrober forblir, behandle planter med fortynnet væske håndsåpe eller fortynne hydrogenperoksid (0,01%) til å fjerne eller drepe mikrober. Dette er generelt mindre skadelig for anlegget enn blekemiddel eller etanol. Plantemateriale kjøpt på et lokalt marked er vanskelig å rense, Velg materiale som ikke synes å ha vært utsatt for lengre lagring. Unngå deler av materialet som vises brun eller skadet. Vaske den med vann og fersk kutt på endene av materiale som har tidligere blitt kuttet før du bruker den, med mindre samhandling test bakterier med bakterier (og eukaryoter) som har samlet på kutt steder av interesse. Ikke vask med blekemiddel eller etanol som de endrer anlegget overflaten. Behandle sår nettsteder. Såret nettsteder gir ofte bakterier tilgang til indre av plante materiale18. Blokkere eller redusere bakteriell vedlegg og bevegelse gjennom, sår eller kutt områder som er opprettet i utarbeidelsen av materialet dipping klippekanten i smeltet parafin eller maleri nettstedet med smeltet parafin med en liten børste. Ikke bruk en slikkepott eller noen skarpe implementere da dette kan skade vev. Seal stammer arr på frukt som tomater med parafin. Noen bakterier vil svømme i området under parafinen, men tallene er vanligvis små. Hvis bakteriell inntreden i såret steder av interesse, anslag avstanden som bakterier kan flytte båret av vann bekker eller spredning ved å observere bevegelsen av en farge lagt til løsningen. Merke motile bakterier ved å innføre et gen koding en fluorescerende protein som grønne fluorescerende protein (GFP) i dem, og spore dem bruke fluorescens mikroskopi beskrives i trinn 6.1.219. 3. forberedelse av bakterier Vokse bakterier. Bruk et medium som nærmest tilnærmet betingelsene bakterier er sannsynlig å ha vært utsatt for umiddelbart før møte anlegget i virkeligheten utenfor laboratoriet. Karbon- og nitrogen kilder og tilstedeværelsen av ioner, spesielt divalent kasjoner (Ca, Mg, Fe, Mn og Zn) og fosfat, og pH av mediet er viktig. Bruke minimal AB medium eller Luria kjøttkraft for A. tumefaciens og andre jord bakterier20. E. colisom kan stamme i tarmen, bruke Luria kjøttkraft. Legg indusere som root eksudater eller kommersielle planteekstrakter som soytone eller sukker som sukrose eller xylose på middels21. Hvis disse stoffene er brukt som indusere, Legg en lav konsentrasjon, for eksempel 0,01%. Hvis de brukte karbon kilder, kan du legge til en høyere konsentrasjon, for eksempel 0,1%. Forberede den bakteriell inoculum. Fortynne bakterier i sterilt vann eller mediet der inkubering utføres og legge dem til plantemateriale. Den riktige fortynning er diskutert i trinn 4.2 og 4.3. Hvis du vil fjerne vekst media før du bruker bakterier, sentrifuge bakteriell suspensjon 10.000 x g i 2 minutter, hell av nedbryting og resuspend bakterier av vortexing på samme medium som skal brukes for inkubasjon med plantemateriale. Denne metoden kan fjerne eller redusere antall eller mengde ekstracellulære materiale og lemmer som exopolysaccharides, kapsler, flagellae eller pili. Hvis det er viktig at disse overflaten strukturene forblir intakt, så bare fortynne bakterier før vaksinere dem eller bruke den alternative metoden beskrevet i trinn 3.2.2. Som en alternativ å fjerne oppblomstringen medium, samle bakterier på en nitrocellulose eller polykarbonat filter med en porestørrelse på 0,2 µm eller mindre. Vask bakterier med inkubering mediet og resuspend dem ved forsiktig risting eller vortexing filter i sterilt beholder av mediet. 4. vaksinasjon av bakterier Bestem hvor mange bakterier å være inokulert med målingen brukes til å bestemme bakteriell vedheft og inkubasjon tiden. Vaksinere relativt stort antall bakterier for microscopic studier med inkubering ganger mindre enn 1 dag. Legge til en mengde kultur å nå en siste bakteriell konsentrasjon av mer enn 106 bakterier per mL. Forminsk bakteriell inoculum for lengre inkubasjon. For studier som bakteriell vedheft kartlegges på levedyktig celletall, legge en mengde kultur å nå en siste bakteriell konsentrasjon av 103 til 106 bakterier per mL. Unngå å legge så mange bakterier at metabolismen endringer i pH eller oksygen konsentrasjon i inkubasjon medium. Måle pH pH papir eller en elektrode. Måle oksygen konsentrasjon bruke en oksygen elektrode. For planter dyrket i sand, vaksinere på tre mulige måter. Vaksinere frø med bakterier før planting av soaking frøet for 1 min i en suspensjon i vann i ca 106 bakterier per mL. Vaksinere roten av spirende axenic frøplanter som beskrevet i Seksjon 1 og når frøplante roten er ca 1 cm lang dipping det eller å plassere hele frøplante i en suspensjon av 106 bakterier per mL i vann i 1 minutt. Vaksinere sand blande bakterier med sand før planting for å gi en endelig konsentrasjon av ca 103 bakterier per mL eller vanning frøplante med en suspensjon av 106 bakterier per mL etter planting. 5. inkubasjonstiden for bakterier med plantemateriale For inkubasjon i flytende media ruge bakterier med plantemateriale i sterilt vann eller sukrose og mineral salter eller plante vev kultur medium (som en 1:10 fortynning av MS salter)22,23. Bruke en container som bakterier ikke holder seg. Prøv å holde anlegget overflaten dekket kontinuerlig ved neddykking eller mild agitasjon. Energisk agitasjon kan hindre heft eller aften fjerne bakterier fra anlegget overflaten. Observere plantemateriale i lys mikroskopet etter ulike tidsintervaller bestemme når å stoppe inkubering og foreta målinger. En gang løpet av vedheft er ofte verdifulle med prøver tatt hver 1 til 4 h eller hver dag avhengig av samspillet hastighet. For å ruge i sand, gjelde de samme hensyn på inkubasjon i flytende medium i trinn 5.1. 6. måling av vedheft bruker mikroskopi Foreta mikroskopiske målinger med Nomarski eller kontrast optikk for enkel visning av bakterier på overflater. Men kan noen lyse-feltet mikroskop med forstørrelse på 20 X eller høyere brukes. Bruke mikroskopiske observasjon for å avgjøre hvis bakterier tilfeldig fordelt eller ligger i bestemte områder. Også sjekke om de bundet enkeltvis eller i klynger. Se etter microcolonies foreslå bakterievekst eller entrapment etter vedheft. Sjekk om bakterier synes å danne en biofilm på overflaten.Merk: En biofilm er et stort antall bakterier bundet til overflaten og omgitt av en ekstracellulær matrix23,24,25. Strukturen kan være jevn og ensartet eller har en mer komplisert arkitektur. Metoder for å studere biofilm assosiert med plante flater har vært beskrevet17. Bruk bakterier merket med et fluorescerende markør. Hvis det finnes andre bakterier og bakterier rundt identifiseres med et fluorescerende merke som grønne fluorescerende protein, bruk fluorescens mikroskopi for å fastslå tilstedeværelsen av merket bakterier i klynger av andre bakterier26. For GFP, kan du bruke et filter med 490 nm eksitasjon og 520 nm utslipp. Kontroller at fluorescerende koden ikke negativt påvirker bakterier ved å observere tilslutning til axenic materiale av en lik blanding av vill type bakterier og merket bakterier av den samme stammen med både Nomarski og fluorescens optikk. Hvis fluorescerende og mørke bakterier er tilfeldig blandet og nåværende like deretter koden ikke forstyrre analysen. Bestemme antall vedlagte bakterier.Merk: Det er svært vanskelig å fastslå antall vedlagte bakterier i mikroskopet. Når bindingen er uregelmessig anlegget overflater, er det vanligvis ikke mulig å få en kvantitativ måling. Skanning elektronmikroskop (ikke omtalt i denne artikkelen) kan brukes til å foreta slike målinger. Når bakterier er bundet til en glatt overflate som en rot hår, telle antall bakterier som er bundet til kanten av roten håret per mm rot hår lengde. Pass på å bruke rot hår i omtrent samme størrelse og form i sammenligne målinger. For å avgjøre størrelsen på objekter i mikroskopet, bruk et kommersielle lysbilde med målte merkingen på den. Observere, fotografere dette lysbildet på de samme innstillingene som brukes for eksperimentelle materialet, og bruke bildene til å fastslå størrelsen på objekter i photomicrographs. Forberede prøven mikroskopi. Vask prøven. Flytte prøven til en dråpe vann eller inkubasjon medium på en microscope skyve og observere den direkte.Merk: Dette har fordelen at hvis det var ingen bakterievekst eller faktiske bakteriell død det er usannsynlig å bli mange gratis bakterier. Ta fravær av gratis bakterier som varselsskilt at det kan ha vært bakteriell død eller bakteriell binding til beholderen hvor inkubering ble utført. Effekten av vaske prøven er vist i figur 1. Vask prøven forsiktig i vann eller inkubasjon medium ved å plassere den i et hetteglass væske og snu ampullen forsiktig. Deretter plass prøven på mikroskopet lysbildet i frisk væske for observasjon. Montere eksemplet i væske med en vanlig cover slip og microscope skyve. Bruk en press-apply cover slip hvis prøven er tykk og så ville lage en kul under cover slip. Disse dekker slips har en ring av gummi eller plastikk rundt kanten av cover slip. Plasser væske og prøve i brønnen i cover slip plasser lysbildet på og trykk ned forsiktig for å forsegle cover slip på lysbildet. Inverter og undersøke. Alternativt bruke en alger telling lysbilde og cover slip på en lignende måte. Merk at lysbildene med denne dybde generelt ikke kan undersøkes med en linsen på mer enn 20 X forstørrelse. Figur 1 : Trinn i utarbeidelsen av en prøve for å bestemme antall bundne bakterier. A. tumefaciens binding tomat rot hår (A, B og C) og nylontråder (D, E og F). I prøver montert i vann uten vaske både bundet bakterier (svart piler) og gratis bakterier (hvite piler) kan ses (A og D). Etter vask bundet bakterier forblir men gratis bakterier er ikke lenger presentere (B og E). Etter sonication er bundet bakterier fjernet fra utvalget overflaten (C og F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Hvis fluorescerende bakterier ble brukt, må du undersøke eksemplet i mikroskopet når sanden er fjernet. Røttene av planter dyrket i sand er generelt ikke egnet for mikroskopi som sand partikler forstyrre observasjon av bakterier. Fjern anlegget fra en vekst beholder henhold til trinn 7. Plasser røttene i en beholder med vann og bland forsiktig for å fjerne sand som vil bosette til bunnen av beholderen. Fjerne anlegget fra vask vann og montere prøven som i trinn 6.3.3. 7. måling av vedheft bruke levedyktig cellen teller Bestemme antall levedyktig vedlagte bakterier ved hjelp av en sonicator. Fjerne ubundet bakterier. Plass prøven i et hetteglass med tilstrekkelig vann, vask buffer eller inkubasjon medium for å dekke plantemateriale og invertere ampullen flere ganger. Hvis det var mer enn 103 gratis bakterier per mL i den første inkubering, utføre sekvensiell vasker for å fjerne alle. Sjekke inn et lys mikroskop (se trinn 6.3) til å fastslå tilstedeværelsen av gratis bakterier. Vask før det er en betydelig reduksjon i antall gratis bakterier, men husk at det er en likevekt mellom bundne og ubundne bakterier så hvor mange gratis bakterier kan aldri redusere til null. Fjerne prøven fra ampullen med vask væske med en tang eller spatula. Bestemme antall bundne bakterier i incubations av væske. Suspendere vasket eksemplet i ampuller og dekke det med målte volum av vann, inkubasjon middels eller vaske bufferen. Bruke nok væske for å dekke prøven. Plasser ampullen i en bad sonicator og sonicate det i en min. Fjerne prøven og undersøker det under lys mikroskop for å avgjøre om bundet bakterier er fjernet fra anlegget. Fjerning av bakterier fra et utvalg av sonication er vist i figur 1. Hvis det er fortsette fortsatt bundet bakterier sonicating prøven til slike gangen ingen bundet bakterier forbli på prøven overflaten. Hvis bundet bakterier ikke kan fjernes ved sonication, legge til 1-10 mg/mL steril kvartssand og gjenta sonication og mikroskopisk undersøkelse. Bestemme at sonication prosedyren som synes mest effektive i trinn 7.1.3.2 ikke reduserer levedyktigheten til bakterier ved å stenge bakterier fra en flytende kultur i løsningen skal brukes for sonication (Legg kvartssand, hvis det var nødvendig). Bestemme den levedyktig celletall. Sonicate bakterier og bestemme den levedyktig celletall igjen.Merk: Hvis det er en reduksjon i levedyktig celletall, endre prosedyren ved å endre sammensetningen av væske og/eller sonication tiden til behandling har ingen innvirkning på levedyktig celletall. Bestemme at fortynning bufferen for levedyktig celletall ikke påvirker levedyktigheten til bakterier som har blitt ruget under betingelser brukes ved å sammenligne levedyktig celletall med ulike fortynning buffere og/eller vann. Bestemme antall levedyktig vedlagte bakterier med homogenisering. Plass prøven i et sterilt mørtel eller blender eller andre homogenisering enhet. Dekke den med en målt mengde sterilt vann, inkubasjon middels eller vaske bufferen27. Bruke et volum som er tilstrekkelig til å dekke prøven. Bruke 100 mL en blender. Grind prøven før det er godt homogenisert. Sjekk pH etter homogenisering forsikre at syre fra anlegget vevet ikke har forårsaket en kraftig nedgang i pH under 7. Hvis pH har falt bruk en buffer som fosfatbuffer i homogenisering væsken for å opprettholde pH. Bestemme den levedyktig celletall. Bruk bakterier merket med antibiotikaresistens. I situasjoner der mer enn én type bakterie er tilstede, kan du merke bakteriell stammer med spontan resistens mot antibiotika (vanligvis og og nalidixic acid). Fastslå hvilket antibiotika å bruke. Hvis kulturer av andre organismer forventet å finnes i inkubering finnes, plate disse kulturene vokst under vilkår av den tiltenkte inkubering med planter på plater som inneholder en rekke konsentrasjoner av utvalgte antibiotika. Bestemme laveste konsentrasjonen som ikke tillater veksten av noen av disse organismene. Dette er den laveste konsentrasjonen av antibiotika som test bakterier må være motstandsdyktig. Få spontan antibiotika resistente mutantene. Vokse en kultur av bakterier i rike medium til sent loggen eller ro fase. Plate 0,1 mL ufortynnet på en plate som inneholder ønsket antibiotikaet på en passende konsentrasjon. Bestemme konsentrasjonen bruke som beskrevet i trinn 7.3.1.1. Holde og rense bakterier som vokser og er dermed resistente mot antibiotika. Bestemme at antibiotikaresistens ikke redusere veksten av bakterier ved å gjøre en vekstkurve i flytende medium overordnede og antibiotika resistente bakteriestammer. Bestemme at antibiotika resistente bakterier viser samme nivå av kolonisering av axenic plantemateriale som overordnet belastningen, hvis dette er mulig. Bestemme antall levedyktig bakterier bundet til planter dyrket i sand. Fjerne anlegget fra beholderen og sand. For å fjerne planter fra containere, må du først fjerne tetting materiale på toppen og bunnen av beholderen. Plasser beholderen over sterilt papir og forsiktig fjerne hele sand eller jord og plante som en stor konisk sylinder av forsiktig banket beholderen mot en overflate å løsne materialet. Om nødvendig kan du bruke en slikkepott eller stang for å løsne materialet rundt kantene gå inn gjennom bunnen av beholderen. Når sylinderen med sand eller jord som inneholder anlegget er gratis på papiret, dele det på midten å avsløre plante rot. Eventuelt kan du ta prøver av sand fra nær kanten på beholderen og nær. Dette kan være nyttig for å bestemme spredningen (og akkumulering og vekst) av bakterier. Måle lengden av roten. Plukk opp roten og fjerne sand og bakterier følge løst roten (rhizosphere materiale) av dipping roten i en målt mengde vann eller bufferen og forsiktig riste den. Bestemme levedyktig celle antall bakterier i resulterende suspensjon ved plating på et egnet som Luria agar. Dette representerer antallet bakterier løst knyttet til roten. Fjerne tett bundet bakterier ved sonication og finne sine tall som beskrevet i trinn 7.1. Alternativt, for å avgjøre plasseringen på roten av tett bundet bakterier sted vasket roten på overflaten av en Petriskål som inneholder næringsrike agar eller annet egnet medium. Observere plasseringen av bakteriell koloniene på roten over de neste 3 dagene bruker dissecting mikroskop eller forstørrelsesglasset. Uttrykke resultater som antall bakterier per plante, per cm2 av areal, per cm rot lengde eller per gram ferske vekt av vev. Gjøre flere gjentak på samme dag, og også gjøre gjentak på ulike dager med forskjellige bakteriekulturer og annen masse plantemateriale. 8. fastsettelse av om en effekt av inkubasjon på vedheft er en respons av bakterier eller anlegget Bruk død eller drept plantemateriale. Utsett anlegget materiale til en rekke kjemikalier, fiksativene eller andre behandlinger som varme for å drepe den. Vask plantemateriale i vann og inkubasjon medium etter bruk av noen av disse behandlingene. Deretter vaksinere bakterier. Dette vil ikke ødelegge anlegget overflaten, men det vil gjøre det metabolically inaktive slik at den ikke kan svare på bakteriene. Måle bakteriell vedheft som beskrevet i trinn 6 og/eller 7. Også bestemme antall levedyktige cellers lagt til inkubering med plantemateriale i begynnelsen av inkubering og antall levedyktige cellers finnes på slutten av den inkubering å sikre at ingen giftige kjemikalier var tilstede under incubation. Bruk livløse materiale. Bruk bakteriell overholdelse av livløse materiale å avgjøre om en effekt sett på bakteriell tilslutning til plantemateriale er en effekt på anlegget eller bakterier. Velg en livløse materiale som binder bakterier og som er lik plantemateriale studerte i form og størrelse. Muligheter inkluderer filter papirer av alle typer (cellulose, nitrocellulose, glassfiber, polykarbonat, osv.), tråder (nylon, bomull, polyester, glass ull, osv.), glass eller plast coverslips, rustfritt stål kuponger og dialyse membraner. Vask livløse materiale grundig i vann og mediet der inkubering utføres og steriliseres før bruk. De fleste av materialer som er nevnt i trinn 8.2.1 er stabile til sterilisering av autoklavering. Inkuber livløse materiale under ønsket forhold og score som beskrevet i trinn 6 og 7. Et eksempel på bruk av nylontråder å fastslå at det skyldes redusert binding av A. tumefaciens å rot hår på høy kalsium konsentrasjoner (minst delvis) effekt av kalsium på bakterier er vist i Figur 428.