Här presenterar vi ett protokoll för påvisande och kvantifiering av låg rikligt molekyler i komplexa lösningar med hjälp av molekylär prägling i kombination med en kapacitans biosensor.
Förmågan att upptäcka och kvantifiera biomolekyler i komplexa lösningar har alltid varit mycket eftertraktade inom naturvetenskap; som används för detektion av biomarkörer, föroreningar och andra molekyler av intresse. En vanligt förekommande teknik för detta ändamål är Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), där ofta en antikropp är riktad mot en specifik målmolekyl och en andra märkt antikropp används för detektion av primär antikropp, vilket möjliggör den absolut kvantifiering av biomolecule under studien. Men begränsar användningen av antikroppar som erkännande element robustheten av metoden. som gör att behöva använda märkta molekyler. För att övervinna dessa begränsningar, har molecular imprinting genomförts, att skapa artificiell erkännande platser kompletterar mallen molekylen och obsoleting nödvändigheten av att använda antikroppar för inledande bindande. Ytterligare, för ännu högre känslighet, sekundära märkta antikroppen kan ersättas av biosensorer som förlitar sig på kapacitansen för kvantifiering av målmolekylen. I detta protokoll beskriver vi en metod för att snabbt och etikett-gratis detektera och kvantifiera låg-riklig biomolekyler (proteiner och virus) i komplexa prover, med en känslighet som är betydligt bättre än vanliga detekteringssystem såsom ELISA. Detta är alla medieras av molecular imprinting i kombination med en kapacitans biosensor.
Kvantifiering av biomolekyler används inom många olika forskningsområden inom vetenskap, använda metoder som radioimmunoassay (RIA) eller ELISA1. Vissa av dessa metoder kräver en märkt reagens som en radioisotop eller enzym märkt antikropp/antigen, vilket gör dem arbetskrävande och tidsödande med komplexa procedurer2. Ytterligare, den robusthet, selektivitet och känslighet för dessa metoder är inte tillräckligt för alla analyser; i synnerhet räcker de inte när attogram mängder behöver analyseras, snarare än piktogram kvantiteter3. För detta ändamål vunnit biosensorer stort intresse4,5, särskilt i kombination med molecular imprinting för en ökad robusthet.
Molecular imprinting förlitar sig på att skapa hålrum genom polymeriserande funktionella monomerer runt mall6, skapa konstgjorda erkännande platser som helt liknar den mall7. Denna teknik har använts för flera olika tillämpningar, inklusive drug delivery system och analytiska separation, men också som biorecognition element i biosensorer8,9,10. Det finns dock fortfarande vissa svårigheter i utformningen av molekylärt präglade polymerer (MIPs) för makromolekylära mallar som proteiner och celler11,12. På grund av detta, har många forskare fokuserat på imprinting proteinet mallen direkt på ett substrat, vilket skapar en yta som känns igen av de mål protein12. Denna ytbehandling teknik används för att anställa erkännande hålrum för stora molekyler och församlingar inklusive proteiner kallas microcontact prägling13,14. Det allmänna förfarandet för metoden beror på polymerisation mellan två ytor – en mall stämpel och en polymer support – som mallen är adsorberat på en surface15,16, och kom i kontakt med den monomer-behandlad yta. Genom detta sätt bildas en tunn polymerfilm stöd via UV-polymerisation. Slutligen, mallen tas bort, lämnar bakom mallen specifika hålrum på ytan av präglade elektroden. Denna metod har några fördelar inklusive en minskad aktivitet förlust av präglade molekylen, samt som kräver mycket små mängder av mallen molekyler för imprinting bearbeta16,17. Således kan dessa kostnadseffektiva, stabil, känslig och selektiv ytor skapas på sensorn ytor, inriktning någon mall av användarens val.
Biosensor kan användas för detektion av enstaka proteiner och mycket större biomakromolekyler, inklusive virus. En viss grupp av virus som vinner senaste intresse är den bacteriophage, som är ett virus som infekterar bakterier. Snabb och känslig detektion av bakteriofager är viktigt under biotekniska och biofarmaceutiska processer för att fastställa infektionerna i bakteriekulturer med bakteriofager18. Den vanligaste biologiska test för bacteriophage upptäckt är den dubbla lager agar metod19, som är mödosam och tidskrävande. Flera försök har gjorts att utveckla nya diagnostiska verktyg för virus (inklusive bakteriofager) såsom atomic force microscopy (AFM)20, interferometri21, elektrokemi22och sensor system23, 24. en hel del arbete har fokuserats på biosensorer på grund av deras fördelar som enkel att använda, mycket känsliga och kan i realtid mätning15,25. En viss typ av biosensor är baserad på förändringar i kapacitans. Dessa kapacitiv biosensorer är de elektrokemiska sensorer som mäter förändringar i dielektriska egenskaper när en analyt interagerar med ett biorecognition inslag på sensorn ytan, orsakar en minskning av kapacitans2,4 . Kapacitiv biosensorer har använts för detektion av olika analyter som antigener, antikroppar, proteiner och tungmetall joner6,26,27,28. Dessa typer av biosensorer har många fördelar som inneboende snabbhet, hög känslighet, enkelhet, låg kostnad, lätt manipulation och realtid mätning utan märkning29.
Den metod som beskrivs häri syftar till att aktivera detektering och kvantifiering av låg-riklig biomolekyler i komplexa prover, utan att behöva använda någon märkning. I synnerhet är tekniken mest användbar i intervallet atto-pikogram av biomolekyler, där andra kommersiellt befintliga instrument misslyckas att exakt kvantifiera deras mål.
När denna metod utförs, finns det några viktiga steg som måste beaktas när den följer protokollet. Ett kritiskt steg är rengöring steg med sura piranha lösning. Steg 2.1 får inte vara mer än 10 min. Den mall lösningen för steg 1.4 får inte överstiga 0,1 mg/mL, eftersom dessa värden har optimerats tidigare. Cyklisk voltametric skanningar får inte överstiga 15 cykler för att få optimal tjocklek. För steg 3.1.3 är 1,5 µL en optimerad värde. Detta värde får inte vara högre för denna särskilda typ av elektrod. Om UV bota system har en effekt på 400 W, måste sedan polymerisation utföras för högst 10-15 min. Så snart APS (initierare) läggs till lösningen efter TEMED, måste det efterföljande steget utföras mycket snabbt för att undvika omedelbara polymerisation (steg 3.2.5).
En av de viktigaste stegen är borttagande av mallen stämpeln från yta efter UV polymerisation. Om detta steg inte utförs på rätt sätt, finns det en risk att den polymera filmen på ytan av elektroden kan tas bort med stämpel. Därför är det rekommenderat att Sänk ned elektroden och protein stämpeln på topp i en lösning av vatten efter polymerisation, ta sedan bort stämpeln mycket långsamt och försiktigt från ytan (steg 3.1.6).
Baserat på den mall som används, får ändringar i typ och förhållandet av monomerer som används (funktionell monomer och cross-linker) bedömas när det gäller genererar högre känslighet. Detta måste bestämmas empiriskt. Vidare att affinitet av mallen molekylen oftast flera olika interaktioner samtidigt. Därför kan detta leda till problem under regenerering stegen. Om mallen bundna inte frigörs från ytan ordentligt, kan detta påverka reusabilityen av elektroden för vidare analys. Dessa multipoint tillhörighet kan också resultera från att binda via svagare interaktioner. I sådana system, kan icke-specifik bindning ske, vilket kan påverka negativt selektivitet av system16. Dessa är gemensamma och allmänna, begränsningar av metoden.
Förutom dessa specifika begränsningar finns det många betydande fördelar av diskuteras metoden jämfört med befintliga metoder. RIA, ELISAs och fluorometric mätningar är mycket känsliga, men de måste användningen av märkt material (mall eller detektor), medan biosensor är helt etikett-fri. Dessa metoder är också dyrare och mer tidskrävande. En biosensor tillvägagångssätt möjliggör snabb, parallell syntes mips i olika sammansättningar på samma tid16. Eftersom bara några mikroliter av monomeren lösningen krävs för förberedelse, är metoden praktiskt när du använder dyra eller på annat sätt begränsad monomerer. Ytterligare, enda MIP elektroder kan användas för ca 80 analyser utan en avsevärd minskning i prestanda, vilket är betydligt högre än andra befintliga metoder30. Befintliga metoder också lida, i varierande grad, av låg känslighet och selektivitet, medan den beskrivna metoden möjliggör identifiering och kvantifiering av molekyler i intervallet pM med hög selektivitet.
På grund av kostnadseffektivitet, användarvänlighet verksamma instrumentet, och realtid känsliga upptäckt på kort tid jämfört med befintliga metoder, biosensorer är mycket lovande punkt-av system för upptäckt av vård under fältmässiga förhållanden; t.ex., miljöövervakning och för program i utvecklingsländer. I många applikationer inom diagnos av sjukdomen är realtid, känslig, selektiv och snabb påvisande av en biomarkör i en komplex blandning som serum krävs15,25. Här, är biosensorer överlägsna befintliga metoder, i synnerhet på grund av deras robusthet och känslighet. Specifikt för upptäckt av smittämnen betraktas bakteriofager nyligen som alternativa biorecognition element för biosensorer på grund av sin värd bakterier specificitet33,34,35. Byte av antikroppar med bakteriofager är mycket lovande för att minska kostnaderna och öka den stability ytterligare36. Ett sådant system kan även för påvisande och kvantifiering av specifika Fager i miljön och från kliniska prover. På grund av förekomsten av bakteriofager, och deras förmåga att transduce bakterier med antibiotikaresistens gener37,38, kan en sådan metod vara värdefulla studera spridningen av resistenta bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Maria Baumgarten (IQ bioteknik plattform, infektionsmedicin, Lunds universitet) är erkänt för att utföra och ge skanning elektronmikrografier. Detta arbete stöds av bidrag från The Forskningsrådet Formas (2017-00100) som en del av det europeiska tredje gemensamma Programming initiativet på antimikrobiell resistens (JPIAMR) samtal ”Transmission Dynamics”. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, tolkning, skrivande, beredning av manuskriptet, beslut att skicka, eller beslut att publicera arbetet.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |