Sondera Cell mekanik med pärla-fri optisk pincett i Drosophila embryot
Summary
Vi presenterar en inställning av optisk pincett kopplat till lätta blad Mikroskop, och dess genomförande sond cell mekanik utan pärlor i Drosophila embryot.
Abstract
Morfogenes kräver samordning mellan genetiska mallning och mekaniska krafter att kraftfullt forma celler och vävnader. En utmaning att förstå morphogenetic processer är därför att direkt mäta cellulära styrkor och mekaniska egenskaper i vivo under embryogenes. Här presenterar vi en installation av optisk pincett kopplat till lätta blad Mikroskop, vilket gör att direkt tillämpa styrkor på cell-cell kontakter tidigt Drosophila embryot, medan imaging med en hastighet av flera bildrutor per sekund. Denna teknik har fördelen att det inte kräver en injektion av pärlor i embryot, vanligtvis används som mellanliggande sonder som optiska styrkor utövas. Vi detalj steg genomförandet av installationen och föreslår verktyg för att extrahera mekanisk information från experimenten. Genom att övervaka förskjutningarna av cell-cell kontakter i realtid, du kan utföra spänning mätningar och undersöka cell kontakters reologi.
Introduction
Embryonal utveckling är en mycket reproducerbara process under vilken de celler och vävnader deformera för att forma framtida djuret. Sådana deformationer har visat sig kräva aktiva generering av krafter på cell nivå1,2. För att förstå morphogenetic processer under vilken celler och vävnader ändra sin form, är det därför nyckeln till bedöma de mekaniska egenskaperna hos cellerna som är involverade, och att mäta krafterna inom vävnaden under den process3,4 . Epitelial skikt, särskilt i Drosophila, har studerats allmänt på grund av deras quasi-2D-geometri och deras lätt manipulation.
Ett antal tekniker har således utvecklats av oss och andra att bedöma epitelial mekanik i vivo under utveckling. Vi kommer att ge en snabb överblick över de tre huvudsakliga tekniker som används i epitelial vävnad. Laser ablation, en allmänt använd metod, tillåter för att avslöja den lokala mekanisk stressen på cell korsningar5,6,7,8 eller större skala9,10,11 genom att utföra lokala nedskärningar som stör målet mekanisk integritet. Dynamiken i öppningen efter snittet ger information både på stress tidigare ablation, och reologi av vävnad12,13. En nackdel med laser ablation är att det är invasiv, eftersom det kräver lokala störningar av cell cortex. Därför kan man endast utföra ett begränsat antal ablationer om man vill bevara vävnad integritet. En annan nackdel är att ablationer endast ge relativ uppskattningar av spänningen på Cellkontakter, eftersom öppningen hastigheten är beroende av viskös friktion, som i allmänhet inte är känd. Magnetisk manipulation har också utvecklats och används i Drosophila, som omfattar antingen användningen av ferrofluids14 eller ultramagnetic liposomer15. De kan ge absoluta mätningar16,17, men är även invasiva i den meningen att de kräver injektion av sonder på önskad plats. Detta kan vara mycket svårt beroende på systemet, vilket inte alltid kan bli föremål för exakt injektioner. En tredje teknik, helt icke-invasiv, är kraft inferens18,19,20. Kraft inferens bygger på antagandet att mekaniska jämvikt på tredubbla poäng (tricellular korsningar eller hörn), och tillåter för att härleda spänningar på alla cell-cell kontakter (och eventuellt tryck i alla celler) av lösa ett inversa problem. För spänningar ger varje vertex två ekvationer (X och Y). Detta ger ett stort system av linjära ekvationer som kan inverteras under vissa förutsättningar att bedöma spänningen på alla Cellkontakter. Denna metod är mycket attraktiv, eftersom det endast krävs en segmenterad bild och ingen extra experiment eller setup, dess riktighet är ännu att bestämma medan igen det endast ger relativa värden, såvida inte en absolut kalibrering mätningen utförs.
För att övervinna några av dessa begränsningar, vi införa i denna artikel en inställning av optisk pincett kopplat till lätta blad Mikroskop gälla kontrollerade krafter i cell skala i embryonala epitelet i Drosophila melanogaster. Optisk pincett har använts för många biologiska applikationer inklusive mätningarna på enstaka proteiner och manipulation av organeller och celler21. Här rapporterar vi tillämpade styrkor i spänna av några dussin pN, vilket är små ännu tillräcklig för att framkalla lokala deformationer av cellkontakter och utföra mekaniska mått i vivo. Vi använder vanligtvis vinkelrätt omläggning av cellkontakter, övervakas genom analys av kymographs, för att relatera kraft till deformation. Ännu viktigare, kräver våra setup inte injektion av pärlor på önskad plats i vävnaden, som optisk pincett är kan direkt utöva krafter på cell-cell kontakter. Kopplingen av de optisk pincetten för att lätta blad Mikroskop gör att man kan utföra snabba imaging (flera bildrutor per sekund), vilket är mycket märkbar för en mekanisk analys på kort tidsskalor, och med minskad fototoxicitet, sedan belysning av den urvalet är begränsat med imaging22plan.
Övergripande, optisk pincett är ett icke-invasivt sätt att tillämpa kontrollerade krafter på Cellkontakter in vivo i Drosophila embryot och extrahera mekanisk information såsom stelhet och spänningar på cell kontakter23, reologiska egenskaper 24, och övertoning eller anisotropi spänning23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optisk pincett låt utför absoluta mekaniska mätningar direkt i utvecklingsländer embryonala epitelet i ett icke-invasivt sätt. I det avseendet presenterar den fördelar jämfört med andra metoder såsom laser ablation, som är invasiva och ger relativa mätningar, magnetiska krafter, som kräver injektioner, eller tvinga inferens, som bygger på starka antaganden och erbjuder också relativa mätningar.
Protokollet innehåller några kritiska steg. Först, som objektivet kan visa kromati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (till s.-F.L.). Vi erkänner Frankrike-BioImaging infrastruktur stöds av franska National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringar för framtiden»). Vi tackar Brice Detailleur och Claude Moretti från PICSL-FBI infrastrukturen för tekniskt bistånd.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
References
- Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
