Vi præsenterer her, en nem at bruge og alsidig metode for at udføre live imaging af udviklingsmæssige processer i almindelighed og muskel-sene morfogenese navnlig i levende Drosophila pupper.
Muskler sener og skelettet aktiverer dyr, herunder mennesker til at flytte deres kropsdele. Muskel morfogenese er meget bevaret fra dyr til mennesker. Derfor, den kraftfulde Drosophila modelsystem kan bruges til at studere begreberne muskel-sene udvikling, der kan også anvendes til menneskelige muskelbiologi. Her, beskriver vi i detaljer, hvordan morfogenese af voksen muskel-sene system kan være let afbildet i levende, udvikle Drosophila pupper. Derfor, metoden giver mulighed for at undersøge proteiner, celler og væv i deres fysiologiske miljø. Ud over en trinvis protokol med nyttige tips giver vi et samlet overblik over fluorescently tagged markør proteiner, der er egnet til at studere muskel-sene system. For at fremhæve de alsidige programmer i protokollen, vise vi eksempel film lige fra visualisering af langsigtede morfogenetiske begivenheder – forekommer på tidsskalaen i timer og dage-til visualisering af kortsigtede dynamiske processer som muskeltrækninger forekommer på tidsskala i sekunder. Tilsammen, bør denne protokol aktiverer læseren til at designe og udføre live imaging forsøg til undersøgelse af muskel-sene morfogenese i den intakte organisme.
Apparatet muskel-sene tillader dyr, herunder mennesker til at flytte deres kropsdele. De molekylære byggesten af muskel-sene system er meget bevaret. Derfor kan begreber af muskel-sene udvikling relevante for menneskelig muskelbiologi, f.eks muskel morfogenese, muskel-sene vedhæftet fil og myofibril selvorganisering, studeres ved hjælp af Drosophila melanogaster som et let tilgængeligt modelsystem. Drosophila puppe systemet har flere eksperimentelle fordele. Først, på den puppe stadie – når de voksne muskler er dannet-organismen er siddende og derfor let at billede på et mikroskop i løbet af timer eller endda dage. For det andet, mange muskler form tæt nok nedenunder den puppe overflade, således at de kan være afbildet inde den intakte, delvist gennemsigtig organisme. For det tredje kan musklerne undersøges i deres naturlige miljø, hvor de er forbundet til det danner exoskeleton via senen celler og væv spændinger er bygget. Det er ikke muligt i musklen celle kultur systemer. Og endelig, et væld af genetiske værktøjer er tilgængelige i Drosophila. Blandt disse er mange fluorescently tagged markører, der giver mulighed for mærkning af specifikke celletyper eller subcellulært strukturer for imaging i vivo.
Tabel 1 sammenfatter de vigtigste markører, der anvendes til at studere muskel-sene morfogenese. Det omfatter markører overexpressed ved hjælp af GAL4-UAS-system1 og endogent mærkede protein markører2,3,4. Fordelen ved GAL4-UAS-system er, at markører er generelt udtrykt på et højt niveau, hvilket resulterer i et stærkt signal, der kan nemt være afbildet i hele-mount pupper. Derudover kan væv specificitet opnås ved at vælge GAL4 drivere omhyggeligt. Fordelen ved fusion proteiner udtrykt under endogen kontrol er at dynamikken i de respektive proteiner kan være studerede i vivo, mens de kan også bruges som markører for forskellige celletyper eller specifikke subcellulært strukturer, for eksempel, ΒPS-Integrin-NGL for muskel vedhæftet fil sites. Sammen, giver disse markører høj fleksibilitet i eksperimentelle design og valg af forskning problemer, der kan løses nu og i fremtiden.
Mærket struktur | Markør | Udtryk og lokalisering | Klasse | Stock antallet | Kommentar | Ref. | ||||||
Muskel | Mef2-GAL4 | alle myoblasts og alle muskler i alle faser | GAL4 linje | BL 27390 | 5 | |||||||
1151-GAL4 | voksen muskel prækursorer og tidlig myotubes indtil ≈24 h APF | GAL4 linje, enhancer trap | – | 6 | ||||||||
Act79B-GAL4 | hoppe muskel ved differentiering | GAL4 linje | – | 7 | ||||||||
Act88F-GAL4 | indirekte flyvning muskler begynder ≈14 h APF | GAL4 linje | – | 7 | ||||||||
Act88F– Cameleon 3.1 | indirekte flyvning muskler begynder ≈14 h APF | Act88F forstærker / promotor kørsel Cameleon 3.1 | – | Ca2 + indikator | 8 | |||||||
Act88F-normal god landbrugspraksis | indirekte flyvning muskler begynder ≈14 h APF | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG78 og fTRG10028 | 4 | ||||||||
Ham– nls-NGL | voksen muskel prækursorer, nukleare, indtil ≈24 h APF i indirekte flyvning muskler | forstærker/promotor med nls-normal god landbrugspraksis reporter | – | 1,5 kb enhancer fragment | 9 | |||||||
MHC-Tau-normal god landbrugspraksis | Mikrotubuli i DLM skabeloner og differentiere muskler | forstærker/promotor med Tau-normal god landbrugspraksis reporter | BL 53739 | 10 | ||||||||
ΒTub60D-normal god landbrugspraksis | Mikrotubuli i myotubes (f.eks. i indirekte flyvning muskler fra ≈14 h AFP, stærkt faldende efter ≈48 h APF) | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG958 | 4 | ||||||||
MHC-normal god landbrugspraksis (weeP26) | sarcomeres (tyk glødetråd) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flyvning muskler med udgangspunkt i ≈30 h APF) | Normal god landbrugspraksis-fælde | – | Brug heterozygous, etiketter en isoform delmængde | 11 | |||||||
SLS-normal god landbrugspraksis | sarcomeres (Z-disc) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flyvning muskler med udgangspunkt i ≈30 h APF) | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | – | G53, brug heterozygous | 2 | |||||||
Zasp66-normal god landbrugspraksis | Z-disc i alle kroppens muskler | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
Zasp52-normal god landbrugspraksis | Z-disc i alle kroppens muskler | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
HTS-normal god landbrugspraksis | aktin bindende; udtrykt i epitel, myoblasts og myotubes | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG585 | 4 | ||||||||
Dlg1-normal god landbrugspraksis | epitelcelle vejkryds, myoblasts og membraner i musklerne i alle faser | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG502 | 4 | ||||||||
Muskel vedhæftet fil site | ΒPS-Integrin-normal god landbrugspraksis | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-knock-i | – | 13 | |||||||
Kamilla-normal god landbrugspraksis og -mCherry | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fælde (efterligner linje) | – | 3 | ||||||||
Kamilla-normal god landbrugspraksis | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fusion (fluelinen TransgeneOme) | fTRG587 | 4 | ||||||||
Ilk-normal god landbrugspraksis | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fælde (FlyTrap linje) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
VinC-normal god landbrugspraksis og -RFP | muskel vedhæftet fil sites (f.eks. Start ≈18 h AFP i indirekte flyvning muskler) | Normal god landbrugspraksis-fusion (transgen) | – | 13 | ||||||||
Senen | SR-GAL4 | thorax senen celler, i hele puppe stadie | GAL4 linje, enhancer trap | BL 26663 | homozygot dødbringende | 14 | ||||||
Muskler og sener | DUF-GAL4 | muskler og epitheler, tidlig debut | GAL4 linje | BL 66682 | kirre-rP298, grundlægger celle markør | 15 | ||||||
UAS-reportere | UAS– normal god landbrugspraksis-Gma | aktin bindende | UAS linje | BL 31776 | aktin bindende domæne af Moesin sammenvoksede til normal god landbrugspraksis | 16 | ||||||
UAS– mCherry-Gma | aktin bindende | UAS linje | – | GMA sammenvokset til mCherry | 17 | |||||||
UAS- Lifeact-normal god landbrugspraksis | aktin bindende | UAS linje | BL 35544 | 18 | ||||||||
UAS– Lifeact-Ruby | aktin bindende | UAS linje | BL 35545 | 18 | ||||||||
UAS-CD8-normal god landbrugspraksis | membran bindende | UAS linje | forskellige lagre, f.eks.: BL 32184 | 19 | ||||||||
UAS-CD8-mCherry | membran bindende | UAS linje | BL 27391 og 27392 | 20 | ||||||||
UAS-palm-mCherry | membran bindende gennem palmitoylation | UAS linje | BL 34514 | UAS– brainbow | 21 |
Tabel 1: Fluorescently tagged protein markører egner sig til at studere muskel-sene morfogenese i vivo.
Her, vi beskriver i detaljer hvordan billeddannelse af muskel-sene morfogenese i levende pupper kan udføres nemt og korrekt (figur 1). Alternativt kan der fastsættes pupper, dissekeret og immunostained, som tillader brug af antistoffer også mærke proteiner som ikke live markører er tilgængelige22. I dette tilfælde er den billeddiagnostiske kvalitet generelt højere, fordi der er ingen bevægelse og struktur af interesse kan placeres i umiddelbar nærhed af coverslip. Dog dissektion og fiksering kan føre til skader og molekylære eller væv dynamics, f.eks muskel trækninger, kan kun undersøges i den levende organisme.
Den præsenterede protokol beskriver, hvordan du billede muskel-sene morfogenese i levende Drosophila pupper ved hjælp af en bred vifte af fluorescently mærket proteiner. Denne i vivo billeddannelse strategi kan bruges til at studere udviklingsprocesser i deres naturlige miljø i hele organismen.
Det er afgørende for en vellykket eksperiment for at finde den korrekte udviklingsmæssige tidspunkt til at analysere. For eksempel, indlede dorsolongitudinal indirekte flyvning muskler tilknytning til deres sene mål på ≈16 h APF23 mens mavemusklerne udvikle senere og vedhæfte på begge ender kun mellem 30 og 40 h APF26. Derfor, tidligere publicerede litteratur skal bruges til at finde de rigtige tidspunkt punkter i udvikling til at analysere, eller hvis væv eller struktur af interesse ikke er blevet undersøgt i detaljer før, den overordnede udvikling må karakteriseres først.
For montering pupper med succes på de specialbyggede plast dias, er det vigtigt, at rillerne har passende dimensioner: riller skal være 1,0-1,5 mm brede og 0,3 – 0,4 mm dyb. Denne dybde giver mulighed for justering af den præcise afstand til den øverste coverslip med spacer coverslips efter behov. Dog bør mindst én spacer coverslip anvendes til at undgå dræning 50% glycerol fra prøven af kapillære kræfter. Den korrekte placering af pupper i rillen kræver nogle erfaring og bør optimeres således, at strukturen af interesse er så tæt som muligt på coverslip.
Hvis et stort antal pupper formodes at være afbildet i et mikroskop session, kan de alle monteres på forhånd og derefter opbevares i en inkubator indtil imaging for at sikre ordentlig udviklingsmæssig timing. Pupper skal overleve hele proceduren og også i det mindste forsøge at velsmagende hvis holdt på diaset efter billeddannelse. Overlevelsesraten kan bruges som en udlæsning til at kontrollere, om de billeddiagnostiske betingelser skade pupper.
De billeddiagnostiske indstillingerne skal vælges omhyggeligt ifølge de eksperimentelle krav. For kortsigtede film skal en høj billedhastighed versus en høj signal-støj-forholdet være afbalanceret, mens relativt høje laser power kan bruges uden at beskadige pupper for meget. Men for langsigtet film, laser power har at blive holdt på en moderat niveau og pupper bør ikke være afbildet løbende men snarere på visse tidspunkter, for eksempel hvert 20 min. For at sikre, at strukturen af interesse ikke bevæger sig ud af synsfeltet, kan det være nødvendigt at justere placeringen af z-stakken mellem tidspunkter. Til vores viden påvirker åbningen af puppe sagen i sig selv ikke udviklingsmæssige timing. Dog bør en temperatur-kontrollerede fase anvendes til langsigtet film for at sikre ordentlig udviklingsmæssig timing. Holde disse overvejelser i tankerne, kan meget informativ film erhverves.
Den præsenterede protokol kan bruges til at visualisere ikke kun muskel-sene morfogenese, men også andre udviklingslande væv, for eksempel, fløj epitel29. Kun tre ændringer til denne protokol er påkrævet: (1) åbning af puppe tilfældet ovenfor wing i stedet for thorax eller maven, (2) positionering af pupper med fløj over for den øverste coverslip og (3) anvendelsen af forskellige fluorescerende markør proteiner. Med fremme af CRISPR/Cas9-teknologi, vil mere endogent mærket fluorescerende proteiner være tilgængelige, fordi det er blevet mere ligetil at målrette endogene loci i Drosophila30,31 , 32. i fremtiden, vil dette give mulighed for belyse dynamikken i mange proteiner, celler og hele væv i deres fysiologiske miljø i detaljer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Manuela Weitkunat for erhvervelse af filmen S3. Vi er taknemmelige for Reinhard Fässler gavmilde støtte. Dette arbejde blev støttet af EMBO Young Investigator Program (F.S.), det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), Max Planck Society (S.B.L., F.S.), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), excellence initiativ Aix-Marseille Universitet AMIDEX (F.S.), LabEX-INFORM (F.S.) og Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
fly food in bottles (or vials) | – | – | standard culture medium |
paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | – | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |