Summary
Här presenterar vi en lätt-till-använda och mångsidig metod för att utföra live avbildning av utvecklingsprocesser i allmänhet och muskel-senan morfogenes särskilt i levande Drosophila puppor.
Abstract
Muskler tillsammans med senor och skelett aktivera djur inklusive människan för att flytta sina kroppsdelar. Muskel morfogenes är starkt bevarad från djur till människor. Därför kan kraftfull Drosophila modell systemet användas för att studera begreppen muskel-senan utveckling som kan också tillämpas på mänskliga muskler biologi. Här beskriver vi i detalj hur morfogenes av vuxen muskel-senan systemet enkelt kan avbildas i levande, utveckla Drosophila puppor. Metoden tillåter därför undersöka proteiner, celler och vävnader i deras fysiologiska miljö. Utöver ett stegvisa protokoll med praktiska tips erbjuder vi en omfattande översikt av fluorescently märkta markör proteiner som är lämpliga för att studera systemet muskel-senan. För att belysa de mångsidiga tillämpningarna av protokollet, visar vi exempel filmer alltifrån visualisering av långsiktiga morphogenetic händelser – som inträffar på tidsskalan för timmar och dagar – till visualisering av kortsiktiga dynamiska processer som muskelryckningar förekommande på tidsskala sekunder. Sammantaget bör detta protokoll aktivera läsaren att utforma och utföra live-imaging experiment för att undersöka muskler-senan morfogenes i intakta organismen.
Introduction
Muskel-senan apparaten tillåter djur inklusive människan för att flytta sina kroppsdelar. De molekylära byggstenarna av muskel-senan systemet är starkt konservativa. Därför kan begreppen muskel-senan utveckling relevanta för mänskliga muskler biologi, till exempel muskel morfogenes, muskel-senan fastsättning och myofibril självorganisering, studeras genom att använda Drosophila melanogaster som en lättillgänglig modellsystem. Drosophila Pupp systemet har flera experimentella fördelar. Första skede Pupp – är när vuxna musklerna bildas – organismen oskaftade och därför lätt att bild på Mikroskop under ett antal timmar eller dagar. För det andra, många muskler form nära nog under Pupp yta så att de kan avbildas inuti intakt, delvis genomskinliga organismen. För det tredje, musklerna kan undersökas i deras naturliga miljö, där de är anslutna till bilda exoskelett via senan celler och vävnad spänning byggs upp. Detta är inte möjligt i muskel cell kultur system. Och slutligen en uppsjö av genetiska verktyg finns i Drosophila. Bland dessa finns många fluorescently märkta markörer som tillåter märkning av specifika celltyper eller subcellulära strukturer för imaging i vivo.
Tabell 1 sammanfattar de viktigaste markörer som används för att studera muskel-senan morfogenes. Den innehåller markörer i ökad utsträckning använda GAL4-UAS-system1 och endogent taggade protein markörer2,3,4. Fördelen med GAL4-UAS-systemet är att markörerna vanligen uttrycks på höga nivåer, vilket resulterar i en stark signal som enkelt kan avbildas i hela-mount puppor. Dessutom kan vävnadsspecificitet uppnås genom att välja GAL4 drivrutiner noggrant. Fördelen med fusionsproteinerna uttryckt under endogen kontroll är att dynamiken i de respektiva proteinerna kan studeras i vivo, medan de kan också användas som markörer för olika celltyper eller specifika subcellulära strukturer, exempelvis ΒPS-Integrin-GFP för muskel fastsättning platser. Tillsammans ger dessa markörer hög flexibilitet i experimentell design och val av forskningsproblem som kan lösas nu och i framtiden.
| Märkt struktur | Markör | Uttryck och lokalisering | Klass | Lager nummer | Kommentar | Ref. | ||||||
| Muskel | Mef2-GAL4 | alla myoblasts och alla muskler i alla skeden | GAL4 line | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | Adult muskel prekursorer och tidig myotubes tills ≈24 h APF | GAL4 linje, enhancer fällan | - | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | hoppa muskel vid differentiering | GAL4 line | - | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | indirekta flygmuskler börjar ≈14 h APF | GAL4 line | - | 7 | ||||||||
| Act88F- Cameleon 3.1 | indirekta flygmuskler börjar ≈14 h APF | Act88F förstärkare / arrangören kör Cameleon 3.1 | - | Ca2 + indikator | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | indirekta flygmuskler börjar ≈14 h APF | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG78 och fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Honom- nls-GFP | Adult muskel prekursorer, kärnkraft, tills ≈24 h APF i indirekta flygmuskler | förstärkare/arrangören med nls-GFP reporter | - | 1.5 kb enhancer fragment | 9 | |||||||
| MHC-Tau-GFP | mikrotubuli i DLM mallar och skilja muskler | förstärkare/arrangören med Tau-GFP reporter | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | mikrotubuli i myotubes (e.g. i indirekta flygmuskler från ≈14 h AFP, starkt fallande efter ≈48 h APF) | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-GFP (weeP26) | sarkomerer (tjocka filament) i alla kroppens muskler (t.ex. i indirekta flygmuskler från ≈30 h APF) | GFP-fällan | - | använda heterozygot, etiketter en isoform delmängd | 11 | |||||||
| SLS-GFP | sarkomerer (Z-disc) i alla kroppens muskler (t.ex. i indirekta flygmuskler från ≈30 h APF) | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | - | G53, Använd heterozygot | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-skivan i alla kroppens muskler | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-skivan i alla kroppens muskler | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-GFP | aktin bindande; uttryckt i epitel, myoblasts och myotubes | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | epitelceller korsningar, myoblasts och membran i muskler i alla skeden | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Muskel fastsättning webbplats | ΒPS-Integrin-GFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-knock-in | - | 13 | |||||||
| Talin-GFP och -mCherry | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fällan (härma linje) | - | 3 | ||||||||
| Talin-GFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fusion (TransgeneOme linan) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| ILK-GFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fällan (FLUGFÅNGARE linje) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| Vinc-GFP och -RFP | muskel fastsättning platser (t.ex. start ≈18 h AFP i indirekta flygmuskler) | GFP-fusion (transgenens) | - | 13 | ||||||||
| Senan | SR-GAL4 | Thorax senan celler, i hela Pupp scenen | GAL4 linje, enhancer fällan | BL 26663 | homozygot dödliga | 14 | ||||||
| Muskler och senor | DUF-GAL4 | muskler och epitel, tidig debut | GAL4 line | BL 66682 | kirre-rP298, grundare cell markör | 15 | ||||||
| UAS-reportrar | UAS- GFP-Gma | aktin bindande | UAS linje | BL 31776 | aktin bindande domän av Moesin smält till GFP | 16 | ||||||
| UAS- mCherry-Gma | aktin bindande | UAS linje | - | GMA smält till mCherry | 17 | |||||||
| UAS- Lifeact-GFP | aktin bindande | UAS linje | BL 35544 | 18 | ||||||||
| UAS- Lifeact-Ruby | aktin bindande | UAS linje | BL 35545 | 18 | ||||||||
| UAS-CD8-GFP | membranet bindande | UAS linje | olika aktier, t.ex.: BL 32184 | 19 | ||||||||
| UAS-CD8-mCherry | membranet bindande | UAS linje | BL 27391 och 27392 | 20 | ||||||||
| UAS-palm-mCherry | membranet bindning genom palmitoylation | UAS linje | BL 34514 | UAS- brainbow | 21 | |||||||
Tabell 1: Taggade Fluorescently protein markörer passar studerar muskel-senan morfogenes i vivo.
Här beskriver vi i detalj hur avbildning av muskel-senan morfogenes i levande puppor kan utföras enkelt och framgångsrikt (figur 1). Alternativt kan vara fast puppor, dissekeras och immunostained, vilket gör att använda antikroppar att också märka proteiner som inte live markörer är tillgängliga22. I det här fallet är imaging kvaliteten generellt högre eftersom ingen rörelse och strukturera av intresse kan placeras i närheten av täckglas. Dock dissektion och fixering kan leda till skador och molekylär eller vävnad dynamik, till exempel muskelryckningar, kan endast studeras i den levande organismen.
Protocol
1. arrangera puppor
- Ställa in ett kors med 20-40 oskuld och hondjur ca 20 per flaska flyga mat (figur 1A). Alternativt, om bestånden kommer att användas, vänd varje lager i nya flaskor. För att få tillräckligt puppor, överväga att inrätta två flaskor per genotyp.
- Inkubera flaskorna vid 25 ° C (eller 27 ° C enligt experimentell design) i fem till sex dagar (figur 1B).
Obs: Hålla vända flugorna var två till tre dagar att undvika överbeläggning och säkerställa en kontinuerlig tillförsel av puppor. - Använd en våt borste att samla vita prepupae från väggarna i flaskorna och överföra dem till glas glasen (figur 1 c). Tid iscensättningen så att puppor nå önskad ålder vid start live imaging under mikroskopet.
Obs: Dessa prepupae ser ut som äldre puppor i termer av deras form, men de är fortfarande vit som larver. Uppkomsten av prepupal scenen definieras som 0 h efter puparium bildandet (0 h APF). - Ta bort klumpar av flyga mat fast vid puppor med en våt borste och orientera den ventrala sidan av the puppor mot den glasskiva med ett stereomikroskop (figur 1 d). Kassera puppor som fortfarande flyttar (för ung) eller som har börjat bli bruna (för gammal). Detta säkerställer att alla puppor har samma ålder (0 - 1 h APF).
- Märka bilder med genotyp, datum och tid för samling. Överföra glasskivor till en petriskål varje och Lägg till en våt vävnad för att förhindra puppor från att torka ut (figur 1E).
- Lagra puppor i en inkubator vid 25 ° C eller 27 ° C tills de når önskad ålder. Fortsätt med nästa steg 1 h innan imaging, så att puppor har önskad ålder vid start live imaging (steg 3), till exempel på 13 h APF för den film som visas i figur 2A-D.
Obs: Tidigaste möjlig tid utgår efter huvud-eversion av de puppor som förekommer vid 8-10 h APF på 27 ° C.
2. förbereda puppor för avbildning
- Se till att puppor nu stick till glas bild precis som de naturligtvis hålla sig till väggarna i flaskorna på grund av kvarstående flyga mat. Inget extra lim behövs. Om puppor inte stick tillräckligt väl på grund av hög luftfuktighet, öppna petriskål för några min till låt dem torka. Alternativt kan du överföra dem till dubbelhäftande tejp på en glasskiva, men detta är vanligtvis inte nödvändigt.
-
Öppna fönstret i Pupp fall för avbildning av indirekta flygmuskler (Figur 1F; Hoppa till avsnitt 2.3 för avbildning av buken muskler.)
- Orient de puppor som sticker till glas bild med främre vänd bort från forskaren under ett stereomikroskop. Justera zoomen till 2 X.
- Med ena änden av biologi klass #5 pincett, försiktigt peta ett hål i Pupp fallet dorsala till vingen slutar magen och bröstkorgen börjar.
- För att skära öppna Pupp fallet, försiktigt flytta tången till främre slutet av bröstkorgen längs vingen men undvika att skada utsatta wing vävnaden.
Obs: Om vätska läcker från puppa, den är skadad; Kassera den och börja om med en annan puppa. - Lyft upp avsnittet i Pupp fallet ovanför bröstkorgen med tången och sedan avbröt detta avsnitt med fin, skarp sax på motsatt sida av dorsala mittlinjen.
-
Öppna fönstret i Pupp fall för avbildning av magmusklerna (Figur 1 g)
- Orient de puppor som sticker till glas bild med främre vänd mot forskaren under ett stereomikroskop. Justera zoomen till 2 X.
- Med ena änden av biologi klass #5 pincett, försiktigt peta ett hål i Pupp fallet dorsala till wing där bröstkorgen slutar, och buken börjar.
- För att skära öppna Pupp fallet, försiktigt flytta tången mot den bakre änden av buken.
Obs: Om vätska läcker från puppa, den är skadad; Kassera den och börja om med en annan puppa. - Lyft upp avsnittet i Pupp fallet ovan buken med tången och sedan avbröt detta avsnitt med fin, skarp sax på motsatt sida av dorsala mittlinjen.
-
Mount puppor (Figur 1 H)
- Använd en våt pensel för att överföra upp till fem puppor till en plast slide med en groove (specialbyggda, återanvändbar, se diskussion och lista över material). Lägga till en eller två spacer coverslips varje sida beroende på djupet av spåret och tjockleken på puppor. Sätta en liten droppe vatten under varje spacer täckglas att göra det sticka i bilden och lämna lite utrymme mellan spåret och den spacer coverslips på varje sida.
Obs: Den spacer coverslips kan även permanent kopplas till bilden med superlim, i förväg. - Rikta puppor så att öppningen i Pupp fallet ansikten uppåt med borsten. Säkerställa noggrann positionering av the puppor i rätt vinkel för bra bildåtergivning kvalitet. Optimera vinkeln för varje vävnad och utvecklingsmässiga tidpunkt.
Obs: En liten mängd vatten i spåret gör placeringen av puppor lättare. Dränera överskottsvatten med pensel efteråt för att undvika drunkning. - Håll ett täckglas (18 x 18 mm) över puppor utan att röra dem. Placera små droppar (ca 0,5 µL) av 50% glycerol lösningen ovan varje Pupp fall vetter mot den täckglas med 20 µL pipett.
Obs: Den här proceduren säkerställer att droppar har samma avstånd som puppor. - Vänd täckglaset och placera det ovanför puppor för hand eller med hjälp av tången (standard #5) medan de vilar ena sidan av täckglaset på den spacer coverslips bredvid puppor. Därefter försiktigt släppa på täckglas på puppor. Säkerställa att Pupp mål öppningar täcks ordentligt med 50% glycerol för bra bildåtergivning kvalitet och för att förhindra puppor från att torka ut.
- Vik över ena änden av en bit tejp och ta det med tången (standard #5) att slutet. Placera försiktigt tejpen så att det täcker ena kanten av det övre täckglaset, den spacer coverslip(s) och den plast slide på ena sidan. Tryck inte ner bandet, ännu. Först vända bilden och upprepa för den andra sidan.
- Använd båda pekfingrar för att trycka ner bandet samtidigt på båda sidor. Detta förfarande säkerställer att puppor inte är på flykt.
- Kontrollera om puppor är väl i kontakt med täckglaset. För optimal bildåtergivning kvalitet bör puppor pressas försiktigt under täckglaset. Justera antalet spacer coverslips vid behov.
- Märk bilden genom att skriva på tejpen.
- Använd en våt pensel för att överföra upp till fem puppor till en plast slide med en groove (specialbyggda, återanvändbar, se diskussion och lista över material). Lägga till en eller två spacer coverslips varje sida beroende på djupet av spåret och tjockleken på puppor. Sätta en liten droppe vatten under varje spacer täckglas att göra det sticka i bilden och lämna lite utrymme mellan spåret och den spacer coverslips på varje sida.
3. live avbildning av puppor
- Metoden montering möjliggör avbildning av puppor både på omvänt Mikroskop (figur 1I) och upprätt Mikroskop (figur 1J). Särskilt lämplig för levande imaging skannar confocal Mikroskop, två-foton Mikroskop och snurrande skiva confocal Mikroskop oavsett om de är inverterad eller upprätt. För långsiktiga filmer, Använd en temperatur-kontrollerad fas om tillgängligt.
- Använder okulär och en UV-lampa eller överföring ljus, lokalisera en puppa och fokus inuti puppan.
- Använda kameran, hitta den önska strukturen och justera zoomningen.
- För långsiktiga filmer, definiera en z-stack som omfattar strukturen av intresse väl (till exempel indirekta flyg musklerna, deras fastsättning webbplatser, senan cellerna eller en kombination av ovannämnda) och välj ett tidsintervall. Överväga att göra genomsnitt för bättre bildkvalitet. För hög hastighet, korta filmer, välja ett enda z-plan för att uppnå en hög bildhastighet.
- Justera laser makt att ge den bästa möjlig signalen men lite mättnad. För hög lasereffekt kan dock skada puppa över tid.
- Starta tänkbar och återvända från tid till att kolla filmen och justera z-stack positionering vid behov.
Figur 1: arbetsflöde för levande avbildning av muskel-senan morfogenes i Drosophila puppor. Se protokoll för detaljer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Olika vävnader kan vara avbildad i vivo utveckla flyga puppor, vilket gör dem ett perfekt modellsystem studera morfogenes av vuxna organ. Bland dessa finns de indirekta flygmuskler, thorax epitelet inklusive senan cellerna, wing epitel, magmusklerna och hjärtat22,23,24,25,26 , 27. här fokuserar vi på levande avbildning av muskler och senor morfogenes. För en detaljerad beskrivning av indirekta flyg muskel och magmuskelstation morfogenes och ytterligare metoder för att studera muskel biologi i Drosophila, hänvisar vi läsaren till Weitkunat och Schnorrer 201422.
Live avbildning av indirekta flygmuskler
För att studera uttrycktes den långsiktiga utvecklingen av indirekta flyg musklerna bestående av dorsolongitudinal muskler (DLM) och dorsoventral musklerna (DVMs), klotformiga Moesin aktin-bindande domän taggade med GFP (UAS -GFP-Gma) i alla muskler använder myocyt enhancer faktor 2 (Mef2)-GAL4-drivrutinen (figur 2A-D, Film S1). Innan imaging öppnades ett fönster i Pupp fall över bröstkorgen som visas i figur 1F. På två-foton Mikroskop förvärvades z-stackar varje 20 min för 21 h börjar på ≈11 h efter puparium bildandet (11 h APF). Inom denna tidsram, DLM (grön överlägg i figur 2A'-D') först inleda fäster senan cellerna (figur 2A) och sedan dela medan muskel bilagor mogen (figur 2B). Nästa, förkorta myotubes (figur 2 c) tills de slutligen når maximally kompakterade scenen på 30 h APF (figur 2D). Sammantaget belyser denna film de dramatiska förändringar i muskeln morfologi som inträffar på tidsskalan för timmar.
Figur 2: Live avbildning av indirekta flyg muskler och senor morfogenes. (A-D) Blodprovstagningar från en två-photon film (Movie S1) med Mef2-GAL4, UAS- GFP-Gma som markör för aktin i indirekta flyg musklerna bestående av dorsolongitudinal muskler (DLM, markerade i grönt i A'-D') och dorsoventral muskler ( DVMs, blåmarkerad i A'-D'). Skala barer är 100 µm. (E-H) tidpunkter från en två-photon film (Movie S2) med Duf-GAL4UAS-CD8-GFP som en markör för indirekta flygmuskler och thorax epitelet inklusive senan celler. Paneler E'-H' Visa ett överlägg med en modell av muskel-senan systemet vid varje tidpunkt, belyser de länge cellulär tillägg bildas av senan epitel (magenta) i kontakt med musklerna (grön). Skala barer är 100 µm (beräknad från storleken på avbildad strukturer). (Jag-L) Tid pekar från en två-färg, snurrande skiva confocal film (Movie S3) med fokus på muskel-senan bifogad fil initiering. Senan cellerna är märkta med sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) och dorsolongitudinal indirekta flyg muskler med Mhc -Tau-GFP (grön). Skala barer är 10 µm. tid är indicerat som hh: mm efter puparium bildandet (APF). Observera att inte alla filmer har förvärvats på en temperatur-kontrollerad scenen, därför utvecklande timing kan avvika. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att studera senor och muskler morfogenes samtidigt, membran-bundna GFP (UAS -CD8-GFP) uttrycktes med hjälp av Dumbfounded (Duf)-GAL4 som förare, som uttrycks både i senan cellerna och indirekta flygmuskler (figur 2E -H, film S2). En z-stack togs på en två-foton Mikroskop varje 20 min börjar på 16 h APF för 20 h. Medan myotubes kompakt (gröna överlägg i figur 2E'-H'), senan cells form länge cellulär tillägg som elongate med tiden (magenta överlägg i figur 2E'-H'). Sammantaget belyser denna film det nära samspelet mellan det sena och muskel cellerna i vivo.
För att undersöka muskler-senan interaktion i mer detalj, utfördes två färger, hög förstoring bildhantering. Puppor med myosin heavy chain (Mhc)-Tau-GFP i DLM och UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -palm-mCherry) drivs av rand (sr)-GAL4 i senor var avbildade var 5 minut börjar på 12 h APF för 4,5 h på en snurrande skiva Confocal Mikroskop (figur 2I-L, film S3). Vid 12 h APF migrera myotubes mot deras senan målceller och bildar långa filopodia på deras tips (figur 2I). Därefter, senor och muskler vävnader interdigitate (figur 2J, K) att bilda en stabil fastsättning. Som den bifogade filen mognar, jämnar färre filopodia form och gränssnittet muskel-senan (figur 2 L). Två färger, hög förstoring bildhantering kan således användas att avslöja cellulära dynamics i detalj i den levande organismen.
Live avbildning av magmusklerna
För levande avbildning av magmusklerna (figur 3film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP användes som markör och ett fönster öppnades över buken i Pupp fall som beskrivs i figur 1 g. Liknande indirekta flyg muskel filmen representerade i figur 2A-D, bildning och tillväxt av magmusklerna kan följas över många timmar av utveckling (55 h i filmen S4). Under denna tid säkring myoblasts till formuläret växande myotubes (figur 3A). Myotube tips migrera till sina senan mål och efter fästa till senan celler, de kontraktila enheterna i musklerna, sarkomerer, bildas (figur 3B-D).
Figur 3: Live avbildning av bukmuskeln morfogenes. (A-D) Blodprovstagningar från en film (Movie S4) med Mef2-GAL4UAS-CD8-GFP som en markör att följa magmuskelstation morfogenes. Paneler A'-E' Visa överlägg med modeller av ett magmuskelstation set (grön) som bildar de novo under Pupp scenen. Skala barer är 100 µm. tid är indicerat som hh: mm APF. Filmen förvärvades vid rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Live imaging av ryckningar muskler
Till skillnad från figur 2 och figur 3, figur 4 visar muskel dynamics som inträffar på tidsskala sekunder: liveinspelning av muskelsammandragningar. Puppor som uttrycker βPS-Integrin-GFP under endogen kontroll var avbildas med en tidsupplösning på 0,65 s i ett enda z-plan på en confocal Mikroskop (Film S5). I exempel visas i figur 4var fastsättning platserna för tre DVMs (figur 4A) avbildade i 10 min börjar på 42 h APF. Under denna tid, fem twitch händelser observerades (figur 4B-F), visar att sarkomerer monteras redan tillräckligt väl för att stödja samordnade sammandragningar vid denna tidpunkt i utveckling. Därav, avbildning av muskelryckningar kan användas som en funktionell avläsningssystem för sarcomerogenesis redan under indirekta flyg muskel utveckling28, i motsats till till exempel flygprov, som kan endast utföras efter eclosion.
Figur 4: Live avbildning av ryckningar muskler. (A) första tid-punkt från en film (Movie S5) visar ryckningar i dorsoventral indirekta flygmuskler på 42 h APF använder βPS-Integrin-GFP som en markör. I synfältet är muskeln fastsättning platser DVM II 2, DVM III 1 och DVM III 2. (B-F) Färg överlägg av fem enskilda twitch händelser, var och en visar ramen innan twitch (magenta) och den första bildrutan i händelsen twitch (grön). Observera att enskilda muskelfibrerna rycka självständigt från varandra. Pilar markerar den twitching rörelsen. Tidsupplösningen på filmen är 0,65 s. skala barer är 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Live imaging av endogent märkta proteiner
Liknar βPS-Integrin-GFP, en stor samling av fusionsproteinerna uttryckt i Drosophila under endogen kontroll har varit genererade2,3,4. Dessa linor kan användas för att studera till exempel subcellulär lokalisering eller uttrycket profiler av proteiner av intresse. Samlingen är särskilt användbart om specifika antikroppar är inte tillgängliga eller protein dynamics måste vara undersökta i vivo utan fixering. Figur 5 visar tre exempel på endogent uttryckt fusionsproteinerna från flyga TransgeneOme (fTRG) biblioteket, Hu li tai shao (Hts)-GFP (figur 5A, B), Talin-GFP (figur 5 c, D) och βTubulin60D-GFP ( Figur 5E, F). Uttrycket av dessa proteiner kan studeras i alla vävnader som uttrycker dem naturligt. Här visar vi thorax epitel (figur 5AC, E) och indirekta flyg musklerna eller deras fastsättning webbplatser (figur 5BD, F) som exempel.
Figur 5: Live avbildning av endogent taggade proteiner. (A, B) Maximala projektioner av z-stackar av puppor uttrycker Hts-GFP. (C, D) Maximala projektioner av z-stackar av puppor uttrycker Talin-GFP. (E, F) Maximala projektioner av z-stackar av puppor uttrycker βTubulin60D-GFP. Paneler A, C och E Visa thorax epitelet vid 18, 24 och 18 h APF, respektive och paneler B, D och F Visa indirekta flyg musklerna eller deras fastsättning webbplatser på 30 h APF. Skala barer är 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Presenterade protokollet beskriver hur du bild muskel-senan morfogenes i levande Drosophila puppor med hjälp av olika fluorescently märkta proteiner. Här i vivo imaging strategi kan användas för att studera utvecklingsprocesser i deras naturliga miljö i hela organismen.
Det är avgörande för ett lyckat experiment att hitta rätt utvecklande tidpunkten att analysera. Exempelvis initiera dorsolongitudinal indirekta flygmuskler fäster senan målen på ≈16 h APF23 medan magmusklerna utvecklas senare och bifoga i båda ändarna bara mellan 30 och 40 h APF26. Följaktligen, tidigare publicerad litteratur bör användas för att hitta rätt tidpunkter för att analysera eller, om den vävnad eller struktur av intresse inte har studerats i detalj innan, den övergripande utvecklingen har att präglas först.
För montering puppor framgångsrikt på de specialbyggda plast diabilder, är det viktigt att spåren har lämpliga dimensioner: behovet av spåren att vara 1,0-1,5 mm breda och 0,3 - 0,4 mm djup. Detta djup kan justera det exakta avståndet till det översta täckglaset med spacer coverslips som behövs. Minst en spacer täckglas bör dock användas för att undvika tömning 50% glycerol från provet genom kapillärkrafter. Den korrekta positioneringen av the puppor i spåret kräver vissa erfarenhet och bör optimeras så att strukturen av intresse är så nära som möjligt till täckglaset.
Om ett stort antal puppor är tänkt för att avbildas i en Mikroskop session, kan de alla monteras i förväg och sedan lagras i kuvös tills imaging för att säkerställa rätt utvecklingsmässiga timing. Puppor bör överleva hela förfarandet och även åtminstone försöka eclose om höll på bilden efter imaging. Överlevnaden kan användas som en avläsning för att kontrollera huruvida villkor som tänkbar skada puppor.
Imaging inställningarna bör väljas med omsorg enligt de experimentella krav. För korta filmer behöver en hög bildhastighet kontra en hög signal-brus-förhållande balanseras, medan relativt hög lasereffekt kan användas utan att skada puppor för mycket. Dock för långsiktiga filmer, laser makt måste hållas på en måttlig nivå och puppor bör inte avbildas kontinuerligt utan snarare vid vissa tidpunkter, till exempel varje 20 min. För att säkerställa att strukturera av intresse inte rör sig ur synfältet, kan det vara nödvändigt att justera placeringen av z-stacken mellan tidpunkter. Vår kunskap påverkar öppnandet av Pupp fallet i sig inte fosterskadande timing. En temperatur-kontrollerad fas bör dock användas för långsiktig filmer för att säkerställa rätt utvecklingsmässiga timing. Med dessa överväganden i åtanke, kan mycket informativa filmer förvärvas.
Presenterade protokollet kan användas för att visualisera inte bara muskel-senan morfogenes utan också andra utveckla vävnader, till exempel den vinge epitel29. Endast tre ändringar i detta protokoll krävs: (1) öppnande av Pupp höljet ovanför vingen i stället för i bröstkorgen eller buken, (2) positionering av puppor med vingen mot det översta täckglaset och (3) användningen av olika fluorescerande markör proteiner. Med befordran av CRISPR/Cas9-teknik blir mer endogent märkta fluorescerande proteiner tillgängliga, eftersom det har blivit enklare att rikta endogena loci i Drosophila30,31 , 32. i framtiden, detta gör att belysa dynamiken i många proteiner, celler och hela vävnader i deras fysiologiska miljö i detalj.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Manuela Weitkunat för förvärvet av filmen S3. Vi är tacksamma att Reinhard Fässler för generösa stöd. Detta arbete fick stöd av den EMBO Young Investigator Program (F.S.), Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), i Max Planck-sällskapet (S.B.L., F.S.), den Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), excellence initiativ Aix-Marseille universitet AMIDEX (F.S.), den LabEX-informera (F.S.) och Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | - | - | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | - | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
- Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
- Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
- Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), Cambridge, England. 3333-3341 (1997).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
- Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
- Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
- Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
- Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
- Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
- Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
- Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
- Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
- Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), Cambridge, England. 621-626 (2008).
- Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
- Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), Cambridge, England. 1261-1272 (2017).
- Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
- Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
- Classen, A. -K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), Bethesda. 2409-2418 (2014).
- Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
