यहां, हम एक आसान उपयोग करने के लिए और बहुमुखी विधि सामांय और मांसपेशी में विकासात्मक प्रक्रियाओं की लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए वर्तमान में विशेष रूप से रहने वाले Drosophila कोषस्थों में पट्टा morphogenesis ।
tendons और कंकाल के साथ एक साथ मांसपेशियों को अपने शरीर के अंगों को स्थानांतरित करने के लिए मनुष्यों सहित जानवरों को सक्षम । मांसपेशी morphogenesis अत्यधिक मनुष्यों के लिए पशुओं से संरक्षित है । इसलिए, शक्तिशाली Drosophila मॉडल प्रणाली मांसपेशियों की अवधारणाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-पट्टा विकास भी मानव मांसपेशी जीव विज्ञान के लिए लागू किया जा सकता है । यहां, हम विस्तार से वर्णन कैसे वयस्क मांसपेशी की morphogenesis-पट्टा प्रणाली को आसानी से रहने में छवि हो सकती है, Drosophila कोषस्थों विकासशील । इसलिए, विधि प्रोटीन, कोशिकाओं और उनके शारीरिक वातावरण में ऊतकों की जांच की अनुमति देता है । उपयोगी सुझावों के साथ एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल के अलावा, हम फ्लोरोसेंट टैग मार्कर प्रोटीन कि मांसपेशी पट्टा प्रणाली का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल के बहुमुखी अनुप्रयोगों को हाइलाइट करने के लिए, हम उदाहरण के लंबे समय तक morphogenetic घटनाओं के दृश्य से लेकर फिल्मों शो-घंटे और दिनों के समय पैमाने पर होने वाली-अल्पकालिक मांसपेशियों की तरह गतिशील प्रक्रियाओं के दृश्य को हिल सेकंड के समय स्केल पर होने वाली है । एक साथ ले लिया, इस प्रोटोकॉल पाठक डिजाइन करने के लिए सक्षम होना चाहिए और मांसपेशी की जांच के लिए लाइव इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन-बरकरार जीव में पट्टा morphogenesis ।
मांसपेशी पट्टा तंत्र मनुष्यों सहित जानवरों को उनके शरीर के अंगों को स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है । मांसपेशियों की आणविक इमारत ब्लॉकों-पट्टा प्रणाली अत्यधिक संरक्षण कर रहे हैं । इसलिए, मांसपेशी की अवधारणाओं-पट्टा मानव मांसपेशी जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक, उदाहरण के लिए मांसपेशी morphogenesis, मांसपेशी पट्टा लगाव और myofibril स्वयं संगठन, एक आसानी से सुलभ के रूप में Drosophila melanogaster का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता मॉडल प्रणाली । Drosophila ुपाल प्रणाली कई प्रयोगात्मक लाभ है । सबसे पहले, ुपाल चरण में-जब वयस्क मांसपेशियों का गठन कर रहे है-जीव डंठल है और इसलिए आसान घंटे या भी दिनों की अवधि में एक खुर्दबीन पर छवि के लिए । दूसरा, कई मांसपेशियों के रूप में पर्याप्त ुपाल सतह के नीचे इतना है कि वे बरकरार, आंशिक रूप से पारदर्शी जीव के अंदर छवि हो सकता है बंद । तीसरा, मांसपेशियों को अपने प्राकृतिक वातावरण में जांच की जा सकती है, जहां वे पट्टा कोशिकाओं और ऊतक तनाव के द्वारा गठन exoskeleton से जुड़े रहे है बनाया है । यह मांसपेशी कोशिका संस्कृति प्रणालियों में संभव नहीं है । और अंत में, आनुवंशिक उपकरण के ढेर सारे Drosophilaमें उपलब्ध है । इनमें से कई फ्लोरोसेंट मार्करों कि विशिष्ट कोशिका प्रकार या vivo मेंइमेजिंग के लिए उपसेलुलर संरचनाओं के लेबल की अनुमति है टैग कर रहे हैं ।
तालिका 1 मांसपेशी-पट्टा morphogenesis का अध्ययन करने के लिए प्रयुक्त सबसे महत्वपूर्ण मार्कर को संक्षिप्त करता है । यह GAL4-यूएएस-प्रणाली1 और endogenously टैग प्रोटीन मार्करों2,3,4का उपयोग कर व्यक्त मार्करों शामिल हैं । GAL4-यूएएस-प्रणाली का लाभ यह है कि मार्करों आम तौर पर उच्च स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं, एक मजबूत संकेत है कि आसानी से पूरे माउंट कोषस्थों में imaged किया जा सकता में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, ऊतक विशिष्टता GAL4 ड्राइवरों को ध्यान से चुनने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । अंतर्जात नियंत्रण के तहत व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन का लाभ यह है कि संबंधित प्रोटीन की गतिशीलता vivo मेंअध्ययन किया जा सकता है, जबकि वे भी विभिन्न सेल प्रकार या विशिष्ट उपसेलुलर संरचनाओं के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता, उदाहरण के लिए, βPS-Integrin-मांसपेशी लगाव साइटों के लिए GFP । साथ में, इन मार्करों प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुसंधान समस्याओं है कि अब और भविष्य में हल किया जा सकता है की पसंद में उच्च लचीलापन प्रदान करते हैं ।
लेबल संरचना | मार्कर | अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण | वर्ग | स्टॉक नंबर | टिप्पणी | रेफरी. | ||||||
मांसपेशियों | Mef2-GAL4 | सभी myoblasts और सभी चरणों में सभी मांसपेशियों | GAL4 लाइन | बीएल २७३९० | 5 | |||||||
११५१-GAL4 | वयस्क बलवान पुरोगामी र पौ myotubes नभए ≈ २४ ज APF | GAL4 लाइन, बढ़ाने वाला जाल | – | 6 | ||||||||
Act79B-GAL4 | भेदभाव पर कूदो स्नायु | GAL4 लाइन | – | 7 | ||||||||
Act88F-GAL4 | अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों ≈ 14 ज APF शुरू | GAL4 लाइन | – | 7 | ||||||||
Act88F-Cameleon ३.१ | अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों ≈ 14 ज APF शुरू | Act88F बढ़ाने/प्रमोटर ड्राइविंग Cameleon ३.१ | – | Ca2 + संकेतक | 8 | |||||||
Act88F-GFP | अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों ≈ 14 ज APF शुरू | GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) | fTRG78 और fTRG10028 | 4 | ||||||||
उसे-एनएलएस-GFP | वयस्क मांसपेशी पुरोगामी, परमाणु, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 24 ज APF तक | एनएलएस-GFP रिपोर्टर के साथ बढ़ाने/ | – | १.५ kb बढ़ाने टुकड़ा | 9 | |||||||
Mhc-तौ-GFP | DLM टेम्पलेट्स में microtubules और मांसपेशियों में अंतर | बढ़ाने/ताऊ-GFP रिपोर्टर के साथ प्रमोटर/ | बीएल ५३७३९ | 10 | ||||||||
βTub60D-GFP | microtubules में myotubes (उदाहरण के लिए ≈ 14 एच एएफपी से अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में, दृढ़ता ≈ ४८ ज APF के बाद कम) | GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) | fTRG958 | 4 | ||||||||
Mhc-GFP (weeP26) | सभी शरीर की मांसपेशियों में sarcomeres (मोटी रेशा) (जैसे अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 30 ज APF से शुरू) | GFP-जाल | – | heterozygous का उपयोग करें, एक isoform सबसेट लेबल | 11 | |||||||
Sls-GFP | sarcomeres (Z-डिस्क) सभी शरीर की मांसपेशियों में (जैसे अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 30 ज APF से शुरू) | GFP-जाल (मक्खियों line) | – | G53, उपयोग heterozygous | 2 | |||||||
Zasp66-GFP | जेड-डिस्क शरीर की सभी मांसपेशियों में | GFP-जाल (मक्खियों line) | बीएल ६८२४ | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
Zasp52-GFP | जेड-डिस्क शरीर की सभी मांसपेशियों में | GFP-जाल (मक्खियों line) | बीएल ६८३८ | G00189 | 2 , 12 | |||||||
Hts-GFP | actin बंधनकारक; उपकला, myoblasts और myotubes में व्यक्त | GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) | fTRG585 | 4 | ||||||||
Dlg1-GFP | सभी चरणों में मांसपेशियों में उपकला कोशिका जंक्शनों, myoblasts और झिल्ली | GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) | fTRG502 | 4 | ||||||||
स्नायु लगाव साइट | βPS-Integrin-GFP | मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) | GFP-नॉक-इन | – | 13 | |||||||
टलीं-GFP और-mCherry | मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) | GFP-ट्रैप (लाइन नकल) | – | 3 | ||||||||
टलीं-GFP | मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) | GFP-फ्यूजन (फ्लाई TransgeneOme लाइन) | fTRG587 | 4 | ||||||||
जैसे-GFP | मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) | GFP-जाल (मक्खियों line) | क्योटो ११०९५१ (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
Vinc-GFP और-आरएफपी | मांसपेशी लगाव साइटें (जैसे, अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों में ≈ 18 एच एएफपी शुरू) | GFP-फ्यूजन (transgene) | – | 13 | ||||||||
कण्डरा | sr-GAL4 | छाती पट्टा कोशिकाओं, ुपाल चरण भर में | GAL4 लाइन, बढ़ाने वाला जाल | बीएल २६६६३ | homozygous घातक | 14 | ||||||
मांसपेशियों और पट्टा | Duf-GAL4 | मांसपेशियों और epithelia, जल्दी शुरुआत | GAL4 लाइन | बीएल ६६६८२ | kirre-rP298, संस्थापक सेल मार्कर | 15 | ||||||
यूएएस-पत्रकारों | यूएएस-GFP-Gma | actin बंधनकारक | यूएएस लाइन | बीएल ३१७७६ | GFP से जुड़े Moesin के actin बाइंडिंग डोमेन | 16 | ||||||
यूएएस-mCherry-Gma | actin बंधनकारक | यूएएस लाइन | – | Gma से जुड़े mCherry | 17 | |||||||
यूएएस- Lifeact-GFP | actin बंधनकारक | यूएएस लाइन | बीएल ३५५४४ | 18 | ||||||||
यूएएस-Lifeact-माणिक | actin बंधनकारक | यूएएस लाइन | बीएल ३५५४५ | 18 | ||||||||
यूएएस-सीडी-GFP | झिल्ली बाइंडिंग | यूएएस लाइन | विभिंन शेयरों, उदा: बीएल ३२१८४ | 19 | ||||||||
यूएएस-सीडी-mCherry | झिल्ली बाइंडिंग | यूएएस लाइन | बीएल २७३९१ और २७३९२ | 20 | ||||||||
यूएएस-खजूर-mCherry | palmitoylation के माध्यम से झिल्ली बाइंडिंग | यूएएस लाइन | बीएल ३४५१४ | यूएएस-brainbow | 21 |
तालिका 1: फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्करों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मांसपेशी-पट्टा morphogenesis vivo मेंटैग की गईं ।
यहां, हम विस्तार से वर्णन कैसे मांसपेशी की इमेजिंग-कोषस्थों रहने में पट्टा morphogenesis आसानी से किया जा सकता है और सफलतापूर्वक (चित्रा 1) । वैकल्पिक रूप से, कोषस्थों तय किया जा सकता है, विच्छेदित और immunostained, जो एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए भी प्रोटीन लेबल जिसके लिए कोई जीवित मार्करों उपलब्ध है22की अनुमति देता है । इस मामले में, इमेजिंग गुणवत्ता आम तौर पर अधिक है क्योंकि वहां कोई आंदोलन है और ब्याज की संरचना coverslip के करीब निकटता में रखा जा सकता है । हालांकि, विच्छेदन और निर्धारण नुकसान और आणविक या ऊतक गतिशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, मांसपेशी हिल, केवल जीवित जीव में अध्ययन किया जा सकता है ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे छवि मांसपेशी को-पट्टा morphogenesis में रहने वाले Drosophila कोषस्थों के एक किस्म का उपयोग कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग । vivo इमेजिंग रणनीति में यह संपूर्ण जीव के अपने प्राकृतिक वातावरण में विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
यह एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है सही विकास के समय बिंदु को खोजने के लिए विश्लेषण । उदाहरण के लिए, dorsolongitudinal अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों को ≈ 16 एच APF23 पर अपने पट्टा लक्ष्यों को लगाव शुरू जबकि पेट की मांसपेशियों को बाद में विकसित करने और दोनों सिरों पर संलग्न केवल 30 और ४० एच APF26के बीच । इसके फलस्वरूप पूर्व में प्रकाशित साहित्य को विकास के सही समय बिंदुओं का विश्लेषण करने के लिए खोजना चाहिए या, यदि उसके पहले के ऊतक या संरचना का विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया है, तो समग्र विकास के लिए पहले विशेषता की जानी चाहिए.
कस्टम-निर्मित प्लास्टिक स्लाइड पर सफलतापूर्वक बढ़ते कोषस्थों के लिए, यह खांचे उपयुक्त आयाम है कि महत्वपूर्ण है: खांचे १.०-१.५ मिमी चौड़ा और ०.३-०.४ मिमी गहरी होने की जरूरत है । इस गहराई की जरूरत के रूप में स्पेसर coverslips के साथ शीर्ष coverslip के लिए सटीक दूरी का समायोजन करने की अनुमति देता है । हालांकि, कम से कम एक स्पेसर coverslip केशिका बलों द्वारा नमूने से दूर ग्लिसरॉल ५०% draining से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । नाली में कोषस्थों की सही स्थिति कुछ अनुभव की आवश्यकता है और इस तरह है कि ब्याज की संरचना के रूप में coverslip के लिए संभव के रूप में बंद है अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
यदि कोषस्थों की एक बड़ी संख्या में एक खुर्दबीन सत्र में imaged होना चाहिए, वे सब पहले से बढ़ सकता है और फिर एक मशीन में संग्रहित इमेजिंग तक उचित विकासात्मक समय सुनिश्चित करने के लिए । कोषस्थों पूरी प्रक्रिया जीवित रहना चाहिए और भी कम से eclose करने की कोशिश अगर इमेजिंग के बाद स्लाइड पर रखा । जीवित रहने की दर की जांच करने के लिए एक readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इमेजिंग शर्तों कोषस्थों नुकसान ।
इमेजिंग सेटिंग्स को प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुसार सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए । अल्पकालिक फिल्मों के लिए, एक उच्च संकेत बनाम शोर अनुपात एक उच्च फ्रेम दर को संतुलित करने की जरूरत है, जबकि अपेक्षाकृत उच्च लेजर शक्ति कोषस्थों बहुत ज्यादा नुकसान पहुंचाए बिना इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, लंबी अवधि की फिल्मों के लिए, लेजर शक्ति को एक मध्यम स्तर पर रखा जाना है और कोषस्थों लगातार नहीं बल्कि निश्चित समय बिंदुओं पर, उदाहरण के लिए, हर 20 मिनट में imaged किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए कि रुचि की संरचना दृश्य के फ़ील्ड से बाहर नहीं जाती है, यह समय बिंदुओं के बीच z-स्टैक की स्थिति को पुनः समायोजन करने के लिए आवश्यक हो सकती है. हमारे ज्ञान के लिए, प्रति ुपाल मामले के उद्घाटन से विकास के समय को प्रभावित नहीं करता है । हालांकि, एक तापमान नियंत्रित चरण लंबी अवधि फिल्मों के लिए उचित विकासात्मक समय सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इन विचारों को ध्यान में रखते हुए, अत्यधिक जानकारीपूर्ण फिल्मों का अधिग्रहण किया जा सकता है ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल न केवल मांसपेशी-पट्टा morphogenesis लेकिन यह भी अंय विकासशील ऊतकों, उदाहरण के लिए, विंग29उपकला की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के लिए केवल तीन संशोधनों की आवश्यकता है: (1) छाती या पेट के बजाय विंग के ऊपर ुपाल मामले के खोलने, (2) शीर्ष coverslip की ओर विंग के साथ कोषस्थों की स्थिति, और (3) अलग फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन का उपयोग करें । CRISPR/Cas9-प्रौद्योगिकी की उंनति के साथ, अधिक से अधिक endogenously टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन उपलब्ध हो जाएगा, क्योंकि यह और अधिक सीधा हो गया है लक्ष्य अंतर्जात loci में Drosophila30,31 , ३२. भविष्य में, यह elucidating कई प्रोटीन की गतिशीलता की अनुमति होगी, कोशिकाओं और उनके शारीरिक वातावरण में पूरे ऊतकों विस्तार में ।
The authors have nothing to disclose.
हम फिल्म S3 के अधिग्रहण के लिए Manuela Weitkunat धंयवाद । हम उदार समर्थन के लिए रेइनहार्ड Fässler के आभारी हैं । यह काम EMBO यंग अंवेषक कार्यक्रम (F.S.), यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (एफ पी/2007-2013)/ERC अनुदान ३१०९३९ (F.S.), मैक्स प्लैंक सोसायटी (S.B.L., F.S.), के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था केंद्र नेशनल डे ला सूक्ष्म Scientifique (CNRS) (F.S.), द एक्सीलेंस इनिशिएटिव ऐक्स-मार्सैय यूनिवर्सिटी AMIDEX (F.S.), द LabEX-सूचित (F.S.) और द Boehringer Ingelheim शौकीन्स (S.B.L.) ।
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
fly food in bottles (or vials) | – | – | standard culture medium |
paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | – | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |