Vi præsenterer her, en protokol til påvisning og kvantificering af lav rigelige molekyler i komplekse løsninger ved hjælp af molekylære prægning i kombination med en kapacitans biosensor.
Evne til at detektere og kvantificere biomolekyler i komplekse løsninger har altid været meget efterspurgte inden for naturvidenskab; anvendes til påvisning af biomarkører, forurenende stoffer og andre molekyler af interesse. Et almindeligt anvendte teknik til dette formål er det enzym-forbundet Immunosorbent Assay (ELISA), hvor ofte et antistof er rettet mod et bestemt mål molekyle, og en anden mærket antistof bruges til påvisning af det primære antistof, giver mulighed for at absolut kvantificering af biomolekyle under undersøgelsen. Men brugen af antistoffer som anerkendelse elementer begrænser robustheden af metoden. som gør brug af ved hjælp af mærket molekyler. For at overvinde disse begrænsninger, har Molekylær prægning gennemført, at skabe kunstige genkendelsessekvenser supplerer skabelon molekyle, og obsoleting nødvendigheden af at bruge antistoffer for første bindende. Yderligere, for endnu højere følsomhed, den sekundære mærket antistof kan erstattes af biosensorer afhængige kapacitans for kvantificering af mål-molekyle. I denne protokol beskriver vi en metode til hurtigt og etiket-fri detektere og kvantificere lav-rigelige biomolekyler (proteiner og vira) i komplekse prøver, med en følsomhed, der er væsentligt bedre end almindeligt anvendte detektionssystemer såsom ELISA. Dette er alle medieret af molekylære prægning i kombination med en kapacitans biosensor.
Kvantificering af biomolekyler bruges i mange forskellige forskningsområder inden for videnskab, beskæftiger metoder som radioimmunoassay (RIA) eller ELISA1. Nogle af disse metoder kræver en mærket reagens som en radioisotop eller enzym mærket antistof/antigen, hvilket gør dem arbejdskrævende og tidskrævende med komplekse procedurer2. Yderligere, robusthed, selektivitet og følsomhed af disse metoder er ikke tilstrækkeligt for alle analyser; især er de ikke tilstrækkelige, når attogram mængder skal analyseres, i stedet for piktogram mængder3. Til dette formål, har biosensorer opnået betydelig interesse4,5, især i kombination med molekylær prægning for en øget robusthed.
Molekylær prægning bygger på at skabe hulrum af polymeriserende funktionelle monomerer omkring den skabelon6, at skabe kunstige genkendelsessekvenser, der perfekt ligner skabelon7. Denne teknik er blevet brugt til flere applikationer, herunder drug delivery systems og analytisk adskillelse, men også som biorecognition elementer i biosensorer8,9,10. Men der er stadig nogle vanskeligheder i udformningen af molekylemæssigt påtrykt polymerer (MIPs) for makromolekylære skabeloner som proteiner og celler11,12. På grund af dette, har mange forskere fokuseret på prægning skabelon protein direkte på et substrat, således at der skabes en overflade, der vil blive genkendt af target protein12. Denne overfladebehandling teknik, der anvendes for at ansætte anerkendelse hulrum for store molekyler og forsamlinger, herunder proteiner kaldes microcontact prægning13,14. Den generelle fremgangsmåde for metoden afhænger polymerisering mellem to flader – en skabelon stempel og en polymer støtte – som skabelonen er adsorberet på en overflade15,16, og bragt i kontakt med den monomer-behandlet overflade. Ved denne måde dannes en tynd polymerfilm på support via UV-polymerisering. Endelig, fjernes skabelonen, efterlod skabelon specifikke hulrum på overfladen af den påtrykt elektrode. Denne metode har nogle fordele, herunder et reduceret aktivitet tab af påtrykt molekylet, såvel som der kræver meget små mængder af skabelon molekyler til prægning behandle16,17. Således, disse omkostningseffektive, stabile, følsom og selektiv overflader kan oprettes på sensor overflader, rettet mod en skabelon af brugerens valg.
Biosensor kan anvendes til påvisning af enkelt proteiner og meget større biomacromolecules, herunder vira. En bestemt gruppe af virus at få de seneste interesse er den bacteriophage, som er en virus, der inficerer bakterier. Hurtige og følsomme påvisning af Bakteriofager er vigtigt under bioteknologiske og biofarmaceutiske processer for at bestemme infektioner af bakteriel kulturer med Bakteriofager18. De mest almindeligt anvendte biologiske analyse for bacteriophage påvisning er dobbelt lag agar metode19som er besværlig og tidskrævende. Har gjort flere forsøg på at udvikle nye diagnostiske redskaber for vira (herunder Bakteriofager) atomic force mikroskopi (AFM)20, interferometri21, elektrokemi22og sensor system23, 24. en masse arbejde har været fokuseret på biosensorer på grund af deres fordele som er nem at betjene, meget følsomme, og i stand til real-time måling15,25. En bestemt type af biosensor er baseret på ændringer i kapacitans. Disse kapacitiv biosensorer er de elektrokemiske sensorer, der måler forandringer i de dielektriske egenskaber når en analysand interagerer med et biorecognition element på sensoren overfladen, forårsager et fald i kapacitans2,4 . Kapacitiv biosensorer har været anvendt til påvisning af forskellige analysander som antigener, antistoffer, proteiner og heavy metal ioner6,26,27,28. Disse typer af biosensorer har mange fordele som iboende hurtighed, høj følsomhed, enkelhed, lave omkostninger, nem manipulation og real-time måling uden mærkning29.
Den metode beskrevet heri er rettet mod muliggør påvisning og kvantificering af lav-rigelige biomolekyler i meget komplekse prøver, uden savn i bruger nogen mærkning. Især er teknikken mest nyttige i atto-pikogram vifte af biomolekyler, hvor andre kommercielt eksisterende instrumenter undlader at nøjagtigt kvantificere deres mål.
Når denne metode udføres, er der nogle vigtige skridt, der skal overvejes, mens efter protokollen. Et kritisk trin er trinnet rengøring med sure piranha løsning. Trin 2.1 må ikke være mere end 10 min. Skabelon-løsning til trin 1.4 må ikke overstige 0,1 mg/mL, da disse værdier er blevet optimeret tidligere. Cyklisk voltametric scanninger må ikke overstige 15 cykler for at opnå den optimale tykkelse. For trin 3.1.3 er 1,5 µL en optimeret værdi. Denne værdi må ikke være højere for denne specifikke type af elektrode. Hvis UV hærdende system har en effekt på 400 W, skal så af polymerisering udføres til et maksimum på 10-15 min. Så snart APS (initiator) er tilføjet til løsningen efter TEMED, skal de efterfølgende trin udføres meget hurtigt for at undgå umiddelbare polymerisation (trin 3.2.5).
En af de mest kritiske trin er fjernelse af skabelon stempel fra overfladen efter UV polymerisering. Hvis dette trin ikke er udført korrekt, er der risiko for, at de polymere film på overfladen af elektrode kan blive fjernet med stempel. Det anbefales derfor, at nedsænke elektroden og protein stempel på toppen i en opløsning af vand efter polymerisering, derefter fjerne stempel meget langsomt og omhyggeligt fra overfladen (trin 3.1.6).
Baseret på skabelonen bruges, kan ændringer i type og forholdet mellem monomerer anvendes (funktionel monomere og tværs linker) vurderes med hensyn til generering af højere følsomhed. Dette skal bestemmes empirisk. Yderligere, affinitet bindingen af skabelon molekyle som regel involverer flere forskellige interaktioner samtidigt. Derfor kan dette føre til problemer under regenerering trin. Hvis den bundne skabelon ikke er udgivet fra overfladen korrekt, kan dette påvirke genbrugelighed af elektrode til yderligere analyse. Disse multipoint tilhørsforhold kan også skyldes bindende via svage vekselvirkninger. I sådanne systemer, kan ikke-specifik binding finde sted, som kan have en negativ indflydelse selektivitet system16. Disse er fælles, og generelle, begrænsninger af metoden.
Ud over disse specifikke begrænsninger er der mange væsentlige fordele ved metoden drøftet over eksisterende metoder. Mens RIAs, ringprøver og fluorometriske målinger er meget følsomme, kræver de brugen af mærket materiale (enten skabelonen eller detektor), mens biosensor er helt etiket-fri. Disse metoder er også dyrere og mere tidskrævende. En biosensor tilgang giver mulighed for hurtig, parallel syntese af mindsteimportpriserne i forskellige kompositioner på samme tid16. Da kun et par microliters af monomere løsning er påkrævet til forberedelse, er metoden praktisk, når du bruger dyre eller på anden måde begrænset monomerer. Yderligere, enkelt MIP elektroder kan bruges til ca 80 analyser uden en betydelig nedgang i ydelse, hvilket er betydeligt højere end andre eksisterende metoder30. Eksisterende metoder også lider, i varierende grader af lav følsomhed og selektivitet, mens den beskrevne metode giver mulighed for påvisning og kvantificering af molekyler i rækken pM med høj selektivitet.
På grund af omkostningseffektivitet, lethed af instrumentet, og real-time følsomme opdagelse i kort tid i forhold til eksisterende metoder, biosensorer er meget lovende punkt af pleje detektionssystemer under markforhold; f.eks.for miljøovervågning og programmer i udviklingslandene. I mange programmer inden for diagnosticering af sygdommen er real-time, følsom, selektiv og hurtig påvisning af en biomarkør i en kompleks blanding som serum påkrævet15,25. Her, er biosensorer overlegen i forhold til eksisterende metoder, navnlig på grund af deres robusthed og følsomhed. Specielt til påvisning af smitstoffer anses Bakteriofager for nylig som alternativ biorecognition element for biosensorer på grund af deres vært bakterier specificitet33,34,35. Udskiftning af antistoffer med Bakteriofager er meget lovende for at reducere omkostningerne og øge stabiliteten yderligere36. Et sådant system vil også give mulighed for påvisning og kvantificering af specifikke phages i miljøet og fra kliniske prøver. På grund af forekomsten af Bakteriofager, og deres evne til at transduce bakterier med antibiotisk resistens gener37,38, kan sådan en metode være værdifuldt at studere spredningen af resistent bakteriel.
The authors have nothing to disclose.
Maria Baumgarten (IQ bioteknologi Platform, infektion medicin, Lunds Universitet) er anerkendt for udfører og leverer scanning elektron micrographs. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den svenske forskning Rådet form (2017-00100) som en del af tredje fælles programmering initiativet antimikrobiel resistens (JPIAMR) kald “Transmission Dynamics.” Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, tolkning, skrivning, forberedelse af manuskriptet, som beslutningen om at sende, eller afgørelse til at offentliggøre arbejdet.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |