Här presenterar vi en lätt-till-använda och mångsidig metod för att utföra live avbildning av utvecklingsprocesser i allmänhet och muskel-senan morfogenes särskilt i levande Drosophila puppor.
Muskler tillsammans med senor och skelett aktivera djur inklusive människan för att flytta sina kroppsdelar. Muskel morfogenes är starkt bevarad från djur till människor. Därför kan kraftfull Drosophila modell systemet användas för att studera begreppen muskel-senan utveckling som kan också tillämpas på mänskliga muskler biologi. Här beskriver vi i detalj hur morfogenes av vuxen muskel-senan systemet enkelt kan avbildas i levande, utveckla Drosophila puppor. Metoden tillåter därför undersöka proteiner, celler och vävnader i deras fysiologiska miljö. Utöver ett stegvisa protokoll med praktiska tips erbjuder vi en omfattande översikt av fluorescently märkta markör proteiner som är lämpliga för att studera systemet muskel-senan. För att belysa de mångsidiga tillämpningarna av protokollet, visar vi exempel filmer alltifrån visualisering av långsiktiga morphogenetic händelser – som inträffar på tidsskalan för timmar och dagar – till visualisering av kortsiktiga dynamiska processer som muskelryckningar förekommande på tidsskala sekunder. Sammantaget bör detta protokoll aktivera läsaren att utforma och utföra live-imaging experiment för att undersöka muskler-senan morfogenes i intakta organismen.
Muskel-senan apparaten tillåter djur inklusive människan för att flytta sina kroppsdelar. De molekylära byggstenarna av muskel-senan systemet är starkt konservativa. Därför kan begreppen muskel-senan utveckling relevanta för mänskliga muskler biologi, till exempel muskel morfogenes, muskel-senan fastsättning och myofibril självorganisering, studeras genom att använda Drosophila melanogaster som en lättillgänglig modellsystem. Drosophila Pupp systemet har flera experimentella fördelar. Första skede Pupp – är när vuxna musklerna bildas – organismen oskaftade och därför lätt att bild på Mikroskop under ett antal timmar eller dagar. För det andra, många muskler form nära nog under Pupp yta så att de kan avbildas inuti intakt, delvis genomskinliga organismen. För det tredje, musklerna kan undersökas i deras naturliga miljö, där de är anslutna till bilda exoskelett via senan celler och vävnad spänning byggs upp. Detta är inte möjligt i muskel cell kultur system. Och slutligen en uppsjö av genetiska verktyg finns i Drosophila. Bland dessa finns många fluorescently märkta markörer som tillåter märkning av specifika celltyper eller subcellulära strukturer för imaging i vivo.
Tabell 1 sammanfattar de viktigaste markörer som används för att studera muskel-senan morfogenes. Den innehåller markörer i ökad utsträckning använda GAL4-UAS-system1 och endogent taggade protein markörer2,3,4. Fördelen med GAL4-UAS-systemet är att markörerna vanligen uttrycks på höga nivåer, vilket resulterar i en stark signal som enkelt kan avbildas i hela-mount puppor. Dessutom kan vävnadsspecificitet uppnås genom att välja GAL4 drivrutiner noggrant. Fördelen med fusionsproteinerna uttryckt under endogen kontroll är att dynamiken i de respektiva proteinerna kan studeras i vivo, medan de kan också användas som markörer för olika celltyper eller specifika subcellulära strukturer, exempelvis ΒPS-Integrin-GFP för muskel fastsättning platser. Tillsammans ger dessa markörer hög flexibilitet i experimentell design och val av forskningsproblem som kan lösas nu och i framtiden.
Märkt struktur | Markör | Uttryck och lokalisering | Klass | Lager nummer | Kommentar | Ref. | ||||||
Muskel | Mef2-GAL4 | alla myoblasts och alla muskler i alla skeden | GAL4 line | BL 27390 | 5 | |||||||
1151-GAL4 | Adult muskel prekursorer och tidig myotubes tills ≈24 h APF | GAL4 linje, enhancer fällan | – | 6 | ||||||||
Act79B-GAL4 | hoppa muskel vid differentiering | GAL4 line | – | 7 | ||||||||
Act88F-GAL4 | indirekta flygmuskler börjar ≈14 h APF | GAL4 line | – | 7 | ||||||||
Act88F– Cameleon 3.1 | indirekta flygmuskler börjar ≈14 h APF | Act88F förstärkare / arrangören kör Cameleon 3.1 | – | Ca2 + indikator | 8 | |||||||
Act88F-GFP | indirekta flygmuskler börjar ≈14 h APF | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG78 och fTRG10028 | 4 | ||||||||
Honom– nls-GFP | Adult muskel prekursorer, kärnkraft, tills ≈24 h APF i indirekta flygmuskler | förstärkare/arrangören med nls-GFP reporter | – | 1.5 kb enhancer fragment | 9 | |||||||
MHC-Tau-GFP | mikrotubuli i DLM mallar och skilja muskler | förstärkare/arrangören med Tau-GFP reporter | BL 53739 | 10 | ||||||||
ΒTub60D-GFP | mikrotubuli i myotubes (e.g. i indirekta flygmuskler från ≈14 h AFP, starkt fallande efter ≈48 h APF) | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG958 | 4 | ||||||||
MHC-GFP (weeP26) | sarkomerer (tjocka filament) i alla kroppens muskler (t.ex. i indirekta flygmuskler från ≈30 h APF) | GFP-fällan | – | använda heterozygot, etiketter en isoform delmängd | 11 | |||||||
SLS-GFP | sarkomerer (Z-disc) i alla kroppens muskler (t.ex. i indirekta flygmuskler från ≈30 h APF) | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | – | G53, Använd heterozygot | 2 | |||||||
Zasp66-GFP | Z-skivan i alla kroppens muskler | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
Zasp52-GFP | Z-skivan i alla kroppens muskler | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
HTS-GFP | aktin bindande; uttryckt i epitel, myoblasts och myotubes | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG585 | 4 | ||||||||
Dlg1-GFP | epitelceller korsningar, myoblasts och membran i muskler i alla skeden | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG502 | 4 | ||||||||
Muskel fastsättning webbplats | ΒPS-Integrin-GFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-knock-in | – | 13 | |||||||
Talin-GFP och -mCherry | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fällan (härma linje) | – | 3 | ||||||||
Talin-GFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG587 | 4 | ||||||||
ILK-GFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
Vinc-GFP och -RFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fusion (transgenens) | – | 13 | ||||||||
Senan | SR-GAL4 | Thorax senan celler, i hela Pupp scenen | GAL4 linje, enhancer fällan | BL 26663 | homozygot dödliga | 14 | ||||||
Muskler och senor | DUF-GAL4 | muskler och epitel, tidig debut | GAL4 line | BL 66682 | kirre-rP298, grundare cell markör | 15 | ||||||
UAS-reportrar | UAS– GFP-Gma | aktin bindande | UAS linje | BL 31776 | aktin bindande domän av Moesin smält till GFP | 16 | ||||||
UAS– mCherry-Gma | aktin bindande | UAS linje | – | GMA smält till mCherry | 17 | |||||||
UAS- Lifeact-GFP | aktin bindande | UAS linje | BL 35544 | 18 | ||||||||
UAS– Lifeact-Ruby | aktin bindande | UAS linje | BL 35545 | 18 | ||||||||
UAS-CD8-GFP | membranet bindande | UAS linje | olika aktier, t.ex.: BL 32184 | 19 | ||||||||
UAS-CD8-mCherry | membranet bindande | UAS linje | BL 27391 och 27392 | 20 | ||||||||
UAS-palm-mCherry | membranet bindning genom palmitoylation | UAS linje | BL 34514 | UAS– brainbow | 21 |
Tabell 1: Taggade Fluorescently protein markörer passar studerar muskel-senan morfogenes i vivo.
Här beskriver vi i detalj hur avbildning av muskel-senan morfogenes i levande puppor kan utföras enkelt och framgångsrikt (figur 1). Alternativt kan vara fast puppor, dissekeras och immunostained, vilket gör att använda antikroppar att också märka proteiner som inte live markörer är tillgängliga22. I det här fallet är imaging kvaliteten generellt högre eftersom ingen rörelse och strukturera av intresse kan placeras i närheten av täckglas. Dock dissektion och fixering kan leda till skador och molekylär eller vävnad dynamik, till exempel muskelryckningar, kan endast studeras i den levande organismen.
Presenterade protokollet beskriver hur du bild muskel-senan morfogenes i levande Drosophila puppor med hjälp av olika fluorescently märkta proteiner. Här i vivo imaging strategi kan användas för att studera utvecklingsprocesser i deras naturliga miljö i hela organismen.
Det är avgörande för ett lyckat experiment att hitta rätt utvecklande tidpunkten att analysera. Exempelvis initiera dorsolongitudinal indirekta flygmuskler fäster senan målen på ≈16 h APF23 medan magmusklerna utvecklas senare och bifoga i båda ändarna bara mellan 30 och 40 h APF26. Följaktligen, tidigare publicerad litteratur bör användas för att hitta rätt tidpunkter för att analysera eller, om den vävnad eller struktur av intresse inte har studerats i detalj innan, den övergripande utvecklingen har att präglas först.
För montering puppor framgångsrikt på de specialbyggda plast diabilder, är det viktigt att spåren har lämpliga dimensioner: behovet av spåren att vara 1,0-1,5 mm breda och 0,3 – 0,4 mm djup. Detta djup kan justera det exakta avståndet till det översta täckglaset med spacer coverslips som behövs. Minst en spacer täckglas bör dock användas för att undvika tömning 50% glycerol från provet genom kapillärkrafter. Den korrekta positioneringen av the puppor i spåret kräver vissa erfarenhet och bör optimeras så att strukturen av intresse är så nära som möjligt till täckglaset.
Om ett stort antal puppor är tänkt för att avbildas i en Mikroskop session, kan de alla monteras i förväg och sedan lagras i kuvös tills imaging för att säkerställa rätt utvecklingsmässiga timing. Puppor bör överleva hela förfarandet och även åtminstone försöka eclose om höll på bilden efter imaging. Överlevnaden kan användas som en avläsning för att kontrollera huruvida villkor som tänkbar skada puppor.
Imaging inställningarna bör väljas med omsorg enligt de experimentella krav. För korta filmer behöver en hög bildhastighet kontra en hög signal-brus-förhållande balanseras, medan relativt hög lasereffekt kan användas utan att skada puppor för mycket. Dock för långsiktiga filmer, laser makt måste hållas på en måttlig nivå och puppor bör inte avbildas kontinuerligt utan snarare vid vissa tidpunkter, till exempel varje 20 min. För att säkerställa att strukturera av intresse inte rör sig ur synfältet, kan det vara nödvändigt att justera placeringen av z-stacken mellan tidpunkter. Vår kunskap påverkar öppnandet av Pupp fallet i sig inte fosterskadande timing. En temperatur-kontrollerad fas bör dock användas för långsiktig filmer för att säkerställa rätt utvecklingsmässiga timing. Med dessa överväganden i åtanke, kan mycket informativa filmer förvärvas.
Presenterade protokollet kan användas för att visualisera inte bara muskel-senan morfogenes utan också andra utveckla vävnader, till exempel den vinge epitel29. Endast tre ändringar i detta protokoll krävs: (1) öppnande av Pupp höljet ovanför vingen i stället för i bröstkorgen eller buken, (2) positionering av puppor med vingen mot det översta täckglaset och (3) användningen av olika fluorescerande markör proteiner. Med befordran av CRISPR/Cas9-teknik blir mer endogent märkta fluorescerande proteiner tillgängliga, eftersom det har blivit enklare att rikta endogena loci i Drosophila30,31 , 32. i framtiden, detta gör att belysa dynamiken i många proteiner, celler och hela vävnader i deras fysiologiska miljö i detalj.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Manuela Weitkunat för förvärvet av filmen S3. Vi är tacksamma att Reinhard Fässler för generösa stöd. Detta arbete fick stöd av den EMBO Young Investigator Program (F.S.), Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), i Max Planck-sällskapet (S.B.L., F.S.), den Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), excellence initiativ Aix-Marseille universitet AMIDEX (F.S.), den LabEX-informera (F.S.) och Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
fly food in bottles (or vials) | – | – | standard culture medium |
paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | – | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |