Drosophila भ्रूण में मनका मुक्त ऑप्टिकल चिमटी के साथ सेल यांत्रिकी की जांच
Summary
हम एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप करने के लिए युग्मित ऑप्टिकल चिमटी के एक सेटअप मौजूद है, और Drosophila भ्रूण में मोतियों के बिना सेल यांत्रिकी जांच करने के लिए इसके कार्यांवयन ।
Abstract
Morphogenesis आनुवंशिक पैटर्न और यांत्रिक बलों के बीच समंवय के लिए मजबूती से कोशिकाओं और ऊतकों को आकार की आवश्यकता है । इसलिए, एक चुनौती morphogenetic प्रक्रियाओं को समझने के लिए सीधे सेलुलर बलों और embryogenesis के दौरान vivo में यांत्रिक गुणों को मापने के लिए है । यहाँ, हम एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप करने के लिए मिलकर ऑप्टिकल चिमटी के एक सेटअप मौजूद है, जो सीधे सेल के जल्दी Drosophila भ्रूण के सेल संपर्कों पर बल लागू करने के लिए अनुमति देता है, जबकि प्रति सेकंड कई फ्रेम की गति से इमेजिंग. इस तकनीक का लाभ है कि यह भ्रूण में मोतियों की इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है, आमतौर पर मध्यवर्ती जांच जिस पर ऑप्टिकल बलों लागू कर रहे है के रूप में इस्तेमाल किया है । हम कदम के विस्तार से कदम सेटअप के कार्यांवयन, और उपकरणों का प्रस्ताव को प्रयोगों से यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए । वास्तविक समय में सेल-सेल संपर्कों के विस्थापन की निगरानी करके, एक तनाव माप प्रदर्शन और सेल संपर्क ‘ rheology की जांच कर सकते हैं ।
Introduction
भ्रूण विकास एक अत्यधिक reproducible प्रक्रिया है जिसके दौरान कोशिकाओं और ऊतकों को भविष्य के जानवर को आकार ख़राब है । इस तरह के विकृति कोशिका स्तर1,2पर बलों की सक्रिय पीढ़ी की आवश्यकता के लिए दिखाया गया है । morphogenetic प्रक्रियाओं को समझने के लिए जिसके दौरान कोशिकाओं और ऊतकों को अपने आकार बदलने के लिए, यह इसलिए शामिल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए कुंजी है, और प्रक्रिया के दौरान ऊतक के भीतर बलों को मापने के लिए3,4 . विशेष रूप से Drosophilaमें उपकला परतों, व्यापक रूप से उनके अर्ध 2d ज्यामिति के कारण और उनके आसान हेरफेर करने के लिए अध्ययन किया गया है.
तकनीक के एक नंबर इस प्रकार हमारे द्वारा विकसित किया गया है और दूसरों के विकास के दौरान vivo में उपकला यांत्रिकी का आकलन करने के लिए. हम उपकला ऊतकों में इस्तेमाल तीन मुख्य तकनीकों का एक त्वरित अवलोकन दे देंगे. लेजर पृथक, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि, सेल जंक्शनों पर स्थानीय यांत्रिक तनाव प्रकट करने के लिए अनुमति देता है5,6,7,8 या बड़े पैमाने पर9,10,11 स्थानीय कटौती है कि लक्ष्य की यांत्रिक अखंडता को बाधित प्रदर्शन करके । कटौती के बाद खोलने की गतिशीलता दोनों तनाव पूर्व पृथक पर जानकारी प्रदान करता है, और ऊतक के rheology पर12,13. लेजर पृथक की एक खामी यह है कि यह आक्रामक है, क्योंकि यह सेल प्रांतस्था के स्थानीय व्यवधान की आवश्यकता है । इसलिए, एक केवल ablations की एक सीमित संख्या में प्रदर्शन कर सकते है यदि एक ऊतक अखंडता को बचाना चाहता है । एक और खामी यह है कि ablations केवल सेल संपर्कों में तनाव के सापेक्ष अनुमान प्रदान करते हैं, क्योंकि खुलने का वेग चिपचिपा घर्षण पर निर्भर होता है, जो सामान्यतः ज्ञात नहीं होता है । चुंबकीय हेरफेर भी विकसित किया गया है और Drosophilaमें इस्तेमाल किया, या तो ferrofluids14 या ultramagnetic liposomes15के उपयोग को शामिल । वे निरपेक्ष माप16,17प्रदान कर सकते हैं, लेकिन इस अर्थ में भी आक्रामक है कि वे वांछित स्थान पर जांच के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है । इस प्रणाली है, जो हमेशा सटीक इंजेक्शन के लिए उत्तरदाई नहीं है पर निर्भर करता है बहुत मुश्किल हो सकता है । एक तीसरी तकनीक, पूरी तरह से गैर इनवेसिव, बल अनुमान है18,19,20। बल निष्कर्ष ट्रिपल अंक (tricellular जंक्शनों, या वर्टेक्स) में यांत्रिक संतुलन की धारणा पर निर्भर करता है, और सभी सेल में तनाव का अनुमान करने की अनुमति देता है सेल संपर्कों (और संभवतः, सभी कोशिकाओं में दबाव) एक व्युत्क्रम समस्या को हल करके । तनाव के लिए, प्रत्येक शीर्ष दो समीकरणों (एक्स और वाई) प्रदान करता है । इस पैदावार रैखिक समीकरणों की एक बड़ी प्रणाली है जो कुछ शर्तों के तहत औंधा किया जा सकता है सभी सेल संपर्कों में तनाव का आकलन । हालांकि यह विधि बहुत आकर्षक है, क्योंकि यह केवल एक विभाजित छवि और कोई अतिरिक्त प्रयोग या सेटअप की आवश्यकता है, इसकी सटीकता अभी तक निर्धारित करने के लिए है, और फिर यह केवल सापेक्ष मान प्रदान करता है, जब तक कि एक निरपेक्ष अंशांकन माप किया जाता है ।
इन सीमाओं में से कुछ को दूर करने के लिए, हम इस लेख ऑप्टिकल Drosophila melanogasterके भ्रूण उपकला में कोशिका पैमाने पर नियंत्रित बलों को लागू करने के लिए एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप करने के लिए मिलकर चिमटी का एक सेटअप में परिचय । ऑप्टिकल चिमटी एकल प्रोटीन पर माप और organelles और कोशिकाओं21के हेरफेर सहित कई जैविक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है । यहां, हम कुछ दर्जन pN है, जो छोटे अभी तक सेल संपर्कों के स्थानीय विकृतियों को प्रेरित और vivo मेंयांत्रिक माप प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है की सीमा में लागू बलों की रिपोर्ट । आमतौर पर, हम सेल संपर्कों के सीधा विक्षेपन का उपयोग करें, kymographs के विश्लेषण के माध्यम से निगरानी, विरूपण के लिए बल संबंधित है । महत्वपूर्ण बात, हमारे सेटअप के ऊतकों में वांछित स्थान पर मोतियों की इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है, के रूप में ऑप्टिकल चिमटी सीधे सेल सेल संपर्कों पर बलों को लागू करने में सक्षम हैं । एक हल्की चादर माइक्रोस्कोप करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी के युग्मन एक रैपिड इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है (प्रति सेकंड कई फ्रेम), जो कम समय तराजू पर एक यांत्रिक विश्लेषण के लिए बहुत प्रशंसनीय है, और कम phototoxicity के साथ, के रोशन के बाद से नमूना इमेजिंग22के विमान तक ही सीमित है ।
कुल मिलाकर, ऑप्टिकल चिमटी एक गैर इनवेसिव तरीका Drosophila भ्रूण में vivo में सेल संपर्कों पर नियंत्रण बलों को लागू कर रहे हैं, और इस तरह के सेल संपर्क23, rheological गुण में कठोरता और तनाव के रूप में यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए 24, और ढाल या तनाव के anisotropy23।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑप्टिकल चिमटी एक गैर इनवेसिव तरीके से विकासशील भ्रूण उपकला में सीधे पूर्ण यांत्रिक माप प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं । उस अर्थ में, यह ऐसे लेजर पृथक, जो आक्रामक है और रिश्तेदार माप, चुंबकीय बलों, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक FRM लैस ग्रांट FRM DEQ20130326509, Agence राष्ट्रीयकृत डे ला सभ्य ANR-ब्लैंक ग्रांट, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (टू पी.-F.L.) द्वारा समर्थित किया गया । हम फ्रांस-इमेजिंग फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (ANR-10-INBS-04-01, «भविष्य» के लिए निवेश) द्वारा समर्थित बुनियादी ढांचा स्वीकार करते हैं । हम तकनीकी सहायता के लिए PICSL-एफबीआई के बुनियादी ढांचे से ब्राईस Detailleur और क्लाउड Moretti का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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