Summary
Este estudio implementa la secuenciación del genoma entero para el análisis de mutaciones en genes que confieren resistencia a los fármacos antifúngicos en Candida glabrata. Aislamientos de C. glabrata resistentes a equinocandinas, azoles y 5-flucitosina, se secuenciaron para ilustrar la metodología. Perfiles de susceptibilidad de los aislamientos correlacionados con la presencia o ausencia de patrones de la mutación específica de genes.
Abstract
Candida glabrata puede adquirir rápidamente las mutaciones que resultan en resistencia a los medicamentos, especialmente a azoles y equinocandinas. Identificación de mutaciones genéticas es esencial, como la resistencia detectada en vitro a menudo puede ser correlacionado con la falta clínica. Examinamos la viabilidad de utilizar la secuenciación del genoma entero (gt) para el análisis del genoma de resistencia a los fármacos antimicóticos en C. glabrata. El objetivo era torecognize facilitadores y barreras en la implementación WGS y medir su eficacia. Este documento describe los puntos clave de control de calidad y componentes esenciales de la metodología de grupos para investigar marcadores genéticos asociados con reducida susceptibilidad a antifúngicos. También estima la precisión de análisis de datos y vuelta alrededor de tiempo de prueba.
Susceptibilidad fenotípica de 12 clínicas y una cepa ATCC de C. glabrata se determinan mediante las pruebas de susceptibilidad antifúngica. Estos incluyeron tres aislar a pares de tres pacientes que desarrollaron aumento de concentraciones inhibitorias mínimas de drogas. En dos pares, aislar a la segunda de cada par desarrollado resistencia a las equinocandinas. El segundo aislante del tercer par desarrolló resistencia a 5-flucitosina. El restante compuesto por susceptibles y resistentes a azoles aislados. Polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en genes relacionados con resistencia equinocandina, azoles y 5-flucitosina fueron confirmados en aislantes resistentes a través de grupos usando la siguiente secuencia de generación. No-sinónimas SNPs en resistencia antifúngica se identificaron genes como FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 y FCY2 . General, un promedio de 98% de las lecturas WGS de aislamientos de C. glabrata trazados el genoma de referencia con cobertura sobre 75-fold profundidad leer. El tiempo de entrega y el coste eran comparables a Sanger secuenciación.
En conclusión, era factible en revelar mutaciones en el gen clínicamente significativos implicados en la resistencia a las clases diferentes antimicóticos sin la necesidad de múltiples reacciones de secuenciación de ADN PCR WGS de C. glabrata . Esto representa un paso positivo hacia el establecimiento de capacidad WGS en el laboratorio clínico para la detección simultánea de sustituciones que confiere resistencia a antifúngicos.
Introduction
Candida glabrata es un patógeno encontrado cada vez más importancia como una especie que exhibe resistencia a los azoles así como más recientemente, las equinocandinas1,2,3. A diferencia de los diploides de C. albicans, el genoma haploide de C. glabrata puede permitir adquirir mutaciones y desarrollan resistencia a múltiples drogas más fácilmente. La resistencia a ambas clases de drogas también ha sido reportado4. Por lo tanto, la evaluación temprana de antihongos de la susceptibilidad y la detección de resistencia a medicamentos en C. glabrata es cruciales para la terapia correcta y específica, así como en el contexto de corresponsabilidad antihongos para limitar los conductores de resistencia a los antimicrobianos1 , 5 , 6. establecer un flujo de trabajo eficiente para detectar rápidamente la presencia de confirmación mutaciones vinculadas a biomarcadores de resistencia en aislamientos resistentes será también ayuda a mejorar la prescripción de las decisiones y los resultados clínicos.
Antihongos de la susceptibilidad generalmente se evaluaron mediante la medición de la concentración inhibitoria mínima (MIC) que se define como la menor concentración de droga que resulta en una reducción significativa en el crecimiento de un microorganismo en comparación con la de un crecimiento libre de drogas control. La clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) y Comité Europeo en pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (EUCAST) han estandarizado métodos de prueba para determinación de MIC la susceptibilidad más precisa y consistente7, 8. Sin embargo, la utilidad de MIC antihongos sigue siendo limitada especialmente para las equinocandinas, en particular con respecto a las comparaciones entre laboratorios donde diferentes metodologías y las condiciones son usadas9. También existe correlación incierto de micrófonos con respuesta al tratamiento de la equinocandina e incapacidad de distinguir el peso (o susceptibles) aislados de aquellos que FKS mutaciones (cepas resistentes a la equinocandina)10,11. A pesar de la disponibilidad de confirmación PCR de gen único y Sanger secuenciación de los marcadores de resistencia a antimicóticos, realización de resultados se retrasa a menudo debido a la falta de detección simultánea de múltiples marcadores de resistencia5,12. Por lo tanto, la detección simultánea de mutaciones que confieren resistencia en diversas localizaciones en el genoma, de análisis basados en la secuenciación de todo el genoma, ofrece importantes ventajas sobre enfoques actuales.
Todo el genoma secuencia (WGS) se ha implementado con éxito para seguir la transmisión de la enfermedad durante los brotes, así como un enfoque para genoma riesgo evaluación y drogas prueba de resistencia en las bacterias y los virus13. Los avances recientes en tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos han hecho la secuenciación del genoma entero (gt) de patógenos en una vuelta alrededor de tiempo clínicamente útiles técnicamente y económicamente factible. Secuencia de la DNA ofrece importantes ventajas sobre otros métodos de identificación de patógenos y caracterización empleadas en laboratorios de Microbiología14,15,16. En primer lugar, proporciona una solución universal con calidad, rapidez y alto rendimiento. La secuencia puede ser aplicada a cualquiera de los microorganismos y permite economías de escala en laboratorios locales o regionales. En segundo lugar, produce datos en un formato de 'futuro' susceptible de comparación a nivel nacional e internacional. Finalmente, la utilidad potencial de gt en medicina ha sido aumentada por el rápido crecimiento de bases de datos públicas que contienen genomas de referencia, que pueden ser vinculadas a bases de datos equivalentes que contienen metadatos adicionales clínicos y epidemiológicos17 ,18.
Estudios recientes han demostrado la utilidad de gt para la identificación de marcadores de resistencia antifúngica de aislamientos clínicos de Candida spp. 10 , 19 , 20. esto se debe principalmente a la disponibilidad de secuenciadores de sobremesa de alto rendimiento, tuberías de Bioinformática establecidos y disminuir el costo de la secuenciación de21,22. La ventaja de WGS hongos sobre Sanger secuenciación es que WGS permite la secuenciación de genomas múltiples en una única prueba. Además, WGS de genomas de Candida pueden identificar mutaciones en las dianas farmacológicas, seguimiento de evolución genética y la aparición de tipos de secuencia clínicamente relevantes20,22,23. Lo más importante, en casos de multirresistencia intrínseca, WGS puede ayudar en la detección temprana de las mutaciones que confieren resistencia antes de tratamiento selección22,24.
Aquí, hemos examinado la viabilidad de WGS habilitada detección de mutaciones asociadas con resistencia a diferentes clases de agentes antimicóticos. Se presenta una metodología para la implementación de grupos desde la perspectiva del laboratorio de Micología diagnóstica y usuario final. Se incluyeron en este análisis tres aislar a pares cultivados de tres casos clínicos diferentes en que en vitro resistencia a las equinocandinas y 5-flucitosina se convirtió con el tiempo después del tratamiento antifúngico.
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Protocol
No aprobación ética fue requerida para este estudio.
1. subcultura e inóculo preparación para Candida glabrata
- Seleccione un panel de aislados de C.glabrata a estudiar que también debería incluir al menos una C. glabrata americano tipo Culture Collection (ATCC) con el patrón de susceptibilidad conocida.
- Subcultivo de una cepa tocando una sola Colonia utilizando un asa estéril de plástico desechable y vetas en agar de dextrosa de Sabouraud (SDA) de la placa8.
- Incubar la placa SDA por 24-48 h a 35 ° C para la pura cultura de aislamiento con buen crecimiento.
2. determinación de sensibilidad antifúngica
- Uso de aislar un asa de plástico desechable estéril hasta una recién subcultivadas C. glabrata colonias de 4-5 de aproximadamente 1 mm de diámetro en placa de SDA. Resuspender en 3 mL de agua destilada estéril. Mezclar bien mediante pipeteo suave para obtener suspensión uniforme.
- Ajustar la densidad celular a McFarland 0.5 que equivale a 1 x 106 a 5 x 106 células/mL, utilizando un densitómetro 8.
- Realizar pruebas de sensibilidad utilizando el ensayo comercial (véase tabla de materiales y reactivos) sobre todo de C. glabrata aísla siguiendo las instrucciones del fabricante. Interpretar la susceptibilidad de aislamientos basados en MICs resultantes de fármacos antimicóticos según las directrices CLSI y preparar informe (tabla 1)8.
3. genómica extracción de ADN para secuenciación
- Suspender un asa llena de colonias de una placa de SDA recién crecida en 300 μL de EDTA de 50 m m en un tubo de 1,5 mL.
- Agregar 40 μl de zymolyase (10 mg/mL) a la suspensión y suavemente la pipeta 5 veces hasta que la suspensión es uniforme.
- Incubar la muestra a 37 ° C durante 1-2 h para digerir la pared celular. Enfriar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Centrifugar la suspensión a 14.000 × g durante 2 minutos y luego retire con cuidado el sobrenadante.
- Extraer el ADN genómico siguiendo pautas de kit de extracción de ADN (véase tabla de materiales).
- Resuspenda cuidadosamente extraído pellet de DNA en 50 μl de 10 mM tampón Tris (pH 7.5-8.5) en lugar del tampón de elución proporcionado en el kit.
- Compruebe la pureza del ADN por la medida de densidad óptica (OD) a 260/280 nm25.
4. genómica cuantificación de ADN
- Preparar un 1 x de tampón Tris EDTA (TE) suministrado en el kit de ensayo basado en las instrucciones del fabricante para el ensayo de fluorescencia (véase tabla de materiales).
- Diluir la muestra de ADN mediante la adición de 2 μl μl 98 de 1 x de tampón de ensayo TE (volumen final de 100 μl de dilución factor 1:50) en una placa bien 96 desechables. Este paso de dilución se puede realizar manualmente utilizando una pipeta multicanal o por estación de trabajo para manejo de líquidos automatizados.
- Preparar la gama de estándares diluyendo la lambda ADN (100 μg/mL) suministrado en el kit de ensayo de fluorescencia (tabla 2) y son para la medición de muestras.
- Añadir 100 μl de colorante fluorescente a 100 μl diluir muestras de ADN y las normas para la reacción. Incubar por 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Medir la fluorescencia de las muestras basadas en las instrucciones del fabricante.
- Trazar la curva estándar utilizando las lecturas de la fluorescencia y la concentración original de las muestras de ADN.
- Determinar el volumen de ADN y 10 mM de tampón Tris (pH 8) para ser añadido para ajustar la concentración de DNA a 0,2 ng/μl.
- Realizar las diluciones de ADN utilizando estación de trabajo para manejo de líquidos automatizados. Este paso puede lograrse también mediante pipeteo manual.
5. ADN biblioteca preparación
Nota: Preparación de la biblioteca y la secuencia fue realizado siguiendo los protocolos y guías proporcionados por la empresa (figura 1A) del fabricante (véase tabla de materiales).
- Tagmentation y PCR amplificación
- Etiquetar una placa de pared fina rígida de 96 pocillos nueva.
- Añadir 5 μl de entrada cuantificada ADN a 0,2 ng/μl (1 ng en total) para cada muestra de la placa.
- Añadir 10 μl de tampón de tagmentation y 5 μl de tampón de amplificación para cada bien que contiene ADN y pipetee suavemente para mezclar. Selle la placa con un sello de placa adhesiva.
- Colocar la placa en un termociclador y ejecutar el siguiente programa PCR: 55 ° C por 5 min y espera a 10 ° C. Cuando la muestra llega a 10 ° C, proceda inmediatamente a neutralizar.
- Añadir 5 μl de tampón de neutralización a la placa para neutralizar la reacción de amplicones y pipetee suavemente la mezcla. Sellar la placa e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Añadir 15 μl del mastermix PCR a las muestras de indexación.
- Utilice una caja de tubos de primer índice disponibles para una configuración de formato de la placa de 96 pocillos para que cada muestra tiene una combinación única de índices basados en la plantilla de índice (cuadro 3).
- Colocar los tubos del primer índice en el estante de placa índice (figura 1B) usando la orden en la plantilla en la tabla 3 y registrar la posición de los índices en la plantilla.
- Coloque la placa de tagmentation con agregado mastermix PCR en el estante de placa índice con los tubos del índice en orden.
- Poner índice cartilla 1 tubos en arreglo vertical e índice cartilla 2 tubos en arreglo horizontal en la bandeja de índice. Cuidadosamente con una pipeta multicanal, añadir 5 μl de primers de índice a cada muestra.
- Reemplazar tapas de tubos de índice con tapas nuevas para evitar la contaminación cruzada entre índices.
- Sellar la placa con el sellador de placa 96 pocillos claro y realizar la segunda PCR como sigue: 95 ° C por 30 s, 12 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s y 72 ° C durante 5 minutos.
- Limpieza PCR
- Transferir el producto de PCR PCR-limpieza de la placa de tagmentation a una placa de la pozo profundo (véase tabla de materiales).
- Mezclar la solución comercial bolas magnéticas (véase tabla de materiales) basado en las instrucciones del fabricante y añadir 30 μl de granos a cada producto PCR en la placa de la pozo profundo.
- Agitar la placa sobre un agitador de microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente sin agitar durante 5 minutos.
- Coloque la placa en un soporte magnético por 2 min hasta que el sobrenadante ha desaparecido.
- Descartar el sobrenadante con cuidado la placa en el soporte magnético.
- Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado con la placa en el soporte magnético.
- Incube la placa en el soporte magnético por 30 s y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante sin molestar a los granos.
- Repetir la etapa de lavado y deje los granos secar 15 minutos quitar exceso etanol si cualquier.
- Retire la placa del soporte magnético y añadir 52.5 μl de buffer de resuspensión a los granos.
- Agitar la placa sobre un agitador de microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos sin agitación.
- Coloque la placa en el soporte magnético y permiten el sobrenadante borrar.
- Usando una pipeta multicanal, cuidadosamente transferir 50 μl del sobrenadante de la placa de limpieza a una nueva placa rígida.
- Normalización de la biblioteca
- Descongele los reactivos de normalización biblioteca según las instrucciones del fabricante (véase tabla de materiales).
- Transferir 20 μl del sobrenadante de la placa de limpieza a una nueva placa de la pozo profundo.
- Agregue 45 μl de suspensión de grano magnético y sellar la placa con un sellador de placas.
- Agitar la placa sobre un agitador de microplacas a 1800 rpm por 30 min. Este tiempo de incubación es fundamental y no debe ser excedida.
- Colocar la placa sobre un soporte magnético por 2 min y confirmar que el sobrenadante haya desaparecido (figura 1B).
- Retire y descarte el sobrenadante en un recipiente de residuos adecuados con la placa en el soporte magnético.
- Retire la placa del soporte magnético y lavar los granos con 45 μl de tampón de lavado.
- Agitar la placa con tampón de lavado en un agitador de microplacas a 1800 rpm por 5 min.
- Coloque la placa en soporte magnético por 2 min y descartar sobrenadante cuando resulta claro.
- Retire la placa del soporte magnético y repetir el lavado con tampón de lavado.
- Retire la placa del soporte magnético y añadir 30 μl de 0,1 N NaOH.
- Agitar la placa con 0,1 N NaOH en un agitador de microplacas a 1800 rpm por 5 min y coloque la placa en el soporte magnético durante 2 minutos o hasta que el líquido es claro.
- Añadir 30 μl de tampón de elución a cada pocillo de una placa nueva de biblioteca normalizada final 96-bien rígida pared delgada.
- Transferencia 30 μL del sobrenadante de la placa de la normalización a la placa final biblioteca normalizada para hacer volumen final de 60 μL. Las bibliotecas están ahora listas para ser ordenados.
- Determinación de concentración de ADN biblioteca por qPCR
- Descongelar el mastermix, cartillas y normas previstas en el kit qPCR según las instrucciones del fabricante (véase tabla de materiales).
- Combinar el mastermix de reactivos PCR y la cartilla suministrada con el kit qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante y alícuotas pueden almacenarse a-20 ° C.
- Para determinar la concentración de la biblioteca de ADN, hacer una dilución de 1/8000 de las bibliotecas de ADN utilizando tampón Tris 10 mM (pH 8) realizando una dilución 1: 100 (1,5 μl ADN biblioteca a 148,5 μl de tampón de Tris) seguido de una dilución de 1: 80 (2 μl de 1: 100 a 158 μl de tampón de Tris).
- Agitar la placa dilución a 700 rpm durante al menos 1 minuto y luego centrifugar a 14000 x g durante 1 minuto.
- Preparar 20 μl de reacción de PCR final mezclando 4 μL de diluido biblioteca de ADN o DNA y 16 μl del mastermix.
- Realizar la siguiente configuración del fabricante en termociclador PCR: 95 ° C por 5 min, 35 ciclos de 95 ° C para 30 s y 60 ° C por 45 s y final 65 ° C a 95 ° C para el análisis de la curva de fusión.
- Obtener los valores de Ct de los estándares y las bibliotecas de ADN de muestra del qPCR termociclador.
- Generar una curva estándar del valor del Ct de los estándares (figura 2). Para definir el rango de control de calidad superior e inferior ± 3 ciclos de la media. Por ejemplo, si la media valor de Ct es 13 ciclos entonces la gama de control de calidad es entre 16 y 10 ciclos.
- Determinar las concentraciones individuales y media biblioteca (ALC) de la curva estándar y los valores de Ct.
- Determinar volumen de bibliotecas total combinadas (PAL) que se utilizará se basa en cálculo que indicamos a continuación para la secuencia final, considerando que la concentración de la biblioteca de destino es entre 1.4-13:08.
Nota: Promedio de concentración de la biblioteca de qPCR = ALC; Total de bibliotecas agrupadas (PAL) = ALC / 2; Desnaturalizado PAL (DAL) = PAL * 0.666
Dependiendo del volumen de DAL que se mezcla con el buffer, es la concentración de biblioteca que se añade a la celda de flujo. Por ejemplo, si 65 μl de biblioteca se agrega a 835 μl de buffer, luego de esta dilución (1 Dil) 195 se añade a un volumen total de 1300 μl: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = concentración Final (debe estar entre 1.4-13:08)
6. Biblioteca pooling y la secuencia de inicio en secuenciador de sobremesa
- Cartucho de reactivo de deshielo según las instrucciones del fabricante. Sacar una nueva célula de flujo del paquete de almacenamiento de 4 ° C y a temperatura ambiente al menos 30 minutos antes de la secuencia. Saque el cartucho de tampón y tampón de secuenciación prechill antes de usar (véase tabla de materiales).
- Preparar una biblioteca de control mediante la mezcla de 5 μl de biblioteca (1 nM) y 5 μl de 0.2 N NaOH. Brevemente Vortex e incubar por 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca control en solos filamentos.
- Añadir 5 μl de 200 mM Tris-HCl, pH 7 y vortex. Añadir 235 μl de tampón de prechilled secuenciación y mezclar suavemente. El volumen total es de 250 μl con la concentración final de biblioteca de control a las 20 pM.
- Bibliotecas de ADN de piscina mediante la transferencia de 5 μl de cada biblioteca de muestra para ser secuenciados de la placa final biblioteca normalizada en un tubo único lazo baja 1,5 mL.
- Añadir 30 μl de biblioteca agrupado y 30 μl de 0.2 N NaOH para desnaturalizar las bibliotecas en otro tubo de atar bajo.
- Vórtice el lazo de la baja del tubo e incubar 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar las bibliotecas en solos filamentos.
- Añadir 30 μl de 200 mM Tris-HCl, pH 7 al tubo con bibliotecas desnaturalizadas para neutralizar la reacción.
- Añadir 65 μl de suspensión de bibliotecas desnaturalizada neutralizado y 835 μl de tampón de la secuencia previamente enfriada y de vortex para mezclar bien.
- En un tubo de atar bajo final combinar lo siguiente: 195 μl de bibliotecas desnaturalizadas neutralizadas, 1.30 μl de biblioteca de control y 1103.70 μl de tampón de la secuencia. Mezclar correctamente.
- Cargar la mezcla final de la biblioteca (1300 μL) en el lugar designado en el cartucho de reactivo.
- Configurar la secuencia de entrar en detalles de proyecto y muestra en el secuenciador señalado sitio web siguiendo las instrucciones.
- Iniciar secuencia siguiendo las instrucciones. De carga celda de flujo, cartucho de reactivo con bibliotecas y tampón en secuenciador de sobremesa.
- Grabar números de lote de kits de reactivos y cartuchos utilizados en la secuenciación.
7. datos de descargar del sitio web de la secuencia
- Descargar archivos FASTQ siguiendo las instrucciones del fabricante en el sitio Web.
- Para una buena calidad ejecutada comprueba que el porcentaje Q30 ≥ 75% y cluster densidad es entre 170-280 K/mm2 con óptima a 200-210 K/mm2 (tabla 4).
8. secuencia de análisis de datos
- Importar archivos FASTQ de muestras secuenciadas en paquete de software integrado de análisis de datos (véase tabla de materiales).
- Crear un flujo de trabajo de secuenciación en software añadiendo características de lista es decir, recortar, cartografía de referencia (referencia select genoma), reajuste local y variante análisis (figura 3A) parámetros listados en la tabla 5.
- Ejecutar el flujo de trabajo mediante la selección de una muestra o un lote de archivos de ejemplo FASTQ y guardar archivos en carpetas de muestra señalado.
- Generar informe para profundidad de cobertura de secuencia, regiones asignadas y lista de variantes estructurales en el genoma (figura 3B).
- Utilizar lista de variantes estructurales para buscar polimorfismos no sinónimo de un solo nucleótido (SNPs) en genes que confieren resistencia y virulencia.
- Preparar informe de lista de ubicación de SNP, gene y número de cepas resistentes o susceptibles (cuadro 6).
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Representative Results
13 C. glabrata con aislamientos de C. glabrata ATCC 90030 y 12 desde el laboratorio de referencia de Micología clínica (aislantes CMRL1 a CMRL12), Hospital de Westmead, Sydney fueron estudiados (tabla 1). Estos incluyen tres pares de aislados CMRL-CMRL 1-2, CMRL-CMRL 3.4 y CMRL-5/CMRL-6 obtienen antes y después de la terapia antifúngica sin vínculos epidemiológicos entre ellos 24 (tabla 1).
Los micrófonos se determinaron utilizando punto de interpretación de CLSI para nueve agentes antimicóticos: anfotericina (AMB), anidulafungina (ANI), micafungina (FOMIN), caspofungina (CAS), 5-flucitosina (5-FC), posaconazol (POS), voriconazol (VRC), itraconazol ( ITR) y fluconazol (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida krusei ATCC 6258 se utilizaron como cepas control de calidad. Entre el par aislado, CMRL-1 y CMRL-2, el segundo aislante CMRL-2 era resistente a caspofungina (MIC 8 vs 0,12 mg/L, tabla 1). CMRL-2 también tenía similares aumentos proporcionales en los micrófonos de anidulafungina y micafungina (≥ 0,5 mg/L) dando por resultado resistencia en vitro a todas tres equinocandinas24. Además, aislar CMRL-4 había desarrollado resistencia equinocandina que aislar CMRL-3 (tabla 1). Entre el tercer par, aislante CMRL-6 tenía el micrófono en el 5-flucytosine (> 64 vs 0,06 mg/L)24. Ambos estos pares aislados eran susceptibles/wild-type (WT) a otros antifúngicos probados. Aislamiento CMRL-6 y CMRL-12 fueron encontrados para ser resistente o no peso a todos los azoles. CMRL-7 era resistente a fluconazol y no WT al voriconazol (tabla 1). C. glabrata ATCC 90030 y los aislantes 8 CMRL CMRL-11 fueron susceptible susceptibles/peso a los agentes antifúngicos24.
WGS de 13 aislamientos se realizó mediante el secuenciador de sobremesa. En promedio, un funcionamiento de la secuencia de salida media, se rindió alrededor de 27-40 GB de datos con una tasa de error entre 0.5-1.4%. El porcentaje promedio Q30 obtenida era generalmente alrededor 80-85%. La densidad racimo de celda de flujo (K/m2) oscilada entre 200-250 (tabla 4). Los datos de la secuencia cruda de este estudio han sido depositados en NCBI secuencia leer archivo (SRA) bajo el número de proyecto PRJNA310057. 98% de la secuenciación lecturas asignadas al genoma de referencia de C. glabrata (cepa CBS138) a través de análisis en software de análisis de datos integrados. El medio de Lee fue profundidad x 75 con media leer longitud de 143-BP estructural detección de variantes identificada más de 50, 000 SNP por aislar. En particular, al analizar los pares de cepa CMRL/CMRL1-2, total SNPs encontradas cada aislamiento fueron alrededor de 79.000, CMRL-3/CMRL-4, el número total de SNPs fueron alrededor de 60.000 y para CMRL-5/CMRL-6, más de 56.000 en comparación con CBS13824. La diferencia SNP en comparación entre aislantes en un par de cepa fue de menos de 25.
Basado en el perfil de susceptibilidad de los aislados, conocida biomarcadores se seleccionaron para análisis24, particularmente, la resistencia FKS1, FKS2 y FKS3 (equinocandina resistencia), FCY1 y FCY2 (5- resistencia flucitosina) y ERG11, CgCDR1, ERG9, CgPDR1 y CgFLR1 (resistencia a azoles). Se verificaron los genes de mutaciones conocidas y la frecuencia de ocurrencias de SNP. Sólo no sinónimo SNPs en genes con leen cobertura profundidad de ≥ 20, es decir, específicamente se estudiaron SNPs de alta calidad (hq-SNP).
En particular, se identificaron FKS mutaciones en el genoma de ambos aislamientos resistentes a la equinocandina24. De los primeros dos pares, los aislamientos resistentes a la equinocandina, CMRL-2 albergaba una sola mutación de FKS2 S629P y CMRL-4, la mutación de FKS2 S663P (tabla 6). Del tercer par, un SNP en FCY2 (Ala237Thr) fue encontrado en CMRL-5 (5-flucitosina susceptible) y CMRL-6 (a prueba) (tabla 6). Sin embargo, los SNPs en FCY2 también fueron encontrados en otros fenotípicamente WT aislados (CMRL-1, 2 CMRL, CMRL-10)24. Aislamientos CMRL-6 y CMRL-12 fueron destaca por su resistente a azoles pan/no-carácter WT y SNPs en CgCDR1 (codificación de bombas de eflujo de azole) y CgPDR1 (codificación del factor de transcripción regular las bombas de eflujo) (tabla 6)26 ,27. La presencia de mutaciones en otro gen de bomba de eflujo, CgFLR1 se produjeron en ambas cepas azoles-susceptible y resistente a los azoles26,28. Investigación para SNPs dentro de la ERG9 (codificación escualeno sintasa) reveló mutaciones pero no había ninguna mutaciones identificadas en ERG1124.
GT análisis también reveló múltiples no sinónimo SNPs en genes de adherencia de pared celular de Candida , EPA1, EPA6, PWP2 y PWP5. EPA6 mutaciones estaban presentes en aislamientos de 9/12. También estuvieron presentes en casi todos los aislamientos, excepto cepas CMRL-1 y CMRL-1124SNPs PWP2 y PWP5 .
| Aislar | AMB | ANI | FOMIN | CAS | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | Interpretación de sensibilidad antifúngica | Genes que confieren resistencia, identificada por grupos | ||
| CMRL-1 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.12 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | Susceptibles a todos los | - | ||
| CMRL-2 | 0.5 | 1 | 1 | 8 | < 0.06 | 0.25 | 0.06 | 0.12 | 4 | Resistente a todos equinocandinas sólo | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0.25 | 0.015 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.25 | 0.5 | 8 | Susceptibles a todos los | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | Resistente a todos equinocandinas sólo | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0.12 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | Susceptibles a todos los | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0.06 | 0.015 | 0.06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Resistente a los azoles y 5-FC | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0.25 | 0.06 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 8 | 0.5 | 256 | Resistente a los azoles solamente | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0.5 | 0.03 | 0.008 | 0.06 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 4 | Susceptibles a todos los | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 1 | 16 | Susceptibles a todos los | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0.03 | < 0.008 | 0.5 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | Susceptibles a todos los | - | ||
| CMRL-11 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.03 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.5 | 8 | Susceptibles a todos los | - | ||
| CMRL-12 | 0.5 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Resistente a los azoles solamente | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 8 | Susceptibles a todos los | - | ||
| Abreviaturas: MIC, concentración mínima inhibitoria; AMB, la anfotericina B; ANI, anidulafungina; CAS, caspofungina; FLC, fluconazol; ITR, itraconazol; FOMIN, micafungina; POS, posaconazol; VRC, voriconazol; 5-FC, 5-flucitosina. | |||||||||||||
Tabla 1. Susceptibilidad in vitro de 13 Candida glabrata aislantes incluyendo CMRL-CMRL 1-2, CMRL-CMRL 3.4 y CMRL-5/CMRL-6 aislar pares obtenidos antes y después de la terapia antifúngica
| Normas | Volumen estándar de ADN (μL) | 1 Tampón X TE | Reactivo (μL) | Total en placa de 96 pocillos (μL) | Concentración final de ADN (ng/mL) |
| STD-Pico 1 | 8 (ADN estándar tubo 100 μg/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| STD-Pico 2 | 10 (de Std-Pico 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| STD - Pico 3 | 5 (de Std-Pico 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| STD-Pico 4 | 2 (de Std-Pico 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| STD-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| En blanco | - | 100 | 100 | 200 | En blanco |
Tabla 2. Protocolo para la preparación de estándares para la generación de la curva estándar para la cuantificación de ADN
Figura 1 . Flujo de trabajo de la secuencia: (A) un esquema de pasos analíticos importantes para la preparación de la biblioteca y la secuencia en un secuenciador de sobremesa. (B) componentes importantes para la preparación de la biblioteca de ADN como la (izquierda a derecha) índice copero para el arreglo de los índices durante la indexación y estante magnético con placa de 96 pozos profundos para el grano magnético del basado en el limpiar de las bibliotecas de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice Conjunto A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | Muestra 4 | Muestra 5 | Muestra 6 | Muestra 7 | Muestra 8 | Muestra 9 | Muestra 10 | Muestra 11 | Muestra 12 |
| B | S503 | Muestra 13 | Muestra 14 | Muestra 15 | Muestra 16 | Muestra 17 | Muestra 18 | Muestra 19 | Muestra de 20 | Muestra 21 | Muestra 22 | Muestra 23 | Muestra 24 |
| C | S505 | Muestra 25 | Muestra 26 | Muestra 27 | Muestra 28 | Muestra 29 | Muestra 30 | Muestra 31 | Muestra 32 | Muestra 33 | Muestra 34 | Muestra 35 | Muestra 36 |
| D | S506 | Muestra 37 | Muestra 38 | Muestra 39 | Muestra 40 | Muestra 41 | Muestra 42 | Muestra 43 | Muestra 44 | Muestra 45 | Muestra 46 | Muestra 47 | Muestra de 48 |
| E | S507 | Muestra 49 | Muestra 50 | Muestra 51 | Muestra 52 | Muestra 53 | Muestra 54 | Muestra 55 | Muestra 56 | Muestra 57 | Muestra 58 | Muestra 59 | Muestra 60 |
| F | S508 | Muestra 61 | Muestra de 62 | Muestra 63 | Muestra de 64 | Muestra 65 | Muestra 66 | Muestra 67 | Muestra 68 | Muestra 69 | Muestra 70 | Muestra 71 | Muestra 72 |
| G | S510 | Muestra 73 | Muestra 74 | Muestra 75 | Muestra 76 | Muestra 77 | Muestra 78 | Muestra 79 | Muestra 80 | Muestra 81 | Muestra 82 | Muestra 83 | Muestra 84 |
| H | S511 | Muestra 85 | Muestra 86 | Muestra 87 | Muestra 88 | Muestra 89 | Muestra 90 | Muestra 91 | Muestra 92 | Muestra de 93 | Muestra 94 | Muestra 95 | Muestra 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice conjunto B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | Muestra 4 | Muestra 5 | Muestra 6 | Muestra 7 | Muestra 8 | Muestra 9 | Muestra 10 | Muestra 11 | Muestra 12 |
| B | S503 | Muestra 13 | Muestra 14 | Muestra 15 | Muestra 16 | Muestra 17 | Muestra 18 | Muestra 19 | Muestra de 20 | Muestra 21 | Muestra 22 | Muestra 23 | Muestra 24 |
| C | S505 | Muestra 25 | Muestra 26 | Muestra 27 | Muestra 28 | Muestra 29 | Muestra 30 | Muestra 31 | Muestra 32 | Muestra 33 | Muestra 34 | Muestra 35 | Muestra 36 |
| D | S506 | Muestra 37 | Muestra 38 | Muestra 39 | Muestra 40 | Muestra 41 | Muestra 42 | Muestra 43 | Muestra 44 | Muestra 45 | Muestra 46 | Muestra 47 | Muestra de 48 |
| E | S507 | Muestra 49 | Muestra 50 | Muestra 51 | Muestra 52 | Muestra 53 | Muestra 54 | Muestra 55 | Muestra 56 | Muestra 57 | Muestra 58 | Muestra 59 | Muestra 60 |
| F | S508 | Muestra 61 | Muestra de 62 | Muestra 63 | Muestra de 64 | Muestra 65 | Muestra 66 | Muestra 67 | Muestra 68 | Muestra 69 | Muestra 70 | Muestra 71 | Muestra 72 |
| G | S510 | Muestra 73 | Muestra 74 | Muestra 75 | Muestra 76 | Muestra 77 | Muestra 78 | Muestra 79 | Muestra 80 | Muestra 81 | Muestra 82 | Muestra 83 | Muestra 84 |
| H | S511 | Muestra 85 | Muestra 86 | Muestra 87 | Muestra 88 | Muestra 89 | Muestra 90 | Muestra 91 | Muestra 92 | Muestra de 93 | Muestra 94 | Muestra 95 | Muestra 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice conjunto C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | Muestra 4 | Muestra 5 | Muestra 6 | Muestra 7 | Muestra 8 | Muestra 9 | Muestra 10 | Muestra 11 | Muestra 12 |
| B | S515 | Muestra 13 | Muestra 14 | Muestra 15 | Muestra 16 | Muestra 17 | Muestra 18 | Muestra 19 | Muestra de 20 | Muestra 21 | Muestra 22 | Muestra 23 | Muestra 24 |
| C | S516 | Muestra 25 | Muestra 26 | Muestra 27 | Muestra 28 | Muestra 29 | Muestra 30 | Muestra 31 | Muestra 32 | Muestra 33 | Muestra 34 | Muestra 35 | Muestra 36 |
| D | S517 | Muestra 37 | Muestra 38 | Muestra 39 | Muestra 40 | Muestra 41 | Muestra 42 | Muestra 43 | Muestra 44 | Muestra 45 | Muestra 46 | Muestra 47 | Muestra de 48 |
| E | S518 | Muestra 49 | Muestra 50 | Muestra 51 | Muestra 52 | Muestra 53 | Muestra 54 | Muestra 55 | Muestra 56 | Muestra 57 | Muestra 58 | Muestra 59 | Muestra 60 |
| F | S520 | Muestra 61 | Muestra de 62 | Muestra 63 | Muestra de 64 | Muestra 65 | Muestra 66 | Muestra 67 | Muestra 68 | Muestra 69 | Muestra 70 | Muestra 71 | Muestra 72 |
| G | S521 | Muestra 73 | Muestra 74 | Muestra 75 | Muestra 76 | Muestra 77 | Muestra 78 | Muestra 79 | Muestra 80 | Muestra 81 | Muestra 82 | Muestra 83 | Muestra 84 |
| H | S522 | Muestra 85 | Muestra 86 | Muestra 87 | Muestra 88 | Muestra 89 | Muestra 90 | Muestra 91 | Muestra 92 | Muestra de 93 | Muestra 94 | Muestra 95 | Muestra 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice conjunto D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Muestra 1 | Muestra 2 | Muestra 3 | Muestra 4 | Muestra 5 | Muestra 6 | Muestra 7 | Muestra 8 | Muestra 9 | Muestra 10 | Muestra 11 | Muestra 12 |
| B | S515 | Muestra 13 | Muestra 14 | Muestra 15 | Muestra 16 | Muestra 17 | Muestra 18 | Muestra 19 | Muestra de 20 | Muestra 21 | Muestra 22 | Muestra 23 | Muestra 24 |
| C | S516 | Muestra 25 | Muestra 26 | Muestra 27 | Muestra 28 | Muestra 29 | Muestra 30 | Muestra 31 | Muestra 32 | Muestra 33 | Muestra 34 | Muestra 35 | Muestra 36 |
| D | S517 | Muestra 37 | Muestra 38 | Muestra 39 | Muestra 40 | Muestra 41 | Muestra 42 | Muestra 43 | Muestra 44 | Muestra 45 | Muestra 46 | Muestra 47 | Muestra de 48 |
| E | S518 | Muestra 49 | Muestra 50 | Muestra 51 | Muestra 52 | Muestra 53 | Muestra 54 | Muestra 55 | Muestra 56 | Muestra 57 | Muestra 58 | Muestra 59 | Muestra 60 |
| F | S520 | Muestra 61 | Muestra de 62 | Muestra 63 | Muestra de 64 | Muestra 65 | Muestra 66 | Muestra 67 | Muestra 68 | Muestra 69 | Muestra 70 | Muestra 71 | Muestra 72 |
| G | S521 | Muestra 73 | Muestra 74 | Muestra 75 | Muestra 76 | Muestra 77 | Muestra 78 | Muestra 79 | Muestra 80 | Muestra 81 | Muestra 82 | Muestra 83 | Muestra 84 |
| H | S522 | Muestra 85 | Muestra 86 | Muestra 87 | Muestra 88 | Muestra 89 | Muestra 90 | Muestra 91 | Muestra 92 | Muestra de 93 | Muestra 94 | Muestra 95 | Muestra 96 |
Tabla 3. Plantilla de índice diferente arreglo
Figura 2 : Un estándar gráfico generado con los valores de Ct de los estándares. Utilice los valores de intercepto y pendiente de la curva estándar para determinar la concentración de biblioteca promedio de valor de Ct de bibliotecas de la muestra por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Métricas de | Valores estándar | Valores obtenidos (promedio) |
| Rendimiento | 32.5-50 Gb de salida medio | 42 Gb de salida medio |
| 100-130 Gb de alto rendimiento | 120 Gb de alto rendimiento | |
| Porcentaje Q30 | ≥ 75% | 80% |
| Densidad de Cluster | 170-230 K/mm2, óptima a 200 K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Grupos de filtros de paso | > 70% | 89.09% |
| Intensidad por ciclo | Por encima de 1000 para cada azulejo en celda de flujo | Por encima de 1500 para cada azulejo en celda de flujo |
| Tasa de error | Por debajo de 1.5 | 1.4 |
Cuadro 4. Métricas para una secuencia estándar en secuenciador de sobremesa
Figura 3 : Software de análisis de datos de secuenciación. (A) crear un flujo de trabajo deseado, incluyendo el ajuste de la secuencia, asignación de referencia y de calidad basado en la detección de variantes. Ejecutar el flujo de trabajo mediante la selección de archivos de ejemplo que FASTQ (individual o múltiples muestras en lotes). (B) lista de variantes estructurales que muestran la posición de referencia, cobertura, cambio de nucleótido y cambio del aminoácido obtenido por análisis de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1. recortar las secuencias | Opción usada |
| Bases de ajuste | Por defecto |
| Filtro en longitud con el número máximo de nucleótido en lecturas | 1000 |
| Filtro en longitud con el número mínimo de nucleótido en lecturas | 50 |
| 2. asignación de lecturas para hacer referencia a | |
| Referencia seleccionada | CBS138 |
| Adhesiva de referencia con enmascaramiento de modo | No adhesiva |
| Opciones de asignación | Por defecto |
| 3. local realineación | |
| Configuración de alineación | Por defecto |
| 4. calidad basado en la detección de variantes | |
| Radio de barrio | 5 |
| Cuenta mínima de gap y desajuste | 2 |
| Calidad mínima del barrio | 15 |
| Mínimos de calidad central | 20 |
| Filtros de lectura | Por defecto |
| Cobertura mínima | 4 |
| Frecuencia variable mínima (%) | 75 |
| Filtros de variables | Por defecto |
| Máximo esperado de alelos (ploidía) | 2 |
| Código genético | Estándar |
Tabla 5. Parámetros de flujo de trabajo y configuración de Software
| Posición del nucleótido variante estructural | Gene | Medicamento | Encontrado en Número de Aislamientos de |
Aislamientos resistentes | Cepas susceptibles | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CAS, ANI, FOMIN | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CAS, ANI, FOMIN | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | 1 CMRL, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | 5 CMRL, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | 6 CMRL, CMRL-12 | 5 CMRL, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | 1 CMRL, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tabla 6. Informe de posición variante estructural de genes relacionados con resistencia a los fármacos antimicóticos en el número de aislamientos de C. glabrata
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Discussion
Este estudio determinó viabilidad, plazos aproximados y precisión de guiado de WGS detección de resistencia de C. glabrata. El tiempo de respuesta (TAT) para la preparación de la biblioteca y la secuencia fue cuatro días e informe de los días de doblete de resultados analizados. Esto se compara con al menos una cantidad similar TAT para los ensayos de susceptibilidad de placas y Sanger secuenciación con un número significativamente mayor de muestras. Unos 30-90 C. glabrata genomas pueden ser secuenciados basado en la capacidad de la célula de flujo, con 80-100% de cobertura de secuencia la secuencia. Puesto que la secuencia fue realizada en una instalación de laboratorio interna de WGS, los requisitos de costes y recursos en el presente estudio fue equivalente a los gastos corrientes de Sanger ensayos secuenciados y basada en sondeos, con un costo estimado de AUD 80-100 por muestra. Susceptibilidad de los aislados se determinaron mediante un kit de ensayo comercial que fueron leídos visualmente usando un espejo de la lectura. Crecimiento de la cultura fue indicado por el cambio en el indicador de crecimiento colorimétrico del azul al rosa. MIC fue leído como el primer azul bien después de una serie de color de rosa (crecimiento) los pozos, es decir, la menor concentración del agente antifúngico que inhibe considerablemente el crecimiento. Para WGS, han preparado bibliotecas genómicas de DNA usando el kit de preparación de la biblioteca. Las bibliotecas de aislamiento fueron cuantificadas mediante qPCR. Las bibliotecas cuantificadas se agruparon para la secuencia final run en el secuenciador de sobremesa.
En nuestro análisis, la presencia de SNPs en genes que confieren resistencia en aislamientos correlacionó bien con la elevada en vitro MIC contra las drogas. Las mutacionesS629P en FKS1 y S663P en FKS2 identificados fueron claramente asociadas con resistencia a las equinocandinas. Ambas mutaciones son bien sabidos para conferir resistencia fenotípica29,30. Secuenciación de genoma simultánea también reveló mutaciones en genes relacionados con resistencia de azole (CgPDR1, CgCDR1 y CgFLR1) y 5-flucitosina (gen FCY2) que se asocian a resistencia a través de la activación / sobreexpresión de bombas de eflujo26,27,28. Sin embargo, los efectos de mutaciones en genes relacionados con azoles y 5-flucitosina resistencia31 deben confirmarse por adicional funcional analiza para evaluar el nivel de expresión génica. Interesantemente, gran cantidad de SNP también fueron encontrado en pared celular adhesinas en todos los aislados de32,33. Mutaciones en gene de adhesión EPA6, que codifica la formación de biopelículas, ocurrió relativamente con frecuencia33. Además, aísla el CMRL-3, 4 CMRL y CMRL-8 que carecían las mutaciones en genes de resistencia a azoles no tenían ningún SNP documentado en EPA1 y EPA624,34. Sin embargo, en general, ninguna asociación específica entre el SNP en MICs adhesinas y drogas podría encontrarse debido al bajo número de aislamientos de prueba incluido.
La implementación del WGS en Micología clínica requiere la aplicación del sistema de gestión de la calidad robusto. Alta calidad genomic DNA y control de calidad los puestos de control que acompañan a cada paso en el experimento es esencial para un buen resultado WGS. La pureza de la DNA de C. glabrata muestra sometido a preparación de biblioteca puede validarse mediante método de absorbancia UV (absorbancia a 260/280 nm y 260/230 nm25. En nuestra experiencia, para C. glabrata ADN 260/280 se espera que dentro de la gama recomendada de 1.8-2 y 260/230 entre 2-2.2. Si ADN extractos no cumplen estos requisitos de calidad, se puede realizar una purificación adicional por la precipitación del etanol. Tagmentation es un paso esencial de la adición de secuencias de código de barra único llaman cartillas índice así como permitir la diferenciación de múltiples muestra durante la secuenciación (multiplexación). Por lo tanto, en el proceso de indización, debe tenerse cuidado extra para evitar la contaminación cruzada entre muestras y tubos de índice para mantener la unicidad de los índices. Normalización en la secuencia se asegura de que se elimina cualquier diferencia que se presenta en las bibliotecas de ADN muestra que podrían introducir sesgos en los datos de la secuencia. Una normalización paso usando que un grano base de limpiar generalmente permite la eliminación de fragmentos de ADN de la biblioteca y las variaciones en tamaño de la biblioteca que pueda surgir durante la preparación de la biblioteca. Por lo tanto la incubación de 30 min es crítica para la densidad óptima del racimo. Densidad que es la densidad de los grupos clonales de bibliotecas de la muestra generadas por amplificación masiva durante la secuencia calidad de datos de influencias como puntuaciones de Q30 y salida de datos total del racimo. Mientras que underclustering podría dar datos de alta calidad, también resultará en menores datos de salida que overclustering puntuaciones bajas de Q30. Las bibliotecas de ADN deben estar libres de residuos de grano magnético durante limpieza PCR y la normalización como que pueden interferir con la calidad de los datos de secuenciación. QPCR debe realizarse en por lo menos unas bibliotecas de muestra representativa incluyendo una cepa de referencia como control positivo (la cepa ATCC de C. glabrata en este caso) de un conjunto particular de índices. Los valores promedio de Ct deben ser entre 15-18 ciclos. Cualquier muestra dentro de esta gama se considera aceptable para el funcionamiento de la secuencia. Sin embargo, si los valores de Ct son fuera de este rango debe repetirse la qPCR. Muestras a veces pueden fallar qPCR debido a la DNA de entrada de baja calidad o error durante la preparación de la biblioteca. Basado en cálculos de control positivo, se debe establecer la concentración mínima de las bibliotecas que producirá datos de la secuencia buena. Usando la concentración media de las bibliotecas de qPCR, puede calcularse el volumen de la biblioteca final a añadir para la secuencia. Esto debería producir la concentración recomendada biblioteca final entre 1.4-13:08. Para las bibliotecas de C. glabrata , la gama Ct establecida utilizando la cepa de C. glabrata ATCC fue entre los 16-18 ciclos con un rango de concentración de biblioteca promedio de 300-500 pM. El volumen correspondiente de los bibliotecas de ADN desnaturalizados fue dentro del rango de 60-65 μL para un rango de densidad de clúster entre 200-250 K/mm2.
Los archivos de datos de secuencia deben ser demultiplexan antes de su análisis posterior. Esto puede lograrse clasificando en sus respectivas bibliotecas usando sus códigos de barras después de la secuencia. Un paso opcional de ajuste de calidad de los archivos FASTQ puede realizarse antes de análisis de datos. La Lee de la secuencia de los aislamientos de WGS se analizaron mediante un flujo de trabajo personalizado creado en un paquete de software estándar. Esto permitió recortar de baja calidad Lee y entonces asignar a la referencia del genoma de Candida . El genoma de referencia, CBS138, fue descargado de la base de datos de genoma de Candida (CGD) y vinculado al flujo de trabajo antes del análisis. Se repite la presencia de ADN en el genoma de Candida (por ejemplo, genes de adhesina tienen repeticiones de ADN) puede complicar la alineación de secuencias cortas read y el llamado SNP. Esto puede mejorarse mediante la realineación local adicional de secuencias asignadas. La salida del flujo de trabajo fue una lista de variantes estructurales que genes anotados no sinónimo sinónimo SNP posiciones y cobertura. Esto fue utilizada para identificar SNPs en genes de interés y preparar el informe final de análisis para los aislamientos (tabla 6).
Hay que reconocer algunas limitaciones de nuestro estudio y enfoque. Nuestro informe se basa en pequeño número de aislados y no hay ninguna base de datos estándar resistome hongos de Micología clínica. Aunque la secuenciación del ADN Sanger es más accesible a los laboratorios clínicos, ha limitado capacidad de detectar simultáneamente múltiples mutaciones en el gen que confieren resistencia en Candida spp (> 20 mutaciones FKS para equinocandina resistencia solamente). Con la consolidación de servicios de patología y disminuyendo los costos de secuenciación, la practicidad de usar WGS Sanger secuenciación, es probable que aumente. Sin embargo, una consideración importante es la configuración de laboratorio inicial y el costo de la aplicación del instrumento WGS, así como capacitación de usuario final del personal del laboratorio. Esencialmente se incluirían los costos a largo plazo, adquisición de kits de reactivos de secuenciación y accesorios. Costo adicional y un TAT mayor deberían esperarse si el instrumento de gt no es interno. Además, la presencia de secuencias repetidas de ADN en genomas puede complicar la alineación de secuencias cortas read y el llamado SNP. La disponibilidad de la referencia de mayor calidad genomas secuenciados utilizando mucho-leyó tecnologías ayudarán a mantener la calidad de la identificación de SNP.
En el futuro, WGS se espera que traiga mejoras en clínica por acelerado tiempo informes en entornos de diagnóstico que es fácilmente accesible e interpretado por los clínicos20,22. Esto se logra con desarrollo de comisariado y actualizadas WGS antimicóticos resistencia las bases de datos de novela y mutaciones confirmatorias para inferir resistencia antifúngica. Medida más genomas de levaduras clínicamente importantes de susceptibilidad conocida droga fenotípica para el análisis, nuevos marcadores y mecanismos de resistencia a los medicamentos antifúngicos suelen ser descubierto. Estos desarrollos reducirá sustancialmente los riesgos de fallas de tratamiento debido a resistencia a múltiples medicamentos y toxicidad de la droga. En conclusión, la siguiente secuencia de generación con protocolos de gestión de calidad apropiado permite la detección de genoma de mutaciones que confieren resistencia en Candida glabrata que pueden aumentar la prueba fenotípica en los laboratorios de Micología. Los conocimientos proporcionados por la secuenciación del genoma rápido de clínicamente relevante Candida spp fundamentalmente pueden cambiar nuestra comprensión de los mecanismos de resistencia a diferentes clases de agentes antifúngicos y mejorar la gestión de los pacientes con invasión enfermedades causadas por hongos.
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Disclosures
Los autores tienen sin intereses financieros competitivos y ningún conflicto de interés divulgar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el centro para enfermedades infecciosas y microbiología, salud pública. Los autores no han recibido ningún otro financiamiento para este estudio. Los autores agradecen Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann y Ranjeeta Menon por su asesoramiento y ayuda con el experimento de secuenciación del genoma entero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
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